多糖類物質(zhì)的研究進展_劉銳(精)

1、多糖類物質(zhì)的研究進展劉銳（仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學院食品系,廣東廣州510225摘要闡述了多糖類物質(zhì)的分離純化、結(jié)構(gòu)分析、生物活性及研究方向。關(guān)鍵詞多糖；分離純化；結(jié)構(gòu)分析；生物活性中圖分類號Q539文獻標識碼A 文章編號 0517-6611(200509-1722-041多糖的研究概況多糖是除了蛋白質(zhì)和核酸以外的一類重要的生物大分子，雖然糖類的研究并不比蛋白質(zhì)和核酸晚，但其研究層次 與水平還遠遠落后于蛋白質(zhì)和核酸。20世紀70年代以來，隨著免疫物質(zhì)、生物膜及多種生物活性物質(zhì)的研究表明，糖類在生物 體內(nèi)具有各種關(guān)鍵的生物學功能，因此糖類的研究 成為人們關(guān)注的焦點。大量的 藥理實驗表明，多糖類化合物具有免

2、疫增強與調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗凝 血、抗放射、抗衰老等作用。日本自20世紀80年代以來，已有數(shù)種多糖應用 于臨床。近年來，日本及歐美學者引進現(xiàn)代分子生物學技術(shù) 手段，加強對中藥多 糖活性決定簇等化學結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的 研究，并在柴胡、當歸等中藥的研究方面 有了一定的突破。國內(nèi)的研究起步較晚，雖然已在云芝糖肽、銀耳多糖等的研究 中取得了一定的進展，但對藥用多糖的研究仍多偏重于提取、分離、精制、化 學組成等方面，大多數(shù)品種尚處于實驗階 段或僅用于滋補品和飲料，與國外相比仍 有一定的差距。2 多糖的分離純化與性質(zhì)研究2. 1多糖的提取從不同的材料中提取多糖，一般都先用有機溶劑如丙 酮、乙醚、乙醇、甲

3、醇或1 : 1的乙醇乙醚混合液 脫脂。多糖可用水、0.11mol /L氫氧化鈉或氫氧化鉀堿性 水溶液、氯化鈉溶液、1%醋酸、1%苯酚等作為提取溶劑，但同一原料用不同試劑提取得到的多糖成分常常是不同的1 0提取中要防止降解，用稀酸提取時時間宜短，溫度最好不高 于5C,用稀堿提取時，為 防止降解，常通以氮氣或加入硼氫 化鈉（鉀2,稀酸稀堿提取后溶液應迅速中和。多糖提取液大多較粘稠，可進行吸濾或用離心法將不溶 性雜質(zhì)除去，提取液經(jīng)濃縮后，加入25倍乙醇或甲醇沉淀 多糖，也可加入斐林試劑、硫酸銨或溴化十 六烷基三甲胺等 使多糖生成沉淀。然后依次用乙醇、丙酮、乙醚洗滌，將吸干 后疏松的多糖迅速轉(zhuǎn)入裝有五

4、氧化二磷 / 氫氧化鈉的真空干燥器中減壓干燥。若 沉淀的多糖為膠狀或具粘著性時可直接冷凍干燥。干燥后的粉末狀粗多糖。除了以上的常規(guī)提取方法外，近年來酶法、超聲波法在 多糖提取中的應用也 得到了廣泛的關(guān)注35 02. 2多糖的分級(1分部沉淀法。根據(jù)不同多糖在不同濃度的低級醇、酮中具有不同溶解度 的性質(zhì)，由小到大按比例加入甲醇、乙醇或丙酮等進行分部沉淀。此法適宜于分離各種溶解度相差較大的多糖。作者簡介科研工作。劑有氯化鈉、劉銳(1975-,男,河北衡水人,助教,從事食品發(fā)酵方 面的教學與(2鹽析法。不同多糖在不同鹽濃度中溶解度不同，常用的鹽析氯化鉀、硫酸銨等,以硫酸銨最佳。此法實際上是分部沉淀的

