流式細(xì)胞技術(shù)課件

1、第第15章章 流式細(xì)胞技術(shù)的原理和應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)的原理和應(yīng)用陳鯉翔 副教授Email：流式細(xì)胞技術(shù)（流式細(xì)胞技術(shù)（Flow cytometry, FCM) 是以流式是以流式細(xì)胞儀為檢測手段的一項能快速對單個細(xì)胞或其細(xì)胞儀為檢測手段的一項能快速對單個細(xì)胞或其他生物微粒（如細(xì)菌）的理化特性進(jìn)行多參數(shù)定他生物微粒（如細(xì)菌）的理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)。量分析和分選的技術(shù)。流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀是測量染色細(xì)胞標(biāo)記物熒光強度的細(xì)是測量染色細(xì)胞標(biāo)記物熒光強度的細(xì)胞分析儀，是在單個細(xì)胞分析和分選基礎(chǔ)上發(fā)展胞分析儀，是在單個細(xì)胞分析和分選基礎(chǔ)上發(fā)展起來的對細(xì)胞的物理或化學(xué)性質(zhì)（如大小、內(nèi)部起來的對

2、細(xì)胞的物理或化學(xué)性質(zhì)（如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等）進(jìn)行快、蛋白質(zhì)、抗原等）進(jìn)行快速測量并可分類收集的高技術(shù)。速測量并可分類收集的高技術(shù)。30年代：設(shè)想使細(xì)胞檢測自動化年代：設(shè)想使細(xì)胞檢測自動化50- 60年代：分層鞘流原理、分光光度計定量細(xì)胞年代：分層鞘流原理、分光光度計定量細(xì)胞成分及結(jié)合測量值對細(xì)胞分類，提出細(xì)胞分選成分及結(jié)合測量值對細(xì)胞分類，提出細(xì)胞分選70年代：單克隆抗體技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)年代：單克隆抗體技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)1973年：第一臺商用流式細(xì)胞儀年：第一臺商用流式細(xì)胞儀FACS I發(fā)展方向：熒光染料的開發(fā)、細(xì)胞的制備方法、提發(fā)展方向：熒光染料的開發(fā)、細(xì)

3、胞的制備方法、提高電子信號的處理能力等高電子信號的處理能力等流式細(xì)胞儀的發(fā)展史流式細(xì)胞儀的發(fā)展史BD公司流式細(xì)胞儀公司流式細(xì)胞儀FACSCaliburLSRIIFACSCantoFACSCountFACSVantageFACSAriaMoFlo Astrios EQ 超高速流式分選系統(tǒng)超高速流式分選系統(tǒng)Gallios流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀Beckman公司流式細(xì)胞儀公司流式細(xì)胞儀Navios流式細(xì)胞分析系統(tǒng)流式細(xì)胞分析系統(tǒng) 測量速度快，最快可在測量速度快，最快可在1 1秒鐘內(nèi)計測數(shù)萬個細(xì)胞；秒鐘內(nèi)計測數(shù)萬個細(xì)胞； 可進(jìn)行多參數(shù)測量，可以對同一個細(xì)胞做有關(guān)物理（如大小、內(nèi)可進(jìn)行多參數(shù)測量，可以對同

4、一個細(xì)胞做有關(guān)物理（如大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)）、化學(xué)特性（如部結(jié)構(gòu)）、化學(xué)特性（如DNADNA、RNARNA）的多參數(shù)測量，并具有明）的多參數(shù)測量，并具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義；顯的統(tǒng)計學(xué)意義； 是一門綜合性的高科技方法，它綜合了是一門綜合性的高科技方法，它綜合了激光技術(shù)激光技術(shù)、計算機技術(shù)計算機技術(shù)、顯微熒光光度技術(shù)顯微熒光光度技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)免疫學(xué)技術(shù)、流體力學(xué)流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)細(xì)胞化學(xué)、圖像技術(shù)圖像技術(shù)等眾多領(lǐng)域的知識和成果；等眾多領(lǐng)域的知識和成果； 既是細(xì)胞分析技術(shù)，又是精確的分選技術(shù)既是細(xì)胞分析技術(shù)，又是精確的分選技術(shù)。細(xì)胞不被破壞，測量快速、大量、準(zhǔn)確、靈敏、定量流

