梗阻性黃疸大鼠中性粒細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

1、梗阻性黃疸大鼠中性粒細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究 作者：高海斌 陳斌 倪勇 鄧雪松 王成友 張敏杰【摘要】 目的：探討梗阻性黃疸大鼠外周血中性粒細(xì)胞凋亡的改變。方法：將 66 只成年 Wistar 大鼠隨機(jī)分為正常（A） 組、假手術(shù)（B）組和膽總管結(jié)扎（CBDL, C）組，B、C 組術(shù)后又分為 1、3、7、10、14 d 5 個(gè)時(shí)相點(diǎn)；應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)中性粒細(xì)胞（PMN）的凋亡指數(shù)（AI），通過(guò) ELISA 雙抗體夾心法測(cè)定血清 IL-8。結(jié)果：C 組大鼠術(shù)后各時(shí)相點(diǎn) PMN的 AI 顯著降低，與 A 組和 B 組均有顯著差異（P 0.05）；C 組大鼠術(shù)后各時(shí)相點(diǎn)血清 IL-8 水平顯著升高，與 A

2、 組和 B 組均有顯著差異（P 0.05）；且血清 IL-8 水平與 PMN 的 AI 的改變有顯著負(fù)相關(guān)性。結(jié)論：梗阻性黃疸大鼠外周血 PMN 的 AI 明顯降低，且與 IL-8 水平異常升高有關(guān)，在梗阻性黃疸過(guò)度炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展中有著重要意義。 【關(guān)鍵詞】 膽道梗阻；中性粒細(xì)胞；凋亡；細(xì)胞因子；IL-8 AbstractObjective To investigate the changes of apoptosis of peripheral polymorphonuclear neutrophil(PMN) in the rats with obstructive jaundice

3、. Methods 66 Wistar adult rats were randomly divided into three groups: normal group (group A), sham operation group (group B) and common bile duct ligation group (CBDL, group C), and each group were randomly divided to subgroups of day 1, 3, 7, 10, 14 again. The flow cytometry was used to detect an

4、d evaluate the change of apoptosis in vitro after PMN were harvested from the rats. IL-8 was detected ELISA method. Results Apoptosis index (AI) of PMN in group C was lower than in groups A and B at 1, 3, 7, 10, 14 days after CBDL; The level of IL-8 in serum in group C was higher than in groups A an

5、d B at 1, 3, 7, 10, 14 days after CBDL. Moreover, there was a marked negative correlation between AI and level of IL-8. Conclusion The apoptotic PMN is decreased, which is intimately associated with the level of IL-8, which may induce excessive inflammation, and play a crucial role in the initiation

6、 and development of obstructive jaundice. Key Words Obstructive jaundice; Polymorphonuclear neutrophil; Apoptosis; Cytokine; IL-8 中性粒細(xì)胞（Polymorphonuclear neutrophil, PMN）是機(jī)體非特異防御反應(yīng)的重要執(zhí)行者，在炎癥反應(yīng)中扮演重要角色，在有效地發(fā)揮防御功能，避免炎癥的加強(qiáng)、擴(kuò)散和遷移的方面具有重要作用1。我們之前的研究表明，梗阻性黃疸大鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力異常，不能及時(shí)清除凋亡的 PMN，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能障礙，但有關(guān) PMN 凋亡

7、功能改變的研究卻鮮有報(bào)道。為此，在此基礎(chǔ)上，我們應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠梗阻性黃疸后外周血 PMN 凋亡的改變并試探討其意義及發(fā)生機(jī)制。 1 材料與方法 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制備 健康成年 Wistar 大鼠 66 只（第一軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心），雌雄各半，體重 220280 g，隨機(jī)分為 3 組：正常對(duì)照（A）組（n = 6），定為 0 時(shí)相；假手術(shù)對(duì)照（B）組（n = 30），分術(shù)后 1、3、7、10、14 d 5 個(gè)時(shí)相點(diǎn)，每個(gè)時(shí)相點(diǎn) 6 只；膽總管結(jié)扎（C）組（CBDL，n = 30），分為術(shù)后 1、3、7、10、14 d 5 個(gè)時(shí)相點(diǎn)，每個(gè)時(shí)相點(diǎn) 6 只。 CBDL 模型制備：乙醚吸

8、入麻醉，上腹正中切口進(jìn)腹，近十二指腸雙重結(jié)扎膽總管，并于兩結(jié)扎線(xiàn)之間切斷。B 組除不結(jié)扎和切斷膽總管外，其余同上；A 組不作任何處理。術(shù)后實(shí)驗(yàn)大鼠自由飲水進(jìn)食，于術(shù)后相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)處死。 1.2 主要試劑與儀器 流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter 公司 XL 型），Annexin-V-FITC 試劑盒購(gòu)于 Bender 公司，RPMI 1640 培養(yǎng)基購(gòu)于 Gibco 生物技術(shù)公司，中性粒細(xì)胞分離液購(gòu)于上海華精生物科技有限公司。 1.3 中性粒細(xì)胞的分離與純化 取肝素抗凝靜脈血樣，于室溫下靜置 1 h 或離心 2 000 r/min、15 min，然后吸取富含白細(xì)胞的“白膜層”。然后應(yīng)用

9、Ficoll （聚蔗糖）- Hypaque（泛影葡胺）密度梯度離心法 行中性粒細(xì)胞的分離與純化，最后臺(tái)盼藍(lán)染色法檢查 PMN 活力 98%，瑞氏染色法檢查 PMN 純度 95%。 1.4 PMN 凋亡指數(shù)檢測(cè) 取純化 PMN，調(diào)整細(xì)胞濃度為 1106/mL，加入 5 L Annexin-V 和 10 L 碘化丙錠（PI），室溫避光 15 min。然后加入0.4 mL 1Binding 緩沖液上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。采用Annexin-V 和 PI 雙標(biāo)法，雙通道檢測(cè) 5 000 個(gè)細(xì)胞，激發(fā)光波長(zhǎng) 488 nm，發(fā)射光波長(zhǎng) 515、560 nm。Annexin-V + / PI - 的為凋亡細(xì)胞，A