5、一(3金屬絡(luò)合物法。多糖能與銅、鋇、鈣、鉛離子形成絡(luò)合物沉淀。常用 的絡(luò)合劑有斐林試劑6、氯化銅、氫氧化鋇和醋酸鉛等。得到的絡(luò)合物沉淀用5%無機酸乙醇溶液或硫化氫分解。(4季胺鹽沉淀法。根據(jù)季胺鹽能與酸性多糖形成不溶性化合物的特點，以分 離酸性多糖。常用的季銨鹽有十六烷 基三甲基溴化銨(CT AB和十六烷基吡啶 (CP C。一般地說，酸性強或分子量大的多糖首先沉淀出來，所以控制季銨鹽的 濃 度，能分離各種不同的酸性多糖。根據(jù)形成的沉淀能溶于不同鹽、酸溶液和有機 溶劑中的性質(zhì),將多糖游離出來。(5離子交換柱層析法。常用交換劑為DE AE - 纖維素、ECTEOL A -纖維素和羧甲基纖維素。此法

6、適合于分離各種 酸性、中 性及粘多糖。pH =6時，酸性多糖吸附于交換劑上，中性多糖不吸附，然后用不同離子強度的緩沖液按酸性強弱將各種多糖依次洗脫。洗脫方式可以是階梯式或梯中性多糖還能與硼砂形成絡(luò)合物，若 不同中性多糖洗脫下來。另外，雜質(zhì)會吸附于柱上端而達到 部分純化的目的。多糖在柱上的吸附力與其結(jié)構(gòu)有關(guān)吸附力一般隨分子中酸性基團的增加而增大。對于線性分子，分子量大的比小的度式。若P H為堿性，中性多糖也能吸附。 將柱處理成硼砂型后，改變硼砂液濃度也能將易吸附，直鏈多糖比分枝多糖易吸附。（6凝膠柱層析。根據(jù)多糖分子大小和形狀 的不同實現(xiàn) 分離。常用的凝膠有葡聚糖凝膠（Sephade x , S

7、ephacr y及瓊脂 糖凝膠（Sephe roseo也有人用DEAE -Se pha dex分離多糖。（7制備性區(qū)域電泳。不同的多糖在電場作用下按其分 子大小、形狀及所帶電荷的不同而達到分離。（8超濾7。不同的超過濾膜排阻不同分子量和形狀的多糖通過，因而達到分（9親和層析。如涂有聚芳香化合物的載體對分離某些多糖很有價值。陳西廣等8根據(jù)多糖與抗血清能產(chǎn)生選擇 性沉淀的特性，用伴刀豆蛋白（Con A與 Sepharo se 4B乍載體分離純化了甘露巖藻半乳聚糖。（10制備性高壓液相色譜（HPLC 0 HP LC是在經(jīng)典柱層 析原理的基礎(chǔ)上,采 用分布窄、粒徑細的顆粒作載體，將流動 相以高壓注入柱

8、內(nèi)，樣品組分迅速而不斷地在流動相和固定 相之間進行反復多次平衡分配，彼此分離，并向下遷移，遷移 速率依賴于各組分與固定相之間的相對親和力。2. 3多糖純度的鑒定多糖純度不能用通常的標準衡量，。安徽農(nóng)業(yè)科學，Journal of Anh ui Agri . Sci . 2005, 33(9 :1722-1725責任編輯朱永和 責任校 對 朱永和D0I :10. 13989/j . cn ki . 0517-6611.2005. 09. 085代表某一多糖相似鏈長的平均分布。通常所說的多糖純品實質(zhì)上是一定分子 量范圍的均一組分。純度鑒定方法有：（1超離心法9 0微粒在離心力場中沉降速度與微粒的密度

