O-GlcNAc修飾在谷氨酰胺誘導(dǎo)熱休克蛋白表達(dá)中作用研究

1、谷氨酰胺通過 O-GlcNAc 修飾機(jī)制誘導(dǎo)熱休克蛋白表達(dá)東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 210009龔俊松，景亮【摘要】目的：本研究觀察谷氨酰胺Gin誘導(dǎo)熱休克蛋白70 HSP70表達(dá)對(duì)脂 多糖LPS刺激乳鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及氧連 -N-乙酰葡萄糖胺0-GlcNAc 修飾在Gin誘導(dǎo)HSP70表達(dá)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用。 方法：原代培養(yǎng)SD乳鼠 心肌細(xì)胞后依據(jù)培養(yǎng)基內(nèi)參加成分分五組：對(duì)照組 C 組給予雙蒸水； LPS 組LPS 4ug/ml ； GL 組Gin 5mM +LPS 4ug/ml ； GLA 組Gin 5mM+LPS 4ug/ml+Alloxan 1mM, Alloxan為O連-N-乙酰葡

2、萄糖胺氨基轉(zhuǎn)移酶OGT抑制劑， 能減少 O-GlcNAc 修飾水平；GLP 組Gln 5mM+LPS 4ug/ml+PUGNAc 100uM, PUGNAc為O-連N-乙酰葡萄糖苷酶OGA抑制劑，能增加O-GlcNAc修飾水平。 上述 5 組細(xì)胞孵育 6h 后，以臺(tái)盼藍(lán)拒染法測定細(xì)胞生存率；比色法測定細(xì)胞培 養(yǎng)液 LDH 水平反映心肌細(xì)胞損傷情況 ； Western Blotting 分析心肌細(xì)胞 HSP70 蛋白水平、胞核熱休克因子-1 HSF-1蛋白水平和O-GlcNAc修飾水平；電泳 遷徙率變動(dòng)實(shí)驗(yàn)electrophoretic mobility shift assay EMSA 測定心

3、肌細(xì)胞核 HSF-1 轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果：各組細(xì)胞生存率無顯著性變化。 結(jié)果： 與 C 組相比， LPS組細(xì)胞損傷顯著增加pv.05,但在Gin+LPS組這種心肌細(xì)胞損傷得到明顯 恢復(fù)pv.05。與C組相比，LPS組的心肌細(xì)胞O-GlcNAc修飾水平、HSP70蛋 白表達(dá)、胞核 HSF-1 蛋白表達(dá)及轉(zhuǎn)錄活性，明顯增加 p<.05； Gln+LPS 組的 O-GlcNAc修飾水平、HSP70蛋白表達(dá)、胞核HSF-1蛋白表達(dá)及轉(zhuǎn)錄活性與 LPS 組相比更進(jìn)一步增加pv.05。Gin在LPS刺激心肌細(xì)胞的上述作用可為 Alloxan 完全抑制GLA組，同時(shí)也可為PUGNAc所逆轉(zhuǎn)GLP組。結(jié)論：

4、LPS刺激 乳鼠心肌細(xì)胞給予Gin治療，可通過增加O-GIcNAc修飾水平，增加核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因 子HSF-1水平及轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而促進(jìn) HSP70的蛋白表達(dá)。增強(qiáng)O連-N-乙酰葡 萄糖胺氨基轉(zhuǎn)移酶和O-連N-乙酰葡萄糖苷酶活性可能是膿毒血癥治療的另一潛 在治療學(xué)靶點(diǎn)?！娟P(guān)鍵詞】 谷氨酰胺、O-GIcNAc修飾、HSP70 HSF-1【AbstractAIMS: To investigate the protective effect of glutamine-induced heat shock proteins(HSP) expression in LPS-treated rat cardiocy

5、tes and whether its possible molecular mechanisms are relative to enzyme activities of O-linked 3-N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) modification pathway.METHODS: Primary cultures of neon atal rat cardiocytes were divided in to con trol (treated with double distilled water), LPS (lipopolysaccharide, 4 卩

