阿侖膦酸鈉抑制破骨細(xì)胞體外吸收的研究

1、    阿侖膦酸鈉抑制破骨細(xì)胞體外吸收的研究        摘要本研究利用體外分離培養(yǎng)的兔破骨細(xì)胞，觀察第三代雙膦酸鹽阿侖膦酸鈉(alendronate)對(duì)骨吸收的抑制作用。將alendronate加入培養(yǎng)液中使其最終濃度為0M，1M,10M,100M。同時(shí)觀察兩組用alendronate鹽溶液100M,50M浸泡的骨片對(duì)破骨細(xì)胞吸收功能的影響。用倒置光相差顯微鏡在不同時(shí)間點(diǎn)觀察計(jì)數(shù)骨吸收陷窩并拍照。結(jié)果隨著培養(yǎng)液內(nèi)alendronate濃度增高，骨吸收陷窩數(shù)減少，面積亦減少

2、。而用alendronate浸泡過(guò)的骨片上未見骨吸收陷窩。說(shuō)明alendronate具有抑制破骨細(xì)胞體外骨吸收的作用。關(guān)鍵詞阿侖膦酸鈉破骨細(xì)胞骨吸收陷窩 Alendronate inhibits osteoclastic bone resorption in VitroWang Xiaomin,Yu Shifeng,Liu ZhonghouDepartment of Pathology,School of Stomatology,Beijing Medical University,Beijing 100081,ChinaAbstract In order to evaluate the in

3、hibitory effect of alendronate on bone resorption in vitro，we used cultures of rabbit osteoclasts to address this issue.Alendronate at various concentrations was added to four groups of media (the final concentration:0M,1M,10M,100M).Before experiment,two groups of bone slices were incubated in alend

4、ronate solution of different concentrations (100M,50M) in PBS for 48 hours at 4.At different time,bone resorption pits were observed and calculated under inverted and contrast microscope.The results showed that the number and area of bone resorptive pits were not found on bone slices that once incub

5、ated in alendronate solution.The data demonstrate that alendronate inhibits the activity of osteoclasts in vitro.Key wordsAlendronate Osteoclasts Bone resorptive pits雙膦酸鹽是骨吸收抑制劑。破骨細(xì)胞是骨吸收的功能細(xì)胞，骨吸收活動(dòng)是在骨的微小環(huán)境內(nèi)進(jìn)行的復(fù)雜分子生物學(xué)反應(yīng)的過(guò)程。破骨細(xì)胞通過(guò)質(zhì)膜向細(xì)胞外分泌酸，致使骨組織脫礦，脫礦后的殘余骨基質(zhì)，又被破骨細(xì)胞分泌的各種水解酶消化，分解破壞1。雙膦酸鹽抑制骨吸收的機(jī)制尚不明了，一些研究

6、表明其對(duì)骨吸收的影響可能與破骨細(xì)胞的代謝，功能，酶活性，蛋白質(zhì)多糖合成有關(guān)2，3。為了觀察第三代雙膦酸鹽制劑alendronate對(duì)破骨細(xì)胞的作用，運(yùn)用破骨細(xì)胞體外分離培養(yǎng)體系，觀察藥物因子的作用，并探討其作用機(jī)制。1材料和方法1.1動(dòng)物：新生日本大耳白兔(購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所)。1.2藥品及試劑：(1)-MEM培養(yǎng)基(Sigma,Chemical Co)。(2)alendronate(河北制藥集團(tuán))。(3)新生牛血清(Gibco Laboratories)。(4)HEPES(購(gòu)自北方同正公司)。1.3方法(1)破骨細(xì)胞的分離：將新生兔斷頸處死，無(wú)菌條件下取四肢長(zhǎng)骨，在D-Hanks平衡鹽溶液中

