原位雜交在觀賞植物中的研究進展

1、原位雜交在觀賞植物中的研究進展目錄 1、概述 2、分類 3、RNA原位雜交 4、總結一、概述 原位雜交(In situ hybridization，簡稱ISH)，利用放射性或非放射性標記已知的核酸探針，通過放射自顯影或非放射檢測系統(tǒng)檢測組織、細胞及染色體上特異DNA或RNA序列的一種技術，一種直接、簡便的研究基因定位和表達的方法。是一種能夠從形態(tài)學上證明特異性的DNA或RNA序列存在于個別細胞、組織部分，單細胞或染色體中的技術，是分子生物學和組織化學、細胞學結合的產(chǎn)物。 原理：染色體原位雜交技術是根據(jù)核酸分子堿基互補配對的原則(AT，GC)，將有放射性和非放射性標記的探針與染色體上經(jīng)過變性后的

2、單鏈DNA互補配對，結合成專一的核酸雜交分子，再經(jīng)過一定的檢測手段將待測核酸在染色體上的位置顯示出來。 1969年，美國耶魯大學Gall和Pardue首先創(chuàng)立，用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細胞雜交，確定該基因定位于卵母細胞的核仁中。 1971年， Jacob 創(chuàng)立電鏡原位雜交技術檢測爪蟾卵母細胞DNA 80年代，原位雜交技術飛速發(fā)展現(xiàn)已能檢測只有數(shù)百堿基對的較小分子DNA和含量很低的mRNA。 當時的工作多采用冰凍組織切片或培養(yǎng)細胞，探針均采用同位素標記。 1981，Bauman等首先應用熒光素標記cRNA探針做原位雜交，然后用熒光顯微鏡觀察獲得成功熒光雜交技術。 1985年Rayburn首次

3、將原位雜交技術應用于植物染色體的研究,此后在植物研究中得到廣泛的應用,特別是在遠緣雜交后代的鑒定和遺傳物質(zhì)的檢測中,由于直觀可靠等優(yōu)點而倍受青睞。 生物素標記探針技術是Brigat（1983）首先建立的，它利用生物素標記的探針在組織切片上檢測了病毒DNA，通過生物素與抗生物素結合，過氧化物酶-抗過氧化物酶顯示系統(tǒng)顯示病毒DNA在細胞中的定位。 1987年，將地高辛標記的有關試劑及藥盒投放市場。地高辛標記技術引起科技工作者的極大興趣。優(yōu)點：完全、方便、省時，敏感性和質(zhì)量控制較好，可檢測人基因組DNA的單拷貝基因，背景反差好。二、分類 原位雜交主要分為染色體原位雜交和RNA原位雜交，染色體原位雜交

4、應用于觀賞植物中較多的是FISH和GISH。 FISH(Fluorescence in situ Hybridization) 因其所用探針被熒光物質(zhì)標記（間接或直接）而得名，基本原理是熒光標記的核酸探針在變性后與已變性的靶核酸在退火溫度下復性；通過顯微鏡觀察熒光信號可在不改變被分析對象（即維持其原位）的前提下對靶核酸進行分析。DNA熒光標記探針是其中最常用的一類核酸探針。利用此探針可對組織、細胞或染色體中的DNA進行染色體及基因水平的分析。 GISH(Genome in situ Hybridization)基因組原位雜交是在分子水平上檢測外源染色質(zhì)的一種有效方法,其探針是總基因組DNA.該

5、技術廣泛應用于植物進化、親緣關系、真實雜種鑒定上。 染色體原位雜交基本流程圖探針 靶子1.分離DNA 1. 染色體的制片準備2.標記 2. 雜交前處理3.變性 3.變性 4. 雜交 5.雜交后處理（解離非特異性結合的雙鏈，除去未雜交的探針） 6.雜交體的檢測（雜交DNA呈現(xiàn)顏色A,未雜交的呈現(xiàn)顏色B）染色體原位雜交的應用 基因定位：物理定位 染色體識別：利用不同熒光素標記不同的探針,進行多色熒光原位雜交。傳統(tǒng)的染色體形態(tài)特征和熒光原位雜交結果相結合,使染色體小、數(shù)目大、形態(tài)相似植物全部或部分得到區(qū)分,在此基礎上進行核型分析,得到精確的核型圖以及模式圖。鑒于rDNA序列與DNA的結合的難度較低、

