轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系CHL-3A4可使硝苯吡啶的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)作用喪失

1、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系CHL-3A4可使硝苯吡啶的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)作用喪失關(guān)鍵詞：細(xì)胞色素P-450；硝苯地平；阿霉素中國病理生理雜志000501摘 要 目的：檢測本實驗室構(gòu)建的表達(dá)人細(xì)胞色素P450 3A4同功酶轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系CHL-3A4的硝苯吡啶氧化酶活性。方法：利用多藥耐藥細(xì)胞K562r的阿霉素(ADR)耐藥性可被硝苯吡啶逆轉(zhuǎn)，而硝苯吡啶又可特異地被CYP3A4代謝，觀察硝苯吡啶在CHL-3A4 S9混合物 (S9 mix) 中孵育前后的生物學(xué)活性變化來判斷CHL-3A4細(xì)胞的CYP3A4硝苯吡啶氧化酶活性。結(jié)果：K562r細(xì)胞在含有硝苯吡啶(NIF) (12.5 g.L-1)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，對阿霉

2、素的IC50值從不含NIF時的(6.470.60) mg.L-1降至(0.890.15) mg.L-1(P0.01)。K562r細(xì)胞在含有分別經(jīng)CHL-3A4、CHL細(xì)胞的S9組分和滅活的CHL-3A4細(xì)胞的S9組分預(yù)處理的NIF(12.5 g.L-1)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，阿霉素對其的IC50值分別為(6.100.50) mg.L-1、(0.320.09) mg.L-1和(0.320.04) mg.L-1。前者和后兩者相比P0.01。 結(jié)論：實驗室構(gòu)建的表達(dá)人細(xì)胞色素P450 3A4同功酶轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系CHL-3A4具有硝苯吡啶氧化酶活性，從而進(jìn)一步確證其表達(dá)產(chǎn)物為人CYP3A4同功酶。并為今后檢

3、測CYP同功酶活性提供了一種新的途徑。中分類號 Q754 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1000-4718(2000)05-0385-04Nifedipine induced reversal of multidrug resistance can be deteriorated by S9 mix prepared from the transgenic cell line CHL-3A4QIAN Yu-li, ZHU Ge-jian, YU Ying-nian(Department of Pathophysiology and Provincial Laboratory of Medical M

4、olecular Biology, Zhejiang Medical University, Hangzhou 310031, China)Abstract AIM：To demonstrate the expression of human cytochrome P450 3A4 isozyme in the transgenic cell line CHL-3A4 established in this laboratory. METHODS：Nifedipine (NIF) can induce the reversal of the drug resistance for adriam

5、ycin of multidrug resistant(MDR) cell K562r. The NIF is the specific substrate for CYP3A4. To determine the NIF oxidase activity of the transgenic CHL-3A4 cells by comparing the biological effect of NIF, which preincubated with or without CHL-3A4 S9 mix. RESULTS：When the multidrug resistance cell K5

6、62r was cultured in medium with NIF (12.5 g.L-1), a calcium channel blocker and specific substrate for CYP3A, its IC50 for adriamycin declined from(6.470.60) mg.L-1 to (0.890.15) mg.L-1. When cells were cultured in NIF(exactly the same concentration) pretreated with CHL-3A4 S9 mix , no reversal of M

7、DR was observed IC50 for adriamycin is (6.100.50) mg.L-1 while if NIF was pretreated with CHL S9 or inactivated CHL-3A4 S9 mix, its biological effect was not deteriorated IC50 for adriamycin is (0.320.09) and (0.320.04) mg.L-1, P0.01 respectively. CONCLUSION：The transgenic cell line CHL-3A4 establis

8、hed in this laboratory have NIF oxidase activity. A new route for detecting the activity of CYP isozyme has been found.MeSH Cytochrome P-450; Nifedipine; Doxorubicin轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系CHL-3A4系本實驗室建立的表達(dá)人細(xì)胞色素P450 3A4(CYP3A4)的CHL細(xì)胞系。所轉(zhuǎn)染的表達(dá)質(zhì)粒pREP9-3A4經(jīng)過酶切譜分析及插入片段的部分序列分析，證明插入片段為人CYP 3A4 cDNA。雙核微核試驗也證明此細(xì)胞系能代謝活化黃曲霉毒素B1

9、，環(huán)磷酰胺和雜色霉菌毒素1，證明其表達(dá)產(chǎn)物符合人CYP3A4同功酶特征。但上述底物皆非CYP3A同功酶的特異性底物。因此尚不能確定我室建立的細(xì)胞系確實表達(dá)了人細(xì)胞色素P450 3A(cytochrome P450 3A)同功酶。已證明鈣通道阻滯劑硝苯吡啶(nifedipine，NIF)為CYP3A的特異性底物，文獻(xiàn)中曾用高效液相色譜直接測定其代謝產(chǎn)物以檢測其酶活性2。本實驗設(shè)計了一種生物測定(bioassay)方法鑒定CHL-3A4 細(xì)胞是否確能代謝CYP3A的特異性底物硝苯吡啶，即利用多藥耐藥細(xì)胞K562r的阿霉素(adriamycin, ADR)耐藥性可被硝苯吡啶逆轉(zhuǎn)，而硝苯吡啶又可特異地