6、 g/ml),Gln+LPS (Gln 5mM+LPS 4 卩 g/ml),Gln+LPS+Alloxa n(an inhibitor of O-linked 0N-acetyl glucosamine transferase/OGT, 1mM), and Gin+LPS+PUGNAc (an inhibitor of O-linked &N-acetyl glucosaminidase/OGA, 1 卩 M ) groups. Aften6 incubation, cell viability was measured by Trypa n blue exclusi on metho

7、d and cell n ecrosis was assessed by detect ing the release of lactate dehydroge nase(LDH) in culture medium in all groups, respectively. The levels of HSP70 expression, endonuclear heat shock factor 1(HSF-1) expression, and O-GlcNAc modification from cardiocytes were analyzed by Western blotting. H

8、SF-1 transcriptional activity of cardiocytes was determined by electrophoretic mobility shift assay ( EMSA) in all groups, respectively. Data were presented as meanstandard deviation. Statistical analysis were performed using one-way ANOVA. Statistical significance was assigned at a P value of less

9、than 0.05.RESULTS: There were no significant differences in cell viability among five groups. LDH levels in culture medium were low in the control group but markedly increased in the LPS group (P<0.05). Treatment with Gln (Gln+LPS group) significantly decreasedLPS-induced cardiocytes damage (P<

10、;0.05), and this protective action by Gln could be mimicked with PUGNAc (in Gln+LPS+PUGNAc group) or banished with alloxan (in Gln+LPS+Alloxan group). HSP 70 levels, endonuclear HSF-1 levels, O-GlcNAc modification levels, and HSF-1 transcriptional activity from cardiocytes were significantly increas

11、ed in the LPS group compared with control group. Treatment with Gln (Gln+LPS group) further increased HSP70 levels, endonuclear HSF-1 levels, O-GlcNAc modification levels and HSF-1 transcriptional activity in cardiocytes (P<0.05). The above-mentioned action by Gln also could be mimicked with PUGN

12、Ac (in Gln+LPS+PUGNAc group) or banished with alloxan (in Gln+LPS+Alloxan group) .CONCLUSION: Glutamine induces HSP expression and protects against LPS-induced necrosis in rat cardiocytes. The molecular mechanism of Gln-mediated HSP70 expression appearsto be dependent on the enzyme activities of O-G

13、lcNAc pathway and that augmentation of enzyme activities may have potential therapeutic effects in sepsis.【 Key words】Glutamine,O-GlcNAc modification, Heat shock protein 70,Heat shock factor-1谷氨酰胺 (glutamine，Gln) 是人血中含量最豐富的一種氨基酸， 約占體內(nèi)總游 離氨基酸的50%。Gin作為蛋白質(zhì)和肽的組分，在參與機(jī)體新陳代謝，維持機(jī)體 酸堿平衡，調(diào)控機(jī)體免疫機(jī)能，保護(hù)細(xì)胞及臟器功能等方

14、面發(fā)揮了重要作用， 被稱為“條件必需氨基酸 11。熱休克蛋白(heat shock protein , HSP)是體內(nèi)具有 高度保守性的一類蛋白質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)Gln能誘導(dǎo)HSP表達(dá)【2】【3】，我們前期研究 也說明， Gin 能增加休克大鼠的 HSP70 表達(dá)，減少炎癥因子的釋放，改善血管 反響性【4】，但是機(jī)制未明。蛋白質(zhì)氧連-N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc )修飾是一種發(fā)生在細(xì)胞漿、細(xì)胞 核內(nèi)的糖基化方式，它是一種廣泛的、動(dòng)態(tài)的翻譯后修飾現(xiàn)象，通過 O 位糖苷 鍵將單個(gè)N-乙酰氨基葡萄糖連接到絲氨酸或蘇氨酸的羥基上 5。在O-GlcNAc 修飾過程中，OGT(N-乙酰葡萄糖胺糖基轉(zhuǎn)移酶)