6、檢出率高、雜交信號強等特點,其成為染色體識別中應用最為廣泛的一類探針。通過比較rDNA雜交信號的數(shù)量、位置、大小,進行染色體識別,這些信息已經(jīng)成為核型分析的重要參數(shù)指標。棉屬、藍豬耳、夜香樹屬。 構建植物基因組物理圖譜 基因組進化研究：基因組原位雜交(GISH)是基因組進化研究常用的技術手段,因此,通過基因組原位雜交可以鑒定雜種。利用雜交種親本的總DNA作為標記探針,另一個親本基因組DNA做封阻DNA,在該雜交種的染色體制片上進行原位雜交,可以有效地區(qū)分同源性相近的兩個染色體組。四倍體棉起源。 轉基因植物的鑒定以地高辛標記的45SrDNA為探針,用鮭魚精DNA (ssDNA)做封阻,對6個梅花

7、品種的分裂間期細胞核進行FISH實驗。玉米45SrDNA在梅花中有6個信號位點,主要分布于第1、3、7號染色體上,不同品種略有差異,為梅花品種分類提供一定的客觀依據(jù)。45SrDNA雜交位點主要分布于染色體長臂末端,結合染色體核型參數(shù),推斷出梅花進化程度較低。梅花染色體制片技術優(yōu)化及基于熒光原位雜交的核型分析-陳晶鑫，2013幾種紫薇屬植物染色體制片技術優(yōu)化及原位雜交體系的建立楊冰潔，2013基因組原位雜交(GISH ) 在分子細胞遺傳學領域具有重要作用。該技術能夠直接地、可見地辨別屬間或種間雜種中親本基因組的構成,這是常規(guī)細胞遺傳學方法不能或難以達到的RNA原位雜交的特點 (1)使用的探針不同

8、：RNA原位雜交中多采用RNA或寡核苷酸探針，避免了應用雙鏈DNA探針在雜交反應中存在的兩條鏈之間的復性和第二條鏈的競爭性雜交問題。cRNA-RNA雜交體比DNA-DNA、cDNA-RNA雜交體性能穩(wěn)定，在雜交反應后可用RNA酶洗脫，以除去未結合的探針，因此特異性更強。 (2)檢測的目的不同：RNA原位雜交檢測和分析的主要為內(nèi)源性基因，包括細胞內(nèi)固有基因、異?；蚝妥儺惢颉Ｒ哉_反映組織與細胞之間相互關系及功能和代謝狀態(tài)、探索疾病發(fā)病機理、觀察治療的療效和評估疾病的預后等。 (3)有較高的靈敏度：在檢出細胞和組織內(nèi)在低拷貝核苷酸時，RNA原位雜交能獲得較好定位。 三、RNA原位雜交的操作流程

9、 以組織切片和DIG標記RNA探針為例：材料固定與包埋制片質(zhì)粒DNA線性化和DIG標記的體外轉錄（探針制備）預雜交雜交雜交后處理免疫反應顯色反應封片觀察。探針的制備RNA探針是指帶有標記的能與組織內(nèi)相對應的核苷酸序列互補結合的一段單鏈cDNA或cRNA分子。根據(jù)在RNA雜交中所使用的探針依其來源可分為三種：1、特異性特異性cDNA： cDNA中不存在內(nèi)含子及其它高度重復序列，又克服了雙鏈cDNA探針在雜交反應中兩條鏈之間復性的缺點，從而提高了雜交反應的敏感性2、cRNA探針探針：以cDNA為模板，通過體外轉錄而獲得的。因為它是一種單鏈探針，因此也避免了應用雙鏈cDNA探針做雜交反應時存在的兩條

10、鏈之間的復性問題。cRNA與RNA之間形成的雜交體要比cDNA-RNA雜交體穩(wěn)定。cRNA-RNA之間形成的雜交體不受RNA酶的影響。因此雜交反應后可用RNA酶處理，以除去未結合的探針。3、人工合成寡核苷酸探針人工合成寡核苷酸探針：人工合成的寡核苷探針是以核苷酸為原料，通過DNA合成儀合成，避免了真核細胞中存在的高度重復序列帶來的不利影響。它與mRNA形成的雜交體不如cRNA-RNA雜交體穩(wěn)定，再則探針較短，所攜帶的標記物少，敏感性較低。 百合花發(fā)育相關基因的組織原位雜交研究_潘梅百合花發(fā)育相關基因的組織原位雜交研究-潘梅，2010總結 以野菊不同發(fā)育時期的花器官為材料，通過制備菊花花型對稱相關基