酵母菌的分離純化

1、酵母菌的分離純化、固定化和酒精發(fā)酵第一部分 酵母菌的分離純化一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膽?yīng)用酵母菌的生理生化和生態(tài)學(xué)的特點(diǎn)，從自然環(huán)境中分離酵母菌，并掌握微生物分離純化的基本方法。二、實(shí)驗(yàn)原理酵母菌常見于含糖份比較高的環(huán)境中，如果園土、菜園土及果皮等的表面。多數(shù)酵母菌喜歡偏酸條件，最適pH為4.5-6.0.酵母菌生長(zhǎng)迅速，容易分離培養(yǎng)。在液體培養(yǎng)基中，酵母菌比霉菌生長(zhǎng)快，利用酸性條件則可以抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。因此常用酸性液體培養(yǎng)基獲得酵母菌的加富培養(yǎng)，然后在固體培養(yǎng)基上劃線分離純化。三、器材和用品 1、甘蔗、蘋果皮、葡萄皮、果園土、菜園土等。 2、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：馬鈴薯200g（煮開10min后過(guò)濾取汁）

2、，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000ml，pH自然。分裝三角瓶；試管斜面1支/組 3、乳酸馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液：配方同上，不加瓊脂加乳酸，按1000ml培養(yǎng)基加入5ml乳酸，pH為5.5左右，再分裝試管9ml2支/組。 4、無(wú)菌吸管3支/組、無(wú)菌培養(yǎng)皿、100ml無(wú)菌水1瓶/組、涂棒、美蘭染液、顯微鏡、接種環(huán)等。四、實(shí)驗(yàn)方法 1、接種：取果皮（不需沖洗）或土壤5克，加入到100ml無(wú)菌水中，充分?jǐn)嚢韬?，用無(wú)菌吸管取1ml接入到9ml乳酸馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液中，在28-30培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，可見培養(yǎng)液變渾濁。 2、加富培養(yǎng)：用無(wú)菌吸管取上述培養(yǎng)液1ml，注入另1管乳酸馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液中，在28

3、-30培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。 3、鏡檢：用無(wú)菌操作法用接種環(huán)取少量菌液置于載玻片上，中央滴一滴美蘭染液，混合均勻后制成水浸片，在高倍鏡下觀察酵母菌的形態(tài)及出芽方式，并可根據(jù)菌體是否染色來(lái)區(qū)分酵母菌的死活細(xì)胞，因活細(xì)胞使美蘭染液還原，故菌體不著色。 4、涂皿：用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基溶化后制成平板，用無(wú)菌吸管取0.1ml加富培養(yǎng)液到平板中，用涂棒涂勻后培養(yǎng)24h。 5、分離純化：用接種環(huán)挑取單個(gè)酵母菌菌落，在平板上四區(qū)劃線，培養(yǎng)后分離得到單個(gè)菌落。 6、鏡檢：挑取單菌落，制片觀察其形態(tài)。 7、菌種保藏：接種酵母菌到馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，長(zhǎng)出菌苔后冰箱保藏。第二部分 酵母菌的固定化技術(shù)一、實(shí)

4、驗(yàn)?zāi)康?1.了解固定化細(xì)胞的原理。 2.掌握用海藻酸鈉制備固定化酵母細(xì)胞的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理 固定化細(xì)胞技術(shù)是指用物理或化學(xué)的手段將游離細(xì)胞定位于限定的空間區(qū)域，并使其保持催化活性、反復(fù)使用的方法。優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞密度高、反應(yīng)速度快、耐毒害能力強(qiáng)、產(chǎn)物分離容易、可反復(fù)使用、能實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作，可大大提高生產(chǎn)能力。用于生產(chǎn)各種胞外產(chǎn)物，包括酒精酒類、氨基酸、有機(jī)酸、酶、輔酶、抗生素。 細(xì)胞固定化的方法有多種，如吸附法、交聯(lián)法和包埋法等。吸附法：又叫載體結(jié)合法，依據(jù)帶電的微生物細(xì)胞和載體之間的靜電、表面張力和黏附力的作用，使細(xì)胞固定在載體表面和內(nèi)部；簡(jiǎn)便，活力損失??；但細(xì)胞與載體作用力小，易脫落。交聯(lián)法：利

5、用雙功能或多功能試劑，直接與細(xì)胞表面的反應(yīng)基團(tuán)（如氨基酸、羥基、咪唑基等）發(fā)生反應(yīng)，使其彼此交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化細(xì)胞，其結(jié)合力是共價(jià)鍵。此法制備麻煩，活力損失較大；但細(xì)胞與載體結(jié)合較緊。包埋法：分為凝膠包埋法和半透膜包埋法。凝膠包埋法是將細(xì)胞包埋在各種凝膠內(nèi)部的微孔中而使細(xì)胞固定；半透膜包埋法是將細(xì)胞包埋在由各種高分子聚合物制成的小球內(nèi)。簡(jiǎn)單，條件溫和，穩(wěn)定性好，包埋細(xì)胞容量高。工業(yè)上常用包埋法固定微生物細(xì)胞。海藻酸鹽是一種廣泛應(yīng)用的固定化介質(zhì)，具有化學(xué)穩(wěn)定性好、無(wú)毒、包埋效率高且價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。在海藻酸鈉呈溶液狀時(shí)，將細(xì)胞加入混勻，然后在氯化鈣中凝固形成海藻酸鈣凝膠，凝膠顆粒中的微小空格