9、、大小與形狀有關(guān)。如果某一多糖在離心力場作用下形成單一區(qū)帶，說明微粒具有相同沉降速度，其分子密度、大小和形狀相似。(2高壓電泳法10。多糖在電場作用下，按其形狀、大小及其所帶電荷的不 同而移動不同的距離。中性多糖雖然不 帶電荷，但它的分子中若有順式的鄰二醇就能與硼砂形成 復合物而帶電荷，不同多糖的位阻因素決定了多糖與硼砂形 成不同的復合物，所以在電場作用下的相對遷移率不同 。(3比旋光度法。不同的多糖 具有不同的比旋光度，它們在不同濃度的乙醇中具有不同溶解度，所以，如多糖水溶液經(jīng)不同濃度的乙醇所得沉淀物具有相同的比旋光度，則證明該多糖為均一成(4凝膠柱層析11。多糖經(jīng)凝膠色譜柱洗脫若只有一個對

10、稱的峰，則表明該多糖為均一成分。(5高效液相色譜12。HPL C測定多糖純度具有速度快 性好等優(yōu)點。目前最常用的商品柱是 祐Bo nda gel柱系列和、分辨率高和重現(xiàn)T SK柱系列。2. 4多糖分子量測定常用的多糖分子量測定方法有:滲透法、超離心法、咼壓電泳法、粘度法、超過濾法、還原末端法、聚合度法、光散射法等。隨著耐壓合成凝膠的出現(xiàn)，高效液相色譜廣泛應用于多糖的純度和分子量測定上13。根據(jù)糖的種類可以采用不同的分離方法，如反相色譜、常規(guī)氨基烷柱 液相色譜、高效離子交換色譜、凝膠滲透色譜、多胺修飾的硅膠色譜、毛細管色譜等。實驗室中最常用的是凝膠過濾 法，它根據(jù)在凝膠柱上不同分子量的多糖與洗脫

11、體積成一定 關(guān)系的特性，用已知分子量的Dextra n系列標準葡聚糖制作標準曲線，由樣品的洗脫體積從曲線上求得分子量 。3多糖的結(jié)構(gòu)分析3. 1多糖結(jié)構(gòu)分析的化學方法(1高碘酸氧化14。高碘酸可以選擇性地斷裂糖分子中連二羥基或連三羥基，生成相應的多糖醛、甲醛或甲酸。反應定量進行，每開裂一個C -C鍵消耗一分子高碘酸。通過測定高碘酸消耗量及甲酸的釋放量，可以判斷糖苷鍵的位 置、 直鏈多糖的聚合度、支鏈多糖的分支數(shù)目等。(2 Smith降解15。是將高碘酸氧化產(chǎn)物還原后進行部 分酸水解。由于糖基 之間以不同的位置縮合，用高碘酸氧化 后則生成不同的產(chǎn)物。將氧化產(chǎn)物用硼氫 化合物還原成穩(wěn)定的多羥基化合

12、物，經(jīng)酸水解后用紙色譜或氣相色譜鑒定水解產(chǎn) 物，由降解的產(chǎn)物可以推斷糖苷鍵的位置 。(3甲基化反應16。先將多糖中的各種單糖殘基中的游離羥基全部甲基化，進而將多糖中的糖苷鍵水解，水解后得到的化合物的羥基所在位置即為原來單糖殘基的連接點。同時根據(jù)不同甲基化單糖的比例可以推測出這種連接鍵型在多糖重復結(jié)構(gòu)中的比例。3. 2多糖結(jié)構(gòu)的儀器分析方法糖或單糖甙，然后米用二氟乙?；⒍?,即可進樣分析17, 18。高效液相色譜近 ，該方法不需衍生化可直 接進樣，操作簡(1色譜分析法。氣相色譜法作為常規(guī)的糖類分析方法。，的靈敏度可進年來也廣泛應用于單糖與低聚糖的分析提高。多糖可通過酸水解或甲醇解成單 基硅烷

13、化、糖醇乙?；确椒ㄑ苌?而且有較高分辨率等優(yōu)點19。(2電泳法。毛細管電泳法與HPL C相比，基柱效更高、速度更快，樣品用量 僅為HP LC的1%。多糖的酸水解物經(jīng) 衍生化后，以硼砂溶液為緩沖液，各種單糖 組分均能被檢出，尤其是在HPL C上不易分開的葡萄糖和甘露糖在毛細管電泳 中 能得到較好的分離20, 21。Go ube t等22還報道了采用熒光 基團衍生化糖的還 原末端和寡糖，并利用聚丙烯酰胺電泳研究多糖的單糖組成及結(jié)構(gòu)的快速定量方 法,檢測限可達到500fmol的單糖和100fmol的寡糖。(3紅外光譜23。紅外光譜圖中的每一個吸收峰都相應 于分子中原子或官能 團振動的情況，利用

