腺病毒介導(dǎo)反義IGF-1抑制鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究

1、    腺病毒介導(dǎo)反義IGF-1抑制鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究        【摘要】目的重組腺病毒反義IGF-1基因(AdHCMV-IGF-1A)治療大鼠C6膠質(zhì)瘤。方法體外克隆反義IGF-1300bp基因片段重組入腺病毒，經(jīng)擴(kuò)增純化，測(cè)定滴度，體外體內(nèi)感染C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，觀察IGF-1的表達(dá)及腫瘤大小、生存期變化。結(jié)果重組腺病毒反義IGF-1滴度6.5×1010pfu/ml，反義IGF-1基因序列正確，體外C6-Ad-IGF-1A的IGF-1表達(dá)降低，Ad-IG

2、F-1A治療皮下C6腫瘤細(xì)胞接種組，腫瘤完全消失。與對(duì)照組相比有顯著性差異(P0.01)，Ad-IGF-1A治療腦內(nèi)C6腫瘤細(xì)胞接種組，大鼠生存期超過90天，而對(duì)照組分別為16.5±1.4天(Ad-lacz組)、15.7±1.6天(生理鹽水組)，P0.001。結(jié)論重組腺病毒反義IGF-1可抑制C6細(xì)胞IGF-1的表達(dá)，AdHCMV-IGF-1A治療大鼠C6膠質(zhì)瘤效果顯著?！娟P(guān)鍵詞】反義基因治療C6膠質(zhì)瘤腺病毒載體胰島素樣生長(zhǎng)因子-1 Adenovirus mediated antisense IGF-1 gene therapy for rat gliomaLI Xiang

3、dong, HUI Guozhen, LU Daru, et al.Department of neurosurge ry, The First Affiliated of Suzhou Medical College, Suzhou 215006【Abstract】ObjectiveTo observe the treat me nt effect of rat C6 glioma with recombinant adenovirus antisense IGF-1 gene (Ad HCMV-IGF-1A). MethodsAntisense IGF-1 gene of 300 base

4、 pairs was colon e d into adenovirus. The recombinant adenovirus was amplified, purified and assess ed of the titer. The C6 glioma cells were transfected by the recombinant adenovi rus in vitro and in vivo. The expression of IGF-1 in vitro and tumor size, surv iv al of tumor-bearing rats were observ

5、ed. ResultsThe tite r of recombinant adenovirus was 6.5×1010pfu/ml. The expression of IGF- 1 in C6 cells transfected by AdHCMV-IGF-1A was decreased. When the rats of C6 su bcu taneons glioma were treated with AdHCMV-IGF-1A, the tumors all disappeared wh il e as the tumor size of control was sig

6、nificantly large. When the rats of C6 intr acr anial glioma were treated with AdHCMV-IGF-1A, AdlacZ, saline solution the su rv ivals were 90 days, 16.5±1.4 days, 15.7±1.5 days respectively (P0. 001).ConclusionThe expression of IGF-1 of C6 could be suppre s sed by AdHCMV-IGF-1A. Recombinant

7、 adenovirus antisense IGF-1 had great effec t in treating rat C6 glioma in vivo.【Key words】Antisense gene therapyC6 gliomaAdenovirus vectorIGF-1惡性腫瘤的發(fā)生與某些生長(zhǎng)因子的異常表達(dá)密切相關(guān)，胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-likegrowthfactor-1,IGF-1)就是其中一種。原發(fā)性人腦星形細(xì)胞瘤和大鼠腦膠質(zhì)細(xì)胞系C6都存在IGF-1的增高，IGF-1的高水平表達(dá)通過自分泌環(huán)作用促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，并維持腫瘤細(xì)胞惡性表型。本實(shí)驗(yàn)通