10、被CYP3A4代謝，觀察硝苯吡啶在CHL-3A4 S9混合物 (S9 mix) 中孵育前后的生物學(xué)活性變化來判斷CHL-3A4細(xì)胞的CYP3A4硝苯吡啶氧化酶活性。材 料 和 方 法一、細(xì)胞系K562為從紅白血病細(xì)胞建立的細(xì)胞系，K562r為多藥耐藥細(xì)胞系。 CHL細(xì)胞為本實驗室傳代，CHL-3A4細(xì)胞為本實驗室構(gòu)建的重組有pREP9-3A4質(zhì)粒的CHL細(xì)胞，重組質(zhì)粒見1。Fig 1 Map of pREP9-3A4 plasmid1 pREP9-3A4質(zhì)粒二、試劑與培養(yǎng)基ADR為汕頭明治醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)；NIF為美國Sigma 公司產(chǎn)品(NIF貯存液以DMSO溶解，濃度為10 mg*L-1，

11、-20 避光保存)；MEM培養(yǎng)基, RPMI-1640培養(yǎng)基,小牛血清, G418, 胰蛋白酶為Gibco公司產(chǎn)品; 牛血清白蛋白為華美公司產(chǎn)品；NADPH為Fluka公司產(chǎn)品。三、細(xì)胞藥敏試驗K562, K562r細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640 培養(yǎng)基，37 ，5% CO2取對數(shù)生長期細(xì)胞3104個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，其中K562為3個復(fù)孔，K562r為6個復(fù)孔，在每孔中加入ADR，使ADR終濃度分別為50，25，12.5，6.25，3.125，1.56，0.78 mg.L-1，對照組為0 mg.L-1,反應(yīng)總體積均為200 L， 37 ，5% CO2 培養(yǎng)72 h后，計數(shù)各孔活細(xì)胞，并

12、計算ADR的半數(shù)抑制濃度IC503。四、K562r細(xì)胞ADR耐藥的NIF逆轉(zhuǎn)試驗在上面所述的培養(yǎng)系統(tǒng)中再加入終濃度分別為500，100，50，25，12.5，6.25 g.L-1的NIF，對照組為0 g.L-1，每個濃度3個復(fù)孔，反應(yīng)總體積仍為200 L。培養(yǎng)72 h后,計數(shù)活細(xì)胞，計算ADR的IC50，并確定能明顯逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥性的最低NIF有效濃度。 在觀察經(jīng)S9代謝后的NIF是否影響其耐藥逆轉(zhuǎn)作用時，在上面所述的培養(yǎng)系統(tǒng)中分別加入經(jīng)CHL-3A4 S9, CHL S9, 及滅活CHL-3A4 S9作用過的NIF代謝產(chǎn)物10 L作耐藥逆轉(zhuǎn)試驗。五、細(xì)胞S9組分(S9)的制備和硝苯吡啶代謝反應(yīng)

13、體系按文獻(xiàn)4進(jìn)行。將在MEM培養(yǎng)基中呈匯合生長的CHL和CHL-3A4細(xì)胞以PBS洗滌兩次，刮下10瓶細(xì)胞用2 mL 0.15 mol.L-1 KCl混懸，在冰上用超聲波粉碎細(xì)胞5次，每次2 s，所得勻漿在4 以9 000g離心20 min，吸出上清液，按Lowry氏法5測定蛋白質(zhì)濃度，貯于-70 。滅活的S9 以S9在沸水浴中加熱15 min獲得。并將所有制備的S9的蛋白濃度調(diào)整為500 mg.L-1。根據(jù)本室改進(jìn)的方法6，反應(yīng)總體積為1 mL，含S9混合物KPB(pH 7.4)0.1 mol.L-1; NADPH 0.2 mmol.L-1; 0.4 mg牛血清白蛋白(BSA); S9 20

14、0 L及底物 NIF 0.25 mg.L-1, 置37 水浴30 min，過濾除菌。六、統(tǒng)計處理用t檢驗比較結(jié)果中兩組IC50均數(shù)間的差異, 用方差分析比較3組IC50均數(shù)間的差異。結(jié) 果一、NIF逆轉(zhuǎn)K562r的ADR耐藥性的最低有效濃度為12.5 g.L-1, 濃度大于12.5 g.L-1時均可逆轉(zhuǎn)，濃度小于6.25 g.L-1時逆轉(zhuǎn)不明顯，見2。 Fig 2 IC50 of ADR for K562r cells treated with different concentration NIF2 阿霉素(ADR)對經(jīng)不同濃度的硝苯吡啶(NIF)處理后的K562r細(xì)胞的半數(shù)致死量(IC50