14、紅外光譜可以鑒定 多糖的結(jié)構(gòu)。例如，吡喃糖的a和伕的端 基差向異構(gòu)體,是由端基的C -H變角振動造成的。a型的差向異構(gòu)體的C -H取平伏鍵,在（844 ±c m -1處有一個吸收峰；徵的差向異構(gòu) 體的C -H取直立鍵,在 （891 ± c m -1處有一個吸收峰。在多糖分子中若存在甘露糖苷,則一定有810及870c m -1的特征吸收峰。（4核磁共振24。 1H NMR主要解決多糖結(jié)構(gòu)中糖苷鍵構(gòu) 型問題；13C NMR 的化學位移較1H NMR為廣，分辨率高，不但能確定各種碳的位置，而且還能區(qū)別分子的構(gòu)型和構(gòu)象，特別是帶有微型計算機的脈沖傅立葉轉(zhuǎn)換方法在 13C NMR上的

15、應用，使得13C天然豐度很低的糖能得到清晰的光譜。（5質(zhì)譜。早期的質(zhì)譜主要局限于電子解離 法（EI -MS ,不適用于糖類這種極性強，難揮發(fā)高溫下易分解 的物質(zhì)。近年發(fā)展起來多種不需加熱氣化的軟電離技術(shù)，其中應用最廣泛的是快原子轟擊法（F AB。FAB法對于熱不穩(wěn)定或難揮發(fā)化合物能給出強的準分子離子 便于測定其分子量。同時糖的F AB譜中，強度大的碎片離子往往是糖鏈斷裂后的各殘基離子，據(jù)此可進行序列分析。由于上述優(yōu)點，F(xiàn)AB法在糖的研究中得到廣 泛應用25, 26。（6 X射線衍射27。絕大多數(shù)多糖均不能形成單晶，不適用于常規(guī)X -射線單 晶衍射。而X -射線衍射的另一方式纖維衍射則在這方面展

16、示了越來越大的應用空間，再加上立體 化學方面的信息包括鍵角、鍵長、構(gòu)型角和計算機模擬，就可 以準確的確定多糖的構(gòu)型。盡管研究多糖的立體構(gòu)型有多種方法如電子衍射、 旋光測定、核磁共振等，但X -射線纖維衍 射與計算機模擬技術(shù)相結(jié)合仍不失為 當前確定多糖立體構(gòu)型最為有力的工具。4 多糖的生物活性4. 1多糖的免疫調(diào)節(jié)作用多糖對機體具有雙向調(diào)節(jié)作 用，適當濃度的多糖不僅能提高機體的特異性免疫功能，而且能增強機體的非特異性免疫功能28,29。4. 1. 1多糖對巨噬細胞的激活作用。巨噬細胞是體內(nèi)非常 重要的免疫細胞，在抗感染免疫和抗腫瘤免疫等方面都起重要的作用。但是，未活化的巨噬細胞的吞噬殺傷作用有限

17、，。大172333卷9期劉銳多糖類物質(zhì)的研究進展量實驗表明，海帶多糖、玉米花粉多糖、云芝多糖、黃芪多糖、枸杞多 糖、牛膝多糖、香菇多糖等可激活巨噬細胞，增強其吞 噬作用，能誘導產(chǎn)生IL - 1, TN F -d等細胞因子30-36。4. 1.2多糖對T、B淋巴細胞的激活作用。多糖化合物特別 是從高等植物 中提取的多糖，可部分恢復并加強癌癥和艾滋病等患者的免疫功能。如白術(shù)多糖 能明顯提高外周血T淋巴細胞AN AE染色率,說明其能促進淋巴細胞向成熟 T淋巴細胞轉(zhuǎn)化，提高小鼠細胞免疫功能37。當歸多糖能直接激 活B細胞并對輔助 性T細胞的功能具有間接激活作用38。香菇多糖是一個典型的T淋巴細胞激活