6、將細(xì)胞固定。海藻酸鈣凝固的顆粒能反復(fù)使用，細(xì)胞在空格中可以新陳代謝（固定活細(xì)胞)。3、 實(shí)驗(yàn)材料 1、分離的酵母菌。 2、培養(yǎng)基：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖30g，蒸餾水1000mL，pH自然，115滅菌20 min。 3、試劑：0.2 mol/L氯化鈣溶液150ml/瓶（22.2g氯化鈣，蒸餾水1000mL）、2%海藻酸鈉50ml/瓶：稱取一定的海藻酸鈉加入無(wú)菌燒杯中，先加少量水調(diào)成糊狀，在不足水份適當(dāng)加熱融化。 4、器具：200ml無(wú)菌燒杯1個(gè)、玻璃棒1根、無(wú)菌注射器1個(gè)（20ml）、無(wú)菌吸管1支，無(wú)菌水200ml/三角瓶、10ml培養(yǎng)基試管1支、200ml三角瓶培養(yǎng)基1個(gè)、青霉素

7、、天平、紗布、細(xì)繩、電爐、培養(yǎng)箱、棉塞等。四、實(shí)驗(yàn)步驟 1、將酵母菌接入10ml培養(yǎng)基中,于30培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后待用。 2、取3ml酵母菌培養(yǎng)液（預(yù)熱到35左右）加入到50ml2%海藻酸鈉溶液中（冷卻到45左右），均勻混合后用注射器吸入制成小球滴入150ml0.2 mol/L氯化鈣溶液中，攪拌成珠（固定酵母）。 3、待凝膠珠在氯化鈣溶液中浸泡30min后，用蒸餾水洗滌固定酵母2次后，再轉(zhuǎn)入到滅過(guò)菌的200mL液體培養(yǎng)基中（其中加入1mg青霉素）。 4、將固定酵母于28靜置培養(yǎng)3天后觀察，可見培養(yǎng)基中有大量的CO2氣泡產(chǎn)生，嗅氣味有酒香；用刀片切開固定酵母，鏡檢可見大量密集的酵母菌。第三部分

8、 酵母菌的酒精發(fā)酵一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1. 掌握酵母菌生產(chǎn)酒精的方法。 2. 了解酒精發(fā)酵的主要類型及其控制條件。二、實(shí)驗(yàn)原理 在厭氧條件下，己糖分解為乙醇并放出二氧化碳的作用，稱為酒精發(fā)酵作用。酒精發(fā)酵的類型有三種：即通過(guò)EMP途徑的酵母菌酒精發(fā)酵、通過(guò)HMP途徑的細(xì)菌酒精發(fā)酵（即異型乳酸發(fā)酵）和通過(guò)ED途徑的細(xì)菌酒精發(fā)酵。在工業(yè)酒精和各種酒類的生產(chǎn)中，酒精發(fā)酵的主要作用是由酵母菌來(lái)完成的。 酵母菌通過(guò)EMP途徑分解己糖生成丙酮酸，在厭氧和微酸性條件下，丙酮酸繼續(xù)分解為乙醇。但是，如果在堿性條件下或在培養(yǎng)基中加入亞硫酸鹽時(shí)，產(chǎn)物主要是甘油，這就是工業(yè)上的甘油發(fā)酵。因此，如果酵母菌要進(jìn)行酒精發(fā)酵，就

9、必須控制發(fā)酵液在微酸性條件下。三、實(shí)驗(yàn)材料 1、菌種：分離的酵母菌。 2、培養(yǎng)基： 白糖（蔗糖）80g、(NH4)2SO4 2.0g、KH2PO4 1.0g、H2O 1000ml；pH自然，115滅菌20min。 150ml三角瓶裝上述培養(yǎng)基50ml，250ml三角瓶裝培養(yǎng)基100ml，大試管中裝一個(gè)注滿培養(yǎng)基的杜氏小管，再裝入10ml培養(yǎng)基。 3、試劑：10%的NaOH、10%H2SO4 、1%K2Cr2O7。 4、器材：150ml三角瓶1個(gè)、250ml三角瓶1個(gè)、大試管1支、杜氏小管1支、無(wú)菌吸管1支。接種環(huán)、培養(yǎng)箱、100mL量筒、紗布、細(xì)繩、天平、棉塞3個(gè)。四、實(shí)驗(yàn)步驟 1、取分離的酵

10、母菌種一環(huán)，接入150ml的三角瓶中，于28-30培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，作為液體種子。將上述液體種子以5%的接種量分別接入250ml的三角瓶和大試管中，在于28-30培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-36h，后觀察結(jié)果。 2、二氧化碳生成的檢驗(yàn)1） 觀察三角瓶中的發(fā)酵液有無(wú)泡沫或氣泡溢出，再觀察發(fā)酵試管中的杜氏小管中有無(wú)氣體聚集。2）取10%的NaOH溶液1ml注入發(fā)酵試管內(nèi)，輕輕搓動(dòng)發(fā)酵管，觀察杜氏小管內(nèi)液面是否上升，如氣體逐漸消失，則證明氣體為發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的二氧化碳。 3、酒精生成的檢驗(yàn)： 1）打開發(fā)酵瓶塞子，嗅聞?dòng)袩o(wú)酒精味； 2）取發(fā)酵液5ml加入試管，加10% H2SO4溶液2ml；向試管中滴入1% K2Cr2O7 溶液1020滴；如管內(nèi)由橙黃色變?yōu)辄S綠色，證明有酒精生成 。2K2Cr2O7 + 8H2SO4 + 3CH3CH2OH 3CH3COOH + 2K2SO4