15、)二、K562的ADR耐藥性和硝苯吡啶逆轉(zhuǎn)K562r的ADR耐藥性K562的ADR IC50為(8.493.16) g.L-1，K562r細(xì)胞的ADR IC50為(6.470.6) mg.L-1，加入12.5 g.L-1 NIF后K562r細(xì)胞的ADR IC50為(0.890.15) mg.L-1,前兩組之間相比P0.01，n=3。后兩組之間相比P0.01，n=3，(3)。 Fig 3 Deterioration of nifedipine induced reversal of ADR resistance in K562r cell by preincubation of NIF with

16、 CHL-3A4 S9 mixa) IC50 of ADR for K562r cells; b) IC50 of ADR for K562r cells treated with NIF(12.5 g.L-1) ; c, d, e) IC50 of ADR for K562r cells treated with NIF(12.5 g.L-1) which have been preincubated with CHL-3A4 S9, CHL S9 and inactivated CHL-3A4 S9 respectively*P0.01, vs group b； P0.01, vs gro

17、ups d and e3 CHL-3A4細(xì)胞S9混合物對硝苯吡啶逆轉(zhuǎn)K562r細(xì)胞阿霉素耐藥性的影響三、CHL-3A4細(xì)胞S9混合物使硝苯吡啶的生物效應(yīng)消失由CHL-3A4和CHL細(xì)胞分別制備的S9，其蛋白濃度分別為1 072.3和504.2 mg.L-1。 經(jīng)調(diào)整為500 mg.L-1后按以上描述的方法進(jìn)行本實驗。在CHL-3A4 S9；CHL S9；滅活CHL-3A4 S9作用后的NIF(NIF終濃度為12.5 g.L-1)耐藥性逆轉(zhuǎn)試驗中，K562r細(xì)胞的ADR IC50 分別為(6.100.50) mg.L-1, (0.320.09) mg.L-1, (0.320.04) mg.L-1

18、，前者與后兩者相比P0.01，n=3，差異非常顯著(3)。討 論細(xì)胞色素P450是一個超家族酶系，與人體內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的代謝有著密切關(guān)系。 它們對藥物代謝和前致癌物/致突變物的代謝活化作用尤為人們所關(guān)注。近年來已經(jīng)有許多的CYP-cDNA被克隆，本實驗室則致力于能代謝活化前致癌物/致突變物的人CYP基因的研究, 并已相繼克隆了人CYP1A1，2B6，3A4，1A2，2E1，2C9的cDNA。 有些已導(dǎo)入哺乳類細(xì)胞使之在其中長期穩(wěn)定地表達(dá)1,68。CYP同功酶的酶活性檢測一般直接測定特異性底物的代謝產(chǎn)物，本實驗室已成功地應(yīng)用6，7。這些方法一般都需要特殊儀器如高效液相色譜，熒光分光光度計等，

19、并需有純品代謝產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)品。本實驗根據(jù)NIF的生物學(xué)作用設(shè)計了通過酶的底物代謝前后的生物學(xué)活性改變以判斷CYP3A4 同功酶的酶活性，簡便易行。從實驗結(jié)果可見K562r細(xì)胞的耐藥性可被濃度為12.5 g.L-1的NIF逆轉(zhuǎn)，而NIF經(jīng)CHL-3A4 S9孵育后，其逆轉(zhuǎn)耐藥性的功能喪失，這與NIF經(jīng)人體代謝后失去藥理學(xué)功能一致。而NIF與CHL S9, 滅活CHL-3A4 S9 孵育后仍具有逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性功能， 確證轉(zhuǎn)染了人CYP3A4cDNA表達(dá)質(zhì)粒后的CHL細(xì)胞所表達(dá)的CYP確能代謝NIF，從而進(jìn)一步確證其表達(dá)產(chǎn)物為人CYP3A4同功酶。并為今后檢測CYP同功酶活性提供了一種新的途徑。(致

20、謝：感謝瞿立輝，陳巧芳同志在本實驗方法建立過程中提供有益經(jīng)驗)基金項目 國家自然科學(xué)基金(No 39670801)和省自然科學(xué)基金資助(396467)參 考 文 獻(xiàn)1 陳巧芳, 吳健敏, 余應(yīng)年. 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系CHL-3A4的建立及其代謝活化作用J. 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志， 1998, 32(5): 281284.2 Gonzalez FJ, Schmid BJ, Umeno M, et al. Human P450PCN1: Sequence, chromosome localization, and direct evidence through cDNA expression that P450PCN1 is nifedipine oxidaseJ. DNA