8、過克隆IGF-1翻譯起始位點(diǎn)300bp的反義片段，制備重組腺病毒反義IGF-1，基因治療C6大鼠腦膠質(zhì)瘤，探討其作用機(jī)理，為反義基因治療腦腫瘤提供基礎(chǔ)。材料和方法一、材料各種限制性內(nèi)切酶、T4-DNA連接酶、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶等為美國(guó)NewEnglandBiolabs公司產(chǎn)品，大鼠腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞由第二軍醫(yī)大學(xué)病理教研室提供，IGF-1引物由中科院植物生理研究所合成，引物P1：5'TTGCCTCATTATTCCTGC3'。引物P2：5'CTGGAGGCCATAGCCTGTGG3'。pJM17和人胚腎細(xì)胞293細(xì)胞由劉國(guó)卿博士贈(zèng)送(UniversityofB

9、ritishColumbia,Canada)腺病毒LacZ由復(fù)旦大學(xué)遺傳所提供，SD大鼠購于第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心，大鼠腦立體定向儀為上海產(chǎn)江灣1型，IGF-1抗體購自SantaCruz生物技術(shù)公司，DMEM培養(yǎng)基為美國(guó)GIBCO公司產(chǎn)品。二、方法1.細(xì)胞培養(yǎng)：C6細(xì)胞、293細(xì)胞用高糖DMEM培養(yǎng)液，常規(guī)加入10%小牛血清、青霉素100u/ml、鏈霉素100g/ml。2.反義IGF-1基因的克?。喝?×106細(xì)胞，抽提細(xì)胞總RNA，加入IGF-1引物，70變性10分鐘，冰浴條件下加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液和反轉(zhuǎn)錄酶，371小時(shí)，4230分鐘，7015分鐘。取部分反應(yīng)液作PCR檢測(cè)，加入適量引物

10、、dNTP、Mg2、緩沖液、水和Taq酶。95變性300秒，48退火30秒，72延伸60秒。從第二循環(huán)開始變性時(shí)間為30秒，如此35次循環(huán)最后72300秒，PCR產(chǎn)物于1.8%瓊脂糖凝膠電泳分析。將DNA片段柱式回收，連接入pGEM-T載體，鑒定反向插入的克隆，構(gòu)建入pAdHCMV質(zhì)粒為pAdHCMV-IGF-1A。3.測(cè)序：取反向插入IGF-1的pGEM-T克隆，進(jìn)行自動(dòng)測(cè)序儀分析。4.重組腺病毒反義IGF-1制備：將pAdHCMV-IGF-1A與pJM17采用磷酸鈣沉淀法共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，挑取噬斑，得到重組腺病毒(Ad-IGF-IA)。重組腺病毒的擴(kuò)增、純化及滴度測(cè)定按文獻(xiàn)進(jìn)行。PCR檢測(cè)

11、重組腺病毒內(nèi)含目的基因。5.細(xì)胞的體外增殖試驗(yàn)：用MOI=100的Ad-IGF-1A和Ad-lacZ感染C6細(xì)胞，375%CO2孵育4小時(shí)，DMEM洗兩遍去除游離的病毒，加入常規(guī)培養(yǎng)基，5天后，用MTT法測(cè)定，結(jié)果用570nm的OD值計(jì)算。6.免疫組化試驗(yàn)：感染Ad-IGF-1A的C6、親本C6進(jìn)行ABC法免疫組化染色，Ad-lacZ感染的C6進(jìn)行x-gal染色。7.大鼠C6膠質(zhì)瘤皮下及腦內(nèi)腫瘤模型的建立及重組腺病毒原位治療：SD雄性大鼠，每組10只，體重250g300g，分別于右腿皮下接種1×107C6細(xì)胞，每3天測(cè)定皮下腫瘤大小，腫瘤大小用長(zhǎng)徑×短徑計(jì)算。腦內(nèi)接種組記錄

