葡萄糖酸鈣口服液的微生物總數(shù)檢查

1、實(shí)訓(xùn)五實(shí)訓(xùn)五 雙黃連口服液微生物總雙黃連口服液微生物總數(shù)檢查數(shù)檢查（一）實(shí)訓(xùn)目的（一）實(shí)訓(xùn)目的1、掌握雙黃連口服液中細(xì)菌和真菌總數(shù)的、掌握雙黃連口服液中細(xì)菌和真菌總數(shù)的檢查方法與操作。檢查方法與操作。 2、學(xué)會(huì)供試品的處理方法及學(xué)會(huì)菌落計(jì)數(shù)、學(xué)會(huì)供試品的處理方法及學(xué)會(huì)菌落計(jì)數(shù)方法方法 。非規(guī)定滅菌藥劑一般不要求絕對(duì)無(wú)菌，但必須非規(guī)定滅菌藥劑一般不要求絕對(duì)無(wú)菌，但必須控制微生物的數(shù)量在一定的范圍內(nèi)，并保證不控制微生物的數(shù)量在一定的范圍內(nèi)，并保證不含有特定的控制（致病）菌。含有特定的控制（致?。┚?0102010年版年版中國(guó)藥典中國(guó)藥典規(guī)定采用規(guī)定采用平皿法平皿法和和薄膜薄膜過(guò)濾法過(guò)濾法進(jìn)行藥品

2、的細(xì)菌、真菌及酵母菌計(jì)數(shù)檢進(jìn)行藥品的細(xì)菌、真菌及酵母菌計(jì)數(shù)檢查。本實(shí)驗(yàn)以葡萄糖酸鈣口服液為材料進(jìn)行平查。本實(shí)驗(yàn)以葡萄糖酸鈣口服液為材料進(jìn)行平皿法計(jì)數(shù)。皿法計(jì)數(shù)。（三）材料和用具（三）材料和用具 1 1器材、設(shè)備器材、設(shè)備 （1）設(shè)備：無(wú)菌室、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、電熱干燥箱、高壓蒸汽滅菌器、菌落計(jì)數(shù)器、天平（感量0.1g）。 （2）器材：橡皮乳頭、酒精燈、乙醇棉球、乳膠手套、試管架、火柴、記號(hào)筆；無(wú)菌衣、褲、帽、口罩（也可用一次性物品替代）；研缽或勻漿儀、量筒、稱(chēng)量紙及不銹鋼藥匙；試管及塞子、刻度吸管（1、10ml）、錐形瓶、培養(yǎng)皿、玻璃或搪瓷消毒缸（帶蓋）。 玻璃器皿均于160干熱滅

3、菌2小時(shí)或高壓蒸汽滅菌121 20分鐘，烘干備用。（三）材料和用具（三）材料和用具 2 2試劑及培養(yǎng)基試劑及培養(yǎng)基（1）雙黃連口服液為供試品。（2）消毒劑：0.2%苯扎溴銨溶液、75%乙醇溶液（制乙醇棉球用）、3%5%甲酚溶液、5%甲醛、高錳酸鉀等。（3）稀釋劑：pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或pH6.8磷酸鹽緩沖液（附錄三）。（4）培養(yǎng)基：分別按照營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基配方（附錄二）配制實(shí)驗(yàn)所需培養(yǎng)基，過(guò)濾、分裝后滅菌。 （四）操作步驟（四）操作步驟 1供試品溶液的制備供試品溶液的制備 取一定量（10ml）的待檢藥品，置于無(wú)菌研缽中以pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖溶液（均需

4、事先滅菌）研磨成勻漿，然后移入容量瓶?jī)?nèi)加緩沖液至100ml，即成1:10的供試液。2供試液的稀釋?zhuān)ü┰囈旱南♂專(zhuān)?0倍遞增稀釋法）倍遞增稀釋法） 取23支滅菌試管，分別加入9ml稀釋液，并取1支1ml滅菌吸管吸取1:10均勻供試液1ml，加入已裝有9ml滅菌稀釋劑的試管中，混勻即成1:100的供試液。以此類(lèi)推，稀釋至1:1000或1:10 000。3注平板、倒培養(yǎng)基注平板、倒培養(yǎng)基 用滅菌移液管（每一稀釋度用1支）分別吸取不同稀釋度的稀釋液1ml，置于每一無(wú)菌平皿中（每一稀釋度做23個(gè)平皿），再于每一平皿中傾注1520ml的溫度不超過(guò)45的細(xì)菌、真菌或酵母菌計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基（細(xì)菌計(jì)數(shù)用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)