5、式細(xì)胞術(shù)的特點流式細(xì)胞術(shù)的特點應(yīng)用應(yīng)用：細(xì)胞生物學(xué)，腫瘤學(xué)，血液學(xué)，免疫學(xué)，藥：細(xì)胞生物學(xué)，腫瘤學(xué)，血液學(xué)，免疫學(xué)，藥理學(xué)，遺傳學(xué)及臨床檢驗學(xué)等理學(xué)，遺傳學(xué)及臨床檢驗學(xué)等細(xì)胞組成細(xì)胞組成細(xì)胞功能細(xì)胞功能大小大小細(xì)胞表面細(xì)胞表面/ /胞漿胞漿/ /核核- -特異性抗原特異性抗原粒度粒度細(xì)胞活性細(xì)胞活性DNA, RNADNA, RNA含量含量胞內(nèi)細(xì)胞因子胞內(nèi)細(xì)胞因子蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量激素結(jié)合位點激素結(jié)合位點鈣離子鈣離子, PH, PH值值, , 膜電位膜電位酶活性酶活性流式細(xì)胞儀常檢測的細(xì)胞特性流式細(xì)胞儀常檢測的細(xì)胞特性 液流系統(tǒng)液流系統(tǒng) 光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng) 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)一、流式細(xì)胞技

6、術(shù)原理一、流式細(xì)胞技術(shù)原理1、流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)：、流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)： 由樣本和鞘液組成由樣本和鞘液組成 待測細(xì)胞待測細(xì)胞 單個細(xì)胞的懸液單個細(xì)胞的懸液 熒光染料標(biāo)記的單抗對其染熒光染料標(biāo)記的單抗對其染色色 受清潔氣體壓力受清潔氣體壓力 從樣品管進(jìn)入流動室形成樣本流從樣品管進(jìn)入流動室形成樣本流 鞘液：輔助樣本流被正常檢測的基質(zhì)液。主要作用是包裹樣鞘液：輔助樣本流被正常檢測的基質(zhì)液。主要作用是包裹樣本流的周圍，保持樣本流中細(xì)胞處于噴嘴中心位置，防止其本流的周圍，保持樣本流中細(xì)胞處于噴嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞噴孔?？拷妆诙枞麌娍?。（1）液流系統(tǒng)）液流系統(tǒng)Fluorescence

7、SignalFocused Laser BeamShealth Fluid液流系統(tǒng)示意圖液流系統(tǒng)示意圖Injector Tip樣本管鞘液管 激光光源：氣冷式氬離子激光器激光光源：氣冷式氬離子激光器 分色反光鏡：反射長分色反光鏡：反射長/ /短波長，通過短短波長，通過短/ /長波長長波長 光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡 透鏡組：形成平行光，除去室內(nèi)光透鏡組：形成平行光，除去室內(nèi)光 濾片：長通、短通、帶通濾片：長通、短通、帶通 光電倍增管：光電倍增管：FS, SSFS, SS（散射光），（散射光），F(xiàn)L1, FL2, FL3, FL4FL1, FL2, FL3,

8、FL4（熒光）（熒光）（2）光學(xué)系統(tǒng)）光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)示意圖光學(xué)系統(tǒng)示意圖 散射光的測定散射光的測定細(xì)胞在液柱中與激光束相交時向周圍細(xì)胞在液柱中與激光束相交時向周圍360360立體角方向立體角方向散射的光線信號，它的強弱與細(xì)胞的大小、形狀、胞內(nèi)顆散射的光線信號，它的強弱與細(xì)胞的大小、形狀、胞內(nèi)顆粒折射等有關(guān)，主要分為粒折射等有關(guān)，主要分為前向散射光前向散射光和側(cè)向散射光側(cè)向散射光。光信號的測定光信號的測定前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射細(xì)胞時，光以相對軸較小角度(0.510)向前方散射的訊號用于檢測細(xì)胞等粒子的表面屬性，信號強弱與細(xì)胞體積大小成正比。側(cè)向散射光（

9、side scatter, SS）：激光束照射細(xì)胞時，光以90角散射的訊號，用于檢測細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性。 測得的FS與SS信號通過計算機處理，可得到FS-SS圖，由此可僅用散射光信號對未染色的活細(xì)胞進(jìn)行分析或分選。 此為血細(xì)胞分類的基本原理，但不能分析表面分子。淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞中性粒細(xì)胞光散射測量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群 熒光信號由被檢細(xì)胞上標(biāo)記的特異性熒光染料受激發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長與激發(fā)光波長不同。每種熒光染料會產(chǎn)生特定波長的熒光和顏色，通過波長選擇通透性濾片，可將不同波長的散射光和熒光信號區(qū)分開，送入不同的光電倍增管。選擇不同的單抗及染料就可同時測定一個細(xì)胞上的多個不同