10、nnexin-V + / PI + 的為壞死細(xì)胞，Annexin2V - / PI - 的為活細(xì)胞，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞占的百分比作為凋亡指數(shù)。 1.5 血清 IL-8 檢測(cè) 嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品得出的 A（OD）值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算出樣本中 IL-8 的濃度。 1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以 xs 表達(dá)，采用方差分析；t 檢驗(yàn)；直線(xiàn)相關(guān)分析。 2 結(jié) 果 2.1 外周血 WBC 及 PMN 的數(shù)量變化 隨著膽道梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)，C 組外周血 WBC 數(shù)目不斷增加，且以 PMN 升高為主，呈明顯的時(shí)間依賴(lài)性改變。B 組 WBC 和 PMN 在術(shù)后變化不大。C 組各時(shí)相點(diǎn) WBC 和 P

11、MN 均明顯高于 A 組及 B 組相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)。 2.2 外周血 PMN 的凋亡指數(shù)和血清 IL-8 水平 見(jiàn)表 1 和表 2。C 組中各時(shí)相的凋亡指數(shù)與 B 組同一時(shí)相點(diǎn)和 A 組相比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為 P 0.05）。C 組血清 IL-8 各時(shí)相水平與 B 組同一時(shí)相點(diǎn)和 A 組相比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 0.05）。 2.3 相關(guān)性分析 通過(guò)對(duì) C 組血清 IL-8 水平與 PMN 的凋亡指數(shù)進(jìn)行相關(guān)分析（r = -0.909，P 0.0001），表明 IL-8 水平與凋亡率存在顯著負(fù)相關(guān)性。 3 討 論 PMN 作為機(jī)體非特異防御反應(yīng)的重要執(zhí)行者，它以凋亡的方式死亡，并被巨噬細(xì)

12、胞識(shí)別、吞噬而清除，對(duì)維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和促使已發(fā)生炎癥的局限及消退具有重要意義1。因此，凋亡被認(rèn)為是機(jī)體清除具有潛在損害活性的 PMN 有效的生理調(diào)節(jié)機(jī)制。當(dāng) PMN 凋亡減少或延遲，大量滯留于機(jī)體組織，過(guò)度、持續(xù)地活化并產(chǎn)生大量的活性氧自由基和多種蛋白水解酶，加重炎癥反應(yīng)和組織損傷，甚至引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙綜合征4，5。 梗阻性黃疸后圍手術(shù)期易并發(fā)感染和敗血癥與機(jī)體免疫功能的紊亂，與炎性細(xì)胞機(jī)能的改變有明顯的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著膽道梗阻的形成和時(shí)間的延長(zhǎng)，BDL 大鼠外周血的 WBC 數(shù)量不斷上升，尤其以 PMN 升高為主，呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性變化。并且，CBDL 大鼠術(shù)后

13、 1 d PMN 開(kāi)始凋亡，且隨著病程的延長(zhǎng)逐漸降低。這說(shuō)明 CBDL 大鼠的 PMN 不僅存在數(shù)量增加，而且凋亡貫穿于梗阻性黃疸的始終，這必將在梗阻性黃疸感染和膿毒血癥的發(fā)生、發(fā)展中起著十分重要的作用。 IL-8 是機(jī)體內(nèi)一種重要的細(xì)胞因子，其主要靶細(xì)胞是 PMN，對(duì) PMN 起特異性的趨化和活化作用，并可誘導(dǎo)它進(jìn)入炎癥部位，促進(jìn)變形、脫顆粒、釋放溶酶體酶、產(chǎn)生超氧化物，并延長(zhǎng)存活時(shí)間和增強(qiáng)活性功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CBDL 大鼠術(shù)后血清 IL-8 水平逐漸升高，且與 PMN 的凋亡指數(shù)的變化呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。我們認(rèn)為，IL-8 異常升高可能是引起 PMN 凋亡延遲的原因之一，導(dǎo)致持續(xù)、過(guò)度的炎癥

14、反應(yīng)和組織損傷。而 IL-8 參與細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的具體機(jī)制目前尚未明確。 總之，CBDL 大鼠存在 PMN 凋亡的延遲，與細(xì)胞因子 IL-8 水平的升高密切相關(guān)。深入了解外周血 PMN 凋亡變化的意義，有利于揭示梗阻性黃疸易發(fā)感染和膿毒血癥的機(jī)理，為臨床治療提供可靠的理論依據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1Chilvers ER, Cadwallader KA, Reed RJ, et al. The function and fate of neutrophils at the inflamed site: prospects for therapeutics interventionJ. JR Coll

15、Physicians Lond, 2000, 34(1):68-74 2倪勇, 高海斌, 劉琰, 等. 梗阻性黃疸大鼠腹腔巨噬細(xì)胞凋亡和吞噬功能的改變J. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志, 2004, 21(12): 1425-14273劉文超, 劉智廣, 張曉楠, 等. 外周血中性粒細(xì)胞的分離方法J. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 1996, 12(4):64-664Diebel LN, Liberati DM, Taub JS, et al. Intestinal epithelial cells modulate PMN activation and apoptosis following bacterial and hypoxic challengesJ. J Trauma, 2005, 58(6): 1126-11335Lea F, Luciano FF, Mary CB, et al. Neutrophil apoptosis: a marker of disease severity in sepsis and sepsis-induced acute respiratory distress syndromeJ. Crit C