5、基；真菌及酵母菌計(jì)數(shù)用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基），快速轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使稀釋液與培養(yǎng)基均勻混合，放置，待凝。（四）操作步驟（四）操作步驟 4陰性對(duì)照試驗(yàn)陰性對(duì)照試驗(yàn) 取試驗(yàn)用的稀釋液1ml，置無(wú)菌平皿中，注入培養(yǎng)基，均勻混合，凝固。每種計(jì)數(shù)用的培養(yǎng)基各制備2個(gè)平板，均不得有菌生長(zhǎng)。5培養(yǎng)培養(yǎng) 將已經(jīng)凝固的平板倒置，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基放3035培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基和酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基放入2328培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天。6菌落計(jì)數(shù)菌落計(jì)數(shù) 除另有規(guī)定外，細(xì)菌培養(yǎng)3天，真菌、酵母菌培養(yǎng)5天，逐日點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，必要時(shí)可適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至7天進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并報(bào)告。菌落蔓延生長(zhǎng)成片的平板不宜計(jì)數(shù)。點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)

6、后，計(jì)算各稀釋級(jí)供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌數(shù)。一般營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細(xì)菌計(jì)數(shù)；玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基用于真菌及酵母菌計(jì)數(shù)；酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于酵母菌計(jì)數(shù)。在特殊情況下，若營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)有真菌和酵母菌、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)有細(xì)菌，則應(yīng)分別點(diǎn)計(jì)真菌和酵母菌、細(xì)菌菌落數(shù)。然后將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的真菌和酵母菌數(shù)或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上的細(xì)菌數(shù)與玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基中的真菌和酵母菌數(shù)或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的細(xì)菌數(shù)進(jìn)行比較，以菌落數(shù)高的培養(yǎng)基中的菌數(shù)為計(jì)數(shù)結(jié)果。（四）操作步驟（四）操作步驟 7菌數(shù)報(bào)告菌數(shù)報(bào)告 細(xì)菌、酵母菌選取平均菌落數(shù)小于300cfu，真菌宜選取平均菌落數(shù)小于100c

7、fu的稀釋級(jí)作為菌數(shù)報(bào)告（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。以最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告1g、1ml或10cm2供試品中所含的菌數(shù)。 如各稀釋級(jí)的平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)，或僅最低稀釋級(jí)的平板有菌落生長(zhǎng)，但平均菌落數(shù)小于1時(shí)，以1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。檢品名稱(chēng)生產(chǎn)廠家檢品規(guī)格生產(chǎn)批號(hào)檢品數(shù)量包裝和外觀檢驗(yàn)項(xiàng)目微生物總數(shù)檢驗(yàn)依據(jù)2010年版中國(guó)藥典 部 附錄檢驗(yàn)方法平皿法 檢驗(yàn)結(jié)果細(xì)菌數(shù)（營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，3035培養(yǎng)3天）真菌、酵母菌數(shù)（玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，2328培養(yǎng)5天）10-110-210-3陰性對(duì)照10-110-210-3陰性對(duì)照123平均值結(jié)果檢驗(yàn)結(jié)論檢驗(yàn)人： 復(fù)核人：室溫： 濕度：1供試品檢驗(yàn)全過(guò)程必須符合無(wú)菌技術(shù)要求。2傾注和搖動(dòng)應(yīng)盡量平穩(wěn)，勿使培養(yǎng)基外溢，確保細(xì)菌分散均勻。3傾注時(shí)培養(yǎng)基溫度不得超過(guò)45，以防損傷細(xì)菌或真菌。4管尖不接觸任何可能污染的容器或用具。5稀釋時(shí)每一級(jí)換管（原吸管不要吹吸）的上一級(jí)吸管不能接觸下一級(jí)稀釋液。6吸管快速吹打，不能用嘴吹吸，吸管內(nèi)放棉花。7取液要準(zhǔn)確，盡量減少