10、特征。線性放大器和對數(shù)放大器l熒光測定熒光測定l熒光補償熒光補償FITCAPCPEPerCP/Cy5.5每一種熒光分子都發(fā)射某一特定波長范圍內(nèi)的光，然而這些熒光的發(fā)射光譜會發(fā)生重疊，有時這種重疊現(xiàn)象非常顯著。熒光補償是指修正熒光滲漏的過程，如從探測器除去除匹配熒光以外的任何熒光信號。熒光補償熒光補償PEFITCPE+ cellsFITC + cellsTo do colour compensation:For Pure FITC+ cells, = PE signal - % FITC signalFor Pure PE+ cells,= FITC signal - % PE signalAf

11、ter compensationPEFITCPE+ cellsFITC + cellsGOOD compensation:Y-mean of the FITC cell = the Y-mean of -/- cellsX-mean of the PE cell = the X-mean of -/- cellsPEFITCPE+ cellsFITC + cellsOVER compensation細(xì)胞懸液形成液流柱流動室振動液流斷裂成液滴空白液滴含細(xì)胞的液滴棄去偏轉(zhuǎn)落入收集器壓電晶體產(chǎn)生機械振動不充電充電l細(xì)胞分選 分選速度：單位時間內(nèi)分選的細(xì)胞數(shù)量。與懸液分選速度：單位時間內(nèi)分選的細(xì)胞數(shù)量

12、。與懸液中細(xì)胞的含量成正比。中細(xì)胞的含量成正比。 分選純度：分選出的目的細(xì)胞占所有收獲細(xì)胞的分選純度：分選出的目的細(xì)胞占所有收獲細(xì)胞的百分率。百分率。 分選收獲率：實際收獲的分選細(xì)胞與設(shè)定通過測分選收獲率：實際收獲的分選細(xì)胞與設(shè)定通過測量點的分選細(xì)胞之間的比率。與純度成反比。量點的分選細(xì)胞之間的比率。與純度成反比。 分選得率：從一群體細(xì)胞懸液中分辨出目的細(xì)胞分選得率：從一群體細(xì)胞懸液中分辨出目的細(xì)胞的總量，再經(jīng)分選后得到目的細(xì)胞的實際得率。的總量，再經(jīng)分選后得到目的細(xì)胞的實際得率。與分選速度成反比。與分選速度成反比。分選的技術(shù)要求分選的技術(shù)要求（3）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)FS：反映顆粒的大

13、?。悍从愁w粒的大小SS：反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度：反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度FL：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少參數(shù)參數(shù) 單參數(shù)直方圖單參數(shù)直方圖 雙參數(shù)點圖、二維等高圖雙參數(shù)點圖、二維等高圖 三參數(shù)直方圖三參數(shù)直方圖 多參數(shù)分析多參數(shù)分析數(shù)據(jù)顯示方式數(shù)據(jù)顯示方式 由一維參數(shù)由一維參數(shù)(散射散射光或熒光光或熒光)與顆粒與顆粒計數(shù)計數(shù)(COUNT)構(gòu)構(gòu)成，反映同樣散成，反映同樣散射光或熒光強度射光或熒光強度的顆粒數(shù)量的多的顆粒數(shù)量的多少。少。單參數(shù)直方圖單參數(shù)直方圖雙參數(shù)點圖雙參數(shù)點圖 雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測量細(xì)胞的兩個測量參數(shù)，根據(jù)這兩個參數(shù)就可以確

14、定細(xì)胞在圖上的表達(dá)位置。 雙參數(shù)信號通常采用對數(shù)信號，最常用的是點密圖，在圖中，每個點代表一個細(xì)胞，點圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數(shù)量的多少。 用等高線來表示細(xì)胞數(shù)，在一條等高線上細(xì)胞數(shù)相同，不同的等高線上細(xì)胞數(shù)不同。二維等高圖二維等高圖三參數(shù)直方圖三參數(shù)直方圖 三維坐標(biāo)勻為參數(shù)（散射光或熒光）而非細(xì)胞數(shù)。 多參數(shù)分析：當(dāng)細(xì)胞標(biāo)記了多色熒光，被激發(fā)光激發(fā)后，得到的熒光信號和散射光信號可根據(jù)需要進(jìn)行組合分析。 一般利用所得參數(shù)的兩兩組合并利用設(shè)門（Gate)技術(shù)，來分析參數(shù)之間的相互關(guān)系。多參數(shù)分析多參數(shù)分析 Gate設(shè)置：指在某一張選定參數(shù)的直方圖上，根據(jù)該圖的細(xì)胞群分布選定其