18、劑。它在體內(nèi)和體外均能促進特異性細胞毒T淋巴細胞的產(chǎn)生，并提高其殺傷活 性。香菇多糖在體內(nèi)還能提高輔助性 T細胞的功能，提高抗體依賴的細胞毒細胞活性39。4. 1.3 多糖對遲發(fā)型超敏反應（DT H的作用。L AC A種小鼠 連續(xù)15d經(jīng) 口給予蟲草多糖后在6. 85mg /kg劑量下可增強 小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應40。4. 1.5多糖對天然殺傷細胞的影響。人外周血單核細胞在香菇多糖作用下促進NK細胞產(chǎn)生，增強細胞毒作用41。4. 1.6 多糖對LA K細胞活性影響。 近年來用L AK/IL-2療法治療腫瘤在臨床上取得了明顯療效,但該療法需要大量IL -2和L AK細胞,而IL -2的毒性及價格昂

19、貴限制了它的使 用。用增強L AK活 性、降低IL -2用量而本身無毒性的生物 反應修飾劑是改進該療法的重要措施。研究表明,豬苓多糖 與rIL -2有協(xié)同作用,可使內(nèi)源性L AK活性顯著提高42。 靈芝多糖能明顯增強人臍血LA K細胞活性,并能協(xié)同rI L -2提高人臍血L AK細胞表面IL -2受體的表達43。4. 2多糖的多種藥效作用。Ge resh等4. 2. 1多糖的抗腫瘤作用。動物實驗及臨床觀察表明，從細菌、真菌、 酵母、地衣和高等植物中提取的多種多糖均具有抗腫瘤活性，表現(xiàn)在抑制腫瘤生 長、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、延長生命存活期、提高宿主的免疫系統(tǒng)功能等4447。 其中香菇多糖、裂裥多糖、豬苓

20、多糖和云芝糖肽等已進入臨床應用 發(fā)現(xiàn)硫酸化紅藻多糖在200mg /ml濃度下對T細胞淋巴瘤 的抑制率可達到80%以 上48。某些多糖還能對抗化學劑（如三甲基膽蒽 的致癌作用49。多糖作為抗 癌劑的最大優(yōu)點是毒副作用少，與化療聯(lián)合應用有協(xié)同作用，還可以對抗化療藥的 骨髓抑制等不良反應。4. 2. 2 抗感染、抗病毒作用。某些多糖通過增強宿主免疫機制可以抵抗細菌、病毒和寄生蟲的侵襲。據(jù)報道，香菇多糖可用于治療結(jié)核桿菌感染，患病超 過十年且產(chǎn)生了耐藥性的肺結(jié)核病人用香菇多糖治療一段時間后，病人痰菌轉(zhuǎn)為陰 性，嗜中性粒細胞吞噬活性增加。香菇多糖對泡狀口角炎病 毒感染引起的 小鼠腦 炎有顯著治療 和預防

21、作用，治療組100%存活，而對照組全部死亡。香菇多糖對 阿伯爾氏病毒 和十二型腺病毒感染也有效，其抗病毒作用與它誘生IF N和提高NK活性有關(guān)。Ma rina等發(fā)現(xiàn)紅藻多糖能顯著抑制逆轉(zhuǎn) 錄酶病毒的產(chǎn)生50。L ee等報道了從Antrodia c amphorata 5種 不同菌株的菌絲體中提取的中性多糖均具 有抗乙肝病毒作 用,其中來自B86菌株的多糖在濃度為50mg /L時抗乙肝病,1U /ml -LFN ,沒有細胞毒性作用51。4. 2. 3抗缺氧、抗損傷作用。丫 . N . 丫 e等研究表明當歸多糖 能顯著促進 正常胃上皮細胞的移動與增殖，具有促進胃粘膜 損傷修復與潰瘍修復作用52。