7、去凈附著在骨表面的軟組織及軟骨骺。然后在 MEM全培養(yǎng)液(含15%新生牛血清，青酶素100U/ml，鏈酶素100g/ml,25mMHEPES)內(nèi)，將骨干縱形剖開，輕刮骨的髓腔表面至顏色變白，用尖吸管吸取培養(yǎng)液反復(fù)沖洗髓腔面，去掉骨片，保留懸液，待用。(2)骨磨片的制備：將新鮮牛股骨用金鋼砂片及粗細(xì)金鋼砂石制備成6mm×6mm大小，10m厚的骨磨片。選48片骨磨片置蒸餾水中，超聲清洗三次，每次5分鐘。實(shí)驗(yàn)前兩天取16個(gè)經(jīng)超聲清洗的骨磨片，平均分為兩組，分別浸泡于濃度為50M，100M的雙膦酸鹽溶液中，放置在4冰箱內(nèi)。分離破骨細(xì)胞之前，將超聲清洗骨片和雙膦酸鹽處理骨片分別浸泡于 MEM(

8、含青酶素1000U/ml，鏈酶素1000g/ml)培養(yǎng)液內(nèi)，換液三次，每次20分鐘。(3)藥物添加：取兩個(gè)24孔培養(yǎng)板，每孔加1ml MEM全培養(yǎng)液，1個(gè)骨片，0.5ml細(xì)胞懸液于5% CO2,37條件下進(jìn)行培養(yǎng)。隔夜，用 MEM培養(yǎng)液沖掉未附著于骨片上的細(xì)胞。將骨片分成6組每組8個(gè)孔，見表1。表1藥物添加情況組別細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)加入BP終濃度(uM)BP處理骨片(uM)A00B10C100D1000E050F0100(4)相差顯微鏡觀察及拍照：采用Olympus倒置光相差顯微鏡，分別于第3天和第5天計(jì)數(shù)骨片上的骨吸收陷窩數(shù)，并拍照記錄。利用LEICAQ550IW像分析系統(tǒng)進(jìn)行像分析(A，B，C，

9、D組各10張同樣放大倍數(shù)照片)(5)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：各組吸收陷窩數(shù)及吸收面積采用SPSS軟件的T進(jìn)行分析。2結(jié)果2.1形態(tài)觀察：破骨細(xì)胞與骨片共同培養(yǎng)16小時(shí)，沖洗骨片后，未見骨吸收陷窩，但可見貼壁的破骨細(xì)胞輪廓，E，F(xiàn)組骨片上貼壁細(xì)胞輪廓少見。培養(yǎng)24小時(shí)，A組個(gè)別骨片上出現(xiàn)小而圓的吸收陷窩，36小時(shí)A組骨片上出現(xiàn)吸收陷窩團(tuán)呈花瓣樣。B組出現(xiàn)散在的小而圓的吸收陷窩，C組偶見小的單個(gè)吸收陷窩，其它組未見。隨時(shí)間延長(zhǎng)，A組吸收陷窩數(shù)目及吸收面積劇增，B組增加幅度較小，C組稍有增加，D組偶見陷窩。E，F(xiàn)組未見骨吸收陷窩。至第七天以后吸收陷窩數(shù)不再增加，陷窩周緣變模糊，E，F(xiàn)組仍未見骨吸收陷窩。(見16

10、) 1最早出現(xiàn)的骨吸收陷窩2呈花瓣樣的骨吸收陷窩3第3天A組骨吸收陷窩4第7天A組骨吸收陷窩和第3天相比陷窩數(shù)及面積增加5B組第3天骨吸收陷窩6B組第7天骨吸收陷窩相對(duì)于第3天陷窩數(shù)增加但增加幅度小2.2功能測(cè)定：經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用藥組與非用藥組相比吸收陷窩數(shù)和吸收面積有顯著差異，并隨濃度增加抑制作用增強(qiáng)。 表2第3天，7天各組骨吸收陷窩數(shù)、面積()組別骨吸收陷窩數(shù)7天骨吸收陷窩面積3天7天um2 n=10A67.75±6.92523±21.414349.66±175B26.5±3.64231.2±13.361219.13±430.31