15、中想要分析的特定細(xì)胞群，并要求該樣本所有其他參數(shù)組合的直方圖只體現(xiàn)這群細(xì)胞的分布情況。根據(jù)門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。 門（門（Gate）設(shè)置）設(shè)置A 淋巴細(xì)胞B 單核細(xì)胞C 中性粒細(xì)胞A、B、C均為任意門區(qū)閾（區(qū)閾（region, Rregion, R）與門）與門(gate, G ) (gate, G ) 是兩個相關(guān)的概念，區(qū)是兩個相關(guān)的概念，區(qū)閾可與門對應(yīng)，但是也可以包含于門。閾可與門對應(yīng)，但是也可以包含于門。Region設(shè)置設(shè)置D1 CD4+/CD3-D2 CD4+/CD3+D3 CD4- /CD3-D4 CD4- /CD3+如十字門分析時，就可

16、以由四個區(qū)域構(gòu)成，即G=D1+D2+D3+D4。 樣本制備：樣本制備：單細(xì)胞懸液單細(xì)胞懸液 標(biāo)記染色：標(biāo)記染色：光譜不重疊光譜不重疊 陰性對照的設(shè)置：陰性對照的設(shè)置：檢測標(biāo)本的重復(fù)性檢測標(biāo)本的重復(fù)性 質(zhì)量控制質(zhì)量控制 二、流式細(xì)胞儀免疫分析的技術(shù)要求二、流式細(xì)胞儀免疫分析的技術(shù)要求 外周血淋巴細(xì)胞樣品的制備：淋巴細(xì)胞分離液分離外周血外周血淋巴細(xì)胞樣品的制備：淋巴細(xì)胞分離液分離外周血中單個核細(xì)胞。中單個核細(xì)胞。FicollFicoll，40kd40kd，高密度，低滲透壓，無毒，高密度，低滲透壓，無毒性。（比重為性。（比重為1.01771.01770.0010.001的分層液的分層液) )樣本制備

17、樣本制備 利用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞后，得到外周血中所有白細(xì)胞的流式利用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞后，得到外周血中所有白細(xì)胞的流式細(xì)胞分析的二維散色光點圖。細(xì)胞分析的二維散色光點圖。 培養(yǎng)細(xì)胞的樣品制備：單層培養(yǎng)細(xì)胞加蛋白酶消化后吸管培養(yǎng)細(xì)胞的樣品制備：單層培養(yǎng)細(xì)胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法使細(xì)胞從培養(yǎng)皿上消化下來，然后離心漂洗。吹打的方法使細(xì)胞從培養(yǎng)皿上消化下來，然后離心漂洗。 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，可不用酶消化，直接吹打制備成單細(xì)胞懸懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，可不用酶消化，直接吹打制備成單細(xì)胞懸液。液。 新鮮實體組織單細(xì)胞懸液的制備新鮮實體組織單細(xì)胞懸液的制備u機械法：剪碎法、網(wǎng)搓法、研磨法。機械法：剪碎法、網(wǎng)

18、搓法、研磨法。u酶處理法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原酶等。酶處理法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原酶等。u化學(xué)試劑處理法：化學(xué)試劑處理法：EDTA、EGTA等。等。u表面活性劑處理法：表面活性劑處理法：Triton-x100、皂素等。、皂素等。防止細(xì)胞自溶，保持細(xì)胞膜原有的特性保存的方法：防止細(xì)胞自溶，保持細(xì)胞膜原有的特性保存的方法：1、深低溫保存法：深低溫冰箱，保存一年。、深低溫保存法：深低溫冰箱，保存一年。2、乙醇與甲醇保存法：、乙醇與甲醇保存法：70%冷乙醇、冷乙醇、75%的甲醇。的甲醇。3、甲醛或多聚甲醛固定法：細(xì)胞不具有生物活性，但、甲醛或多聚甲醛固定法：細(xì)胞不具有生物活性，但 細(xì)胞表面熒光