12、大鼠的存活期，對(duì)于存活期大于90天的荷瘤鼠，其存活期記為90天。腦內(nèi)腫瘤模型：麻醉后固定于立體定向臺(tái)上，手術(shù)暴露顱骨標(biāo)志，于前囟中點(diǎn)前1.0mm，矢狀縫旁3.5mm，顱骨下5.0mm，微量注射器接種C6細(xì)胞1×10610l。皮下、腦內(nèi)接種后第三天用Ad-IGF-1A原位治療，大鼠重新固定于立體定向臺(tái)上，沿原道注入10l腺病毒。病毒注射后5天，每組兩只斷頭處死，作病理檢查。實(shí)驗(yàn)分六組(1)Ad-IGF-1A皮下治療組。(2)Ad-lacZ皮下治療組(3)生理鹽水皮下治療組(4)Ad-IGF-1A腦內(nèi)治療組(5)Ad-lacZ腦內(nèi)治療組(6)生理鹽水腦內(nèi)治療組。結(jié)果1.反義IGF-1基因

13、的克隆：RT-PCR從C6細(xì)胞中擴(kuò)增得到300bp基因片段，其中含Bgl酶切位點(diǎn)，根據(jù)其Bgl酶切點(diǎn)鑒定反向pGEMT-IGF-1克隆，自動(dòng)測(cè)序儀分析序列完全正確。2.重組腺病毒AdHCMV-IGF-1A的制備：把pGEMT-IGF-1A中反義IGF-1A片段通過中間質(zhì)粒pBS、pCEP4連接入pAdHCMV，酶切鑒定正確，與pJM共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，挑取噬斑，PCR鑒定存在有IGF-1A片段，擴(kuò)增、純化病毒，并測(cè)定滴度為6.5×1010pfu/ml。3.體外增殖試驗(yàn)：C6-Ad-IGF-1A、C6-Ad-lacZ、C6親本細(xì)胞5天內(nèi)體外增殖能力無顯著性差別(P0.05)。4.免疫組化

14、結(jié)果：用ABC法染色見C6腫瘤細(xì)胞有褐色著色，C6-Ad-IGF-1A無細(xì)胞內(nèi)染色，C6-AdlacZ近100%呈藍(lán)色(1、2、3)。1C6-Ad-lacZ的x-gal染色近100%C6細(xì)胞染成藍(lán)色2C6細(xì)胞用IGF-1抗體進(jìn)行ABC法免疫組化染色3C6-Ad-IGF-1A進(jìn)行IGF-1抗體的免疫組化染色5.皮下接種C6后腫瘤的大小：皮下接種后各治療組腫瘤的生長(zhǎng)曲線見5。Ad-IGF-1A、Ad-lacZ和生理鹽水組在接種后5天均可捫及皮下腫瘤，Ad-IGF-1A治療組腫瘤逐步縮小并消失，而后兩組腫瘤逐步增大，后兩組間無顯著性差別，與第一組有顯著性差異(P0.001)。腫瘤細(xì)胞接種后時(shí)間(天)

15、5C6大鼠皮下腫瘤的生長(zhǎng)曲線6.腦內(nèi)接種腫瘤后生存期：Ad-IGF-1A治療組大鼠全部存活，生存期均超過90天，Ad-lacZ治療組平均生存期16.5±14天，生理鹽水治療組平均生存期15.7±16天。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，Ad-IGF-1A組與其余兩組間生存期有顯著性差異(P0.001)。Ad-lacZ組和生理鹽水組間生存期無顯著性差異(P0.01)見6。腫瘤細(xì)胞腦內(nèi)接種后存活時(shí)間(天)6C6腦內(nèi)膠質(zhì)瘤大鼠的生存曲線7.病理學(xué)檢查：皮下和腦內(nèi)Ad-IGF-1A治療組均見大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，腫瘤細(xì)胞稀疏，有片狀壞死(見4)。而皮下和腦內(nèi)Ad-lacZ和生理鹽水治療組均見腫瘤細(xì)胞豐富，