11、C6.75±1.1924.75±6.03314±180.52D1.125±0.481.75±0.4512.75±2.57E000F000注：用藥組和未用藥組A組相比，P<0.00013討論破骨細(xì)胞骨吸收是在骨表面上進(jìn)行的，所以破骨細(xì)胞性骨吸收首先需附著于骨面。不同的細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)破骨細(xì)胞產(chǎn)生不同的刺激信號(hào)，破骨細(xì)胞的微絲微管將產(chǎn)生不同的排列結(jié)構(gòu)，因而產(chǎn)生不同的生物學(xué)行為。破骨細(xì)胞膜上有稱為整合素(Integrin)的信號(hào)傳導(dǎo)受體，磷酸化和細(xì)胞內(nèi)鈣平衡有關(guān)2，它是一種穿膜糖蛋白，在細(xì)胞外側(cè)與一些基質(zhì)中的附著蛋白結(jié)合，在細(xì)胞內(nèi)側(cè)又能與

12、細(xì)胞漿內(nèi)的talin和vinculin結(jié)合，從而使細(xì)胞骨架的微絲，微管與細(xì)胞基質(zhì)蛋白結(jié)合，基質(zhì)蛋白主要為vitronectin和osteopontin和骨涎蛋白。這些蛋白含有Arg-Gly-Asp(RGD)氨基酸序列4。雙膦酸鹽是無(wú)機(jī)焦磷酸鹽(P-O-P)的同型物，它的主要結(jié)構(gòu)部分為“P-C-P”與焦磷酸鹽相似。焦磷酸鹽雖然能夠抑制骨吸收，但其在體內(nèi)很快水解，無(wú)法對(duì)骨吸收產(chǎn)生影響，而雙膦酸鹽的性質(zhì)十分穩(wěn)定，一經(jīng)體內(nèi)吸收，迅速進(jìn)入骨組織吸附于羥磷灰石晶體表面，余經(jīng)尿液原型排出5，它對(duì)骨吸收發(fā)揮作用的機(jī)理可能有三方面(1)干擾成熟破骨細(xì)胞的功能，這類破骨細(xì)胞已經(jīng)攝取雙膦酸鹽覆蓋的鈣化基質(zhì)。(2)雙

13、膦酸鹽在骨表面維持足夠的濃度梯度以直接影響破骨細(xì)胞活化啟動(dòng)的細(xì)胞間過(guò)程。(3)改變使破骨細(xì)胞活化的骨基質(zhì)性質(zhì)6。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的alendronate對(duì)體外分離培養(yǎng)的破骨細(xì)胞具有量的依賴性的抑制作用，隨濃度增加而抑制作用增強(qiáng)，表現(xiàn)為骨吸收陷窩數(shù)及吸收面積的減少。而用高濃度alendronatePBS液處理的骨片上未見骨吸收陷窩的形成，表現(xiàn)為對(duì)骨吸收的強(qiáng)抑制作用。并且倒置光相差顯微鏡下貼壁破骨細(xì)胞輪廓數(shù)極少。由此推測(cè)，高濃度的雙膦酸鹽溶液是否對(duì)骨片中的骨基質(zhì)有影響，使破骨細(xì)胞上的整合蛋白難以識(shí)別骨基質(zhì)中的RGD蛋白，從而難以附著在骨片上，不能形成骨吸收的微環(huán)境而抑制骨吸收。而培養(yǎng)液中加入的雙膦酸鹽作

14、用可能是抑制破骨細(xì)胞集聚于骨面，抑制骨面上的破骨細(xì)胞活性，縮短破骨細(xì)胞的生命周期即促使其凋亡，改變骨基質(zhì)和骨礦的性質(zhì)，使其難以識(shí)別骨基質(zhì)中的RGD蛋白，還是改變了骨基質(zhì)RGD蛋白構(gòu)型，使整合蛋白難以識(shí)別，還是二者兼而有之，有待于進(jìn)一步研究。作者單位：100081北京醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院病理教研室參考文獻(xiàn)1于世鳳.中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，1997，3：73-74.2Steven L,Teitelbaum,Johon D, et al. Bisphosphonates directly inhibit the bone resorption activity of isolated avian osteoclasts. in vitro.J Clin Invest,1990,85:456-461.3Murakami H,Takahashi N.et al. Tiludronate Inhibits protein tyrosine phosphotase activity in osteoclasts Bone,1997,20(5):399-404