19、染色分析不受影響。細(xì)胞表面熒光染色分析不受影響。單細(xì)胞懸液的保存單細(xì)胞懸液的保存適用條件適用條件: : 有較高的量子產(chǎn)額和消光系數(shù)有較高的量子產(chǎn)額和消光系數(shù) 對對488nm488nm的激發(fā)光波長有較強的吸收的激發(fā)光波長有較強的吸收 發(fā)射光波長與激發(fā)光波長間有較大的波長差發(fā)射光波長與激發(fā)光波長間有較大的波長差 易與標(biāo)記單抗結(jié)合而不影響抗體的特異性易與標(biāo)記單抗結(jié)合而不影響抗體的特異性常用的熒光染料與標(biāo)記染色常用的熒光染料與標(biāo)記染色FITCTexas redPE.PC.APCPEcy5FL1FL2FL3FL4激光細(xì)胞細(xì)胞懸液懸液異硫氰酸熒光素異硫氰酸熒光素得州紅得州紅能量傳遞復(fù)合染料能量傳遞復(fù)合染料

20、藻膽蛋白類藻膽蛋白類幾種常見的熒光染料幾種常見的熒光染料名稱名稱染料染料激發(fā)激發(fā)波長波長熒光顏熒光顏色色溶解性溶解性對對PH敏敏感性感性特點特點異硫氰酸熒光素FITC488綠綠 525易敏感易溶于水，與抗體結(jié)合不影響特異性得州紅Texas red568紅紅 615不易不敏感穩(wěn)定，偶聯(lián)后量子產(chǎn)額低藻紅蛋白PE488橙橙575易不敏感具較多發(fā)光基團(tuán)，消光系數(shù)和量子產(chǎn)額高藻青蛋白PC488別藻青蛋白APC633紅紅670能量傳遞復(fù)合染料PEcy5488紅紅670易不敏感減少交叉，成本高常用的幾類熒光染料常用的幾類熒光染料 用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長的染料結(jié)合在一起，在用化學(xué)法將兩種不同激發(fā)波長的染料

21、結(jié)合在一起，在488nm488nm激發(fā)光照射下，通過一個熒光染料被激發(fā)后產(chǎn)生的激發(fā)光照射下，通過一個熒光染料被激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長再激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生熒光信號，從而檢測到發(fā)射波長再激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生熒光信號，從而檢測到該特定熒光信號。該特定熒光信號。能量傳遞復(fù)合染料能量傳遞復(fù)合染料Laser488nmPECY5CY5CY5488nm575nm670nm紅色熒光花青苷5藻紅蛋白能量傳遞復(fù)合染料機制熒光染料與細(xì)胞成分的四種結(jié)合方式結(jié)構(gòu)親和式嵌入結(jié)合共價鍵結(jié)合熒光標(biāo)記抗體特異性結(jié)合免疫熒光標(biāo)記方法直標(biāo):干擾少,但需購買多種單抗間標(biāo):步驟多,干擾多,不需標(biāo)記多種抗體組合標(biāo)記：免疫熒光標(biāo)記免疫熒光標(biāo)

22、記FITC+PE 488 525 、575 綠色、橙色綠色、橙色FITC+T red 488 525 綠色綠色 568 615 紅色紅色FITC+PeCy5 488 525、 675 綠色、綠色、 紅色紅色FITC+ ECD 488 525、 625 綠色、橙紅色綠色、橙紅色F+P +PeCy5 488 525、575、675 綠、橙、綠、橙、紅色紅色F+ ECD +PeCy5 488 525、575、675 綠、綠、 橙紅色、橙紅色、紅色紅色F+P+APC 488 525 、 575 綠色、橙色綠色、橙色 633 670 紅色紅色熒光染料熒光染料 激發(fā)波長（激發(fā)波長（nm) 發(fā)射波長（發(fā)射波

23、長（nm) 顏色顏色雙或多參數(shù)熒光抗體的組合標(biāo)記雙或多參數(shù)熒光抗體的組合標(biāo)記 適當(dāng)?shù)闹苽浞绞竭m當(dāng)?shù)闹苽浞绞?處理紅細(xì)胞處理紅細(xì)胞 實體組織來源標(biāo)本用機械法實體組織來源標(biāo)本用機械法 溫度溫度25-3725-37，PH7.0-7.2PH7.0-7.2質(zhì)量控制質(zhì)量控制單細(xì)胞懸液制備的質(zhì)控單細(xì)胞懸液制備的質(zhì)控免疫熒光染色的質(zhì)控免疫熒光染色的質(zhì)控 溫度溫度 PHPH 染料濃度染料濃度 固定劑固定劑 光路與流路校正光路與流路校正: : 確保激光光路與樣品流處于正交狀確保激光光路與樣品流處于正交狀態(tài)，減少變異（態(tài)，減少變異（CVCV）。）。 PMTPMT（光電倍增管）校準(zhǔn)（光電倍增管）校準(zhǔn): : 保證樣品檢