16、細(xì)胞核異型，有豐富的毛細(xì)血管，腫瘤細(xì)胞向正常組織浸潤(rùn)。4C6腦內(nèi)膠質(zhì)瘤用Ad-IGF-1A治療后第5天的病理切片討論反義基因治療是膠質(zhì)瘤基因治療的重要內(nèi)容，由于膠質(zhì)瘤的發(fā)生是由于各種癌基因激活或抑癌基因的失活引起，并與多種生長(zhǎng)因子的異常表達(dá)密切相關(guān)。利用反義基因技術(shù)可抑制多種癌基因及生長(zhǎng)因子的過度表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞表型逆轉(zhuǎn)，抑制腫瘤生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。我們應(yīng)用腺病毒介導(dǎo)反義IGF-1體內(nèi)外治療皮下和腦膠質(zhì)瘤，取得明顯的抑瘤效果，為進(jìn)一步應(yīng)用反義技術(shù)治療腦腫瘤奠定基礎(chǔ)。胰島素樣生長(zhǎng)因子-1是一類具有胰島素樣生長(zhǎng)刺激活性及免疫調(diào)節(jié)的多肽分子。在正常人腦中，IGF-1僅存在于胎兒期，出生后消失，I

17、GF-1需和其受體IGF-1R結(jié)合才能發(fā)揮作用，并且IGF-1是膠質(zhì)瘤細(xì)胞的有絲分裂原，人腦膠質(zhì)瘤高表達(dá)IGF-1，IGF-1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，其作用機(jī)制是IGF-1和其受體結(jié)合，通過自分泌環(huán)使腫瘤細(xì)胞無限增殖，并維持腫瘤細(xì)胞惡性表型使腫瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)。我們通過反義IGF-1抑制IGF-1的表達(dá)，免疫組化證實(shí)其可行性。腺病毒載體宿主廣泛，滴度高，易純化，可直接活體注射，更接近于臨床應(yīng)用，目前有更多的腫瘤基因治療臨床方案采用腺病毒作為載體。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用腺病毒介導(dǎo)反義IGF-1治療大鼠腦內(nèi)及皮下腫瘤，使腫瘤完全消失，大鼠長(zhǎng)期存活，抑瘤效果達(dá)100%。反義IGF-1治療腫瘤的機(jī)理有兩種，一是阻斷

18、IGF-1的自分泌環(huán)作用，使腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。二是改變腫瘤細(xì)胞表型，激發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)，能使腫瘤細(xì)胞MHC-1類抗原及B表達(dá)增高。Trojan2，3應(yīng)用pREP質(zhì)粒表達(dá)反義IGF-1轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞，能完全抑制荷瘤鼠腫瘤生長(zhǎng)，并發(fā)現(xiàn)腫瘤原位有大量CD8淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，Lafarge-Frayssinet4進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染反義IGF-1的腫瘤細(xì)胞表面MHC-1和B較親本細(xì)胞明顯增高。Shevelev5應(yīng)用反基因技術(shù)也證實(shí)轉(zhuǎn)染反義IGF-1的C6細(xì)胞MHC-1類抗原表達(dá)增高。由此，反義IGF-1基因治療腦腫瘤主要依賴于改變腫瘤細(xì)胞惡性表型，提高腫瘤的免疫原性，誘導(dǎo)機(jī)體識(shí)別免疫耐受的腫瘤組織，產(chǎn)生

19、特異性抗腫瘤的免疫反應(yīng)，這是反義IGF-1基因治療最為有效、最令人鼓舞的作用機(jī)制之一。我們的實(shí)驗(yàn)也證明了反義IGF-1治療組腫瘤組織內(nèi)有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，殺傷腫瘤細(xì)胞，與文獻(xiàn)相符。注：本研究為江蘇省科委及衛(wèi)生廳重大科研資助項(xiàng)目作者單位：215006蘇州醫(yī)學(xué)院附一院神經(jīng)外科(李向東、惠國(guó)楨)；復(fù)旦大學(xué)遺傳所(盧大儒、王琪、徐露、邱信芳、薛京倫)參考文獻(xiàn)1Cruiel DT, Agarwarl S, Wagner E, et al. Adenovirus enhancemen t of transferrin-polylysine-mediated gene delivery. Proc Natl Acad Sci, 1991,8 8:8850-8854.2Trojan J, Johnson TR, Rudin SD, et al. Treatment and prevention of rat glioblastoma by C6 cells expressing antisense IGF-1RNA. Science, 1993, 259:94 -97.3Trojan J, Blossey BK, Johnson TR, et al.