22、實驗表明,從C uscuta c hine nsis種子中提取酸性多糖CS -A -3 B不僅對淋巴細胞增 殖與抗體產(chǎn)生具有刺激作用，而且對過氧化氫誘導的細胞損傷具有保護作用53。許燕萍等研究了麥冬多糖對腦缺血損傷的抗缺氧作用，結(jié)果表明麥冬多糖可使缺血期間腦內(nèi)乳酸含量下降，從而可逆轉(zhuǎn)缺血后酸中毒造成的各種損害54。4. 2. 4 抗衰老作用。白花蛇舌草多糖、半枝蓮多糖通過提高SOD活力和 對負氧自由基的清除作用及抗脂質(zhì)過氧化作 用等起到抗衰老作用55。王建華等 用衰老模型小鼠和老年 小鼠等研究了枸杞多糖（L BP及其產(chǎn)品口含片的延緩衰老作用,實驗表明灌喂LB P能提高D -半乳糖所致衰老小鼠體

23、內(nèi)GS H -Px和SOD活性，從而可以清除過量的自由基，降低MDA和脂褐素含量，起到延緩衰老的作 用56。由實驗還可知LBP在體外可直接清除羥自由基,并能抑制自發(fā)或由羥自 由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應。4. 2. 5降血糖作用。實驗證明，桑葉多糖對糖尿病小鼠糖 代謝有調(diào)整作用， 并可促進正常大鼠胰島素的分泌。張擁軍等以四氧嘧啶型糖尿病小鼠的降血糖效 果作為活性鑒定的 指標，逐步分離純化，證明了南瓜中具有降血糖作用的活性 組分 是大分子的多糖類物質(zhì)57。另外，人參多糖、靈芝多糖、白術(shù)多糖、紫草多 糖、山藥多糖、薏苡仁多糖、稻糠多糖、麻黃多糖等均具有降血糖作用。4. 2. 6 抗炎癥作用。Ma ts

24、ui等報道了紅藻硫酸多糖能抑制 人皮膚紅斑的產(chǎn) 生，體外實驗表明多糖主要抑制多形核白細胞向化學引誘物分子的遷移并能部分阻 斷多形核白細胞與內(nèi)皮細胞的粘附作用58。4. 2. 7 抗凝血作用。丫00 n等從Pora na v olubilis中提取平均 分子量為10kD a ,主要組成為半乳糖、半乳糖醛酸和甘露糖的不含硫酸酯的多糖抗凝血劑，在肝素輔因子II介導下能增 強凝血酶抑制作用59。5多糖類物質(zhì)的研究方向近20年來，國內(nèi)外各類多糖物質(zhì)不斷進入臨床，主要集中在抗感染、抗腫 瘤、抗風濕、抗消化道潰瘍和增進免疫功能等方面。其報道的臨床藥理和適應 征各有異同，多糖的基本 結(jié)構(gòu)也各有異同，但大多數(shù)研

25、究是基于體內(nèi)外病理模型的 藥效學實驗，而缺乏其糖鏈的基本結(jié)構(gòu)、體內(nèi)代謝以及體內(nèi)相 應配體作用機理的 研究。因此每種多糖物質(zhì)的多向藥效作 用過于籠統(tǒng)，藥理機理與結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)研究尚 在發(fā)展。目前多糖物質(zhì)的進展有兩方面：一是根據(jù)多糖本身在消化道藥理與藥代動力學 原理，發(fā)展新型的降血脂、抗脂肪肝、抗高血糖、促進免疫功能等的治療研 究。二是依據(jù)多糖分子結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)而闡明的生物學現(xiàn)象，合成與模擬體內(nèi)多糖分子或相應配體，或比天然多糖分子更有效的衍生物或類似物用于疾病治療。國外基于先進的基礎(chǔ)研究大力發(fā)展此類物質(zhì)，在抗炎癥、抗腫瘤與抗病毒感染等方面已取得較大進展。參考文獻1 S hid a M . Th e p re

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