24、測時儀器處于保證樣品檢測時儀器處于最佳靈敏度工作狀態(tài)。最佳靈敏度工作狀態(tài)。 絕對計數(shù)校準(zhǔn)絕對計數(shù)校準(zhǔn): : 保證計數(shù)的準(zhǔn)確性。保證計數(shù)的準(zhǔn)確性。儀器操作的質(zhì)控儀器操作的質(zhì)控同型對照：即免疫熒光標(biāo)記中的陰性對照，選用相同源性的同型對照：即免疫熒光標(biāo)記中的陰性對照，選用相同源性的未標(biāo)未標(biāo)記單抗記單抗作為對照調(diào)整和設(shè)置電壓，以保證特異性。作為對照調(diào)整和設(shè)置電壓，以保證特異性。全程質(zhì)量控制：在流式檢測中，樣品標(biāo)記、溶血、洗滌、儀器質(zhì)全程質(zhì)量控制：在流式檢測中，樣品標(biāo)記、溶血、洗滌、儀器質(zhì)量控制和上機檢測的過程都會直接影響檢測結(jié)果。采用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控量控制和上機檢測的過程都會直接影響檢測結(jié)果。采用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控樣品

25、來進(jìn)行全程質(zhì)控，使得同類實驗室建立質(zhì)控比對，數(shù)據(jù)可以樣品來進(jìn)行全程質(zhì)控，使得同類實驗室建立質(zhì)控比對，數(shù)據(jù)可以互用?；ビ?。免疫檢測的質(zhì)控免疫檢測的質(zhì)控三、流式細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用三、流式細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用以細(xì)胞免疫功能測定為例以細(xì)胞免疫功能測定為例 淋巴細(xì)胞亞群淋巴細(xì)胞亞群 活化的活化的T T淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞 抗原特異性免疫細(xì)胞抗原特異性免疫細(xì)胞 調(diào)控性調(diào)控性T T細(xì)胞細(xì)胞 樹突狀細(xì)胞樹突狀細(xì)胞 先天免疫細(xì)胞先天免疫細(xì)胞淋巴細(xì)胞亞群T淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞(CD3+)名名 稱稱功功 能能輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞(Th/Ti)輔助和誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫 CD3+CD4+CD29+ CD3+CD4+CD29-輔助性T細(xì)胞

26、(Th)誘導(dǎo)性T細(xì)胞(Ti)輔助細(xì)胞免疫和體液免疫誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫抑制性/殺傷性T細(xì)胞(Ts/Tc)抑制免疫反應(yīng)/殺傷異源細(xì)胞 CD3+CD8+CD28- CD3+CD4+CD29-抑制性T細(xì)胞(Ts)殺傷性T細(xì)胞(Tc)抑制細(xì)胞和體液免疫細(xì)胞毒性T細(xì)胞CD3+CD4+CD8+活化的T細(xì)胞在T細(xì)胞惡性增生時升高 CD3+CD4-CD8- 有調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞,其表達(dá) / T細(xì)胞受體(TCR / ) CD45RA+CD45RO- 幼稚的/靜止的T淋巴細(xì)胞 當(dāng)免疫系統(tǒng)沒有能力更新輔助性或抑制性/細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的祖細(xì)胞時此細(xì)胞亞群較低 CD45RA-CD45RO+ 記憶性T淋巴細(xì)胞 病菌感染時

27、升高, 但在慢性病毒感染, 如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+ 活化的T細(xì)胞, 感染時升高 感染時升高淋巴細(xì)胞亞群淋巴細(xì)胞亞群活化活化T淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞名名 稱稱功功 能能CD3+HLA-DR+活化T細(xì)胞CD4+HLA-DR+ 活化的輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞CD8+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細(xì)胞CD4+CD25+ 活化的輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞CD8+ CD25+ CD8+CD38+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細(xì)胞在病毒感染的患者中增加; 其增加意味著HIV患者的預(yù)后較差CD19+CD23+ 活化的B細(xì)胞過敏患者中升高 CD19+CD5+ 在自身免疫性疾病中升高 CD19+CD5+CD23+ 慢性B細(xì)胞白血病及單克隆B淋巴細(xì)胞 自身免疫性疾病時降低, 而病毒感