15、負(fù)責(zé)在裸露蛋白絲氨酸或蘇氨 酸的羥基上加上O位糖基，Alloxon為OGT酶抑制劑【6】；OGA (N-乙酰葡萄糖 胺糖苷酶，O-GlcNAcase)負(fù)責(zé)將O位糖基移除，PUGNAc為OGA酶抑制劑【7】。 在應(yīng)激時(shí)， O 位糖基化能敏感地感受外界環(huán)境的變化，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的相互作用， 在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞周期、應(yīng)激及多種疾病中起重要調(diào)控 作用【8】。我們假設(shè) LPS 刺激乳鼠原代心肌細(xì)胞給予 Gln 后能對(duì)細(xì)胞的 O-GlcNAc 修 飾水平產(chǎn)生影響，并對(duì)HSP轉(zhuǎn)錄因子熱休克轉(zhuǎn)錄因子1( HSF-1)產(chǎn)生影響，進(jìn) 而影響HSP基因的表達(dá)，產(chǎn)生相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)。材料和方法： 本實(shí)驗(yàn)涉

16、及心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)，需要使用新生乳鼠，實(shí)驗(yàn)經(jīng)過東南大學(xué)動(dòng) 物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，嚴(yán)格執(zhí)行動(dòng)物保護(hù)相關(guān)條例。1. 心肌細(xì)胞培養(yǎng)：出生 48h 的 SD 乳鼠(東南大學(xué)動(dòng)物中心) ，取心臟用酶消化法制備心肌細(xì) 胞單細(xì)胞懸液，以差速貼壁法別離純化心肌細(xì)胞，參加含10%小牛血清(杭州四季青)的高糖型 MDEM (GIBCO)培養(yǎng)液，按3*106個(gè)細(xì)胞/瓶接種于50ml 培養(yǎng)瓶(Corni ng, USA),置于37C含5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，約3-4天后細(xì)胞 至對(duì)數(shù)生長期，到達(dá) 80%融合，并出現(xiàn)明顯的搏動(dòng)現(xiàn)象，開始給予干預(yù)措施。 實(shí)驗(yàn)分5組，C組、L組、GL組、GLA組、GLP組，分別給與雙蒸水 50

17、ul、Gin (Amersham) 5mM、LPS( sigma) 4 血/ml、Gln 5mM+ LPS 4 血/ml、Gln 5mM+ LPS 4 血/ml +Alloxan 1mM , Gln 5mM+ LPS 4 血/ml +PUGNAc 100uM。繼續(xù)培養(yǎng) 6h 后測定相關(guān)指標(biāo),并提取細(xì)胞蛋白。2. 心肌細(xì)胞生存率測定和細(xì)胞培養(yǎng)液 LDH 活力測定：用臺(tái)盼藍(lán)拒染法測定上述各組干預(yù)后 6h心肌細(xì)胞生存率，取10ul細(xì)胞懸液 混合混合 0.04%臺(tái)盼藍(lán)染色液, 計(jì)數(shù)至少 200個(gè)細(xì)胞計(jì)算細(xì)胞生存率。 心肌細(xì)胞 壞死時(shí)能釋放 LDH ,故通過測定細(xì)胞培養(yǎng)液 LDH 含量能一定程度反響細(xì)胞

18、壞死 情況,使用 LDH 試劑盒(南京建成)以比色法測定相關(guān)數(shù)據(jù),依據(jù)說明書公式 計(jì)算出各組細(xì)胞培養(yǎng)液 LDH 活力。3. Western Blotting 法測定干預(yù)后 6h HSP70 HSF-1、O-GlcNAc 蛋白含量水平：3.1以各組細(xì)胞HSP70水平為例，細(xì)胞干預(yù)后6h使用細(xì)胞裂解液(P0013, Beyotime)于冰上裂解心肌細(xì)胞，高速離心取上清獲得細(xì)胞總蛋白。HSP70的測定采用變性SDS-PAGE法，各組樣品加于事先制備好的 SDS-PAGE凝膠，上 層膠濃度5%,80V電壓通電約30min，下層膠濃度8%, 120V電壓通電約60min 以別離蛋白。以半干轉(zhuǎn)膜儀將凝膠上

19、蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶(光明牌，上海)封閉1h, 4C下1： 5000 HSP70小鼠單克隆抗體(ab5442, abcam, American孵育過夜，用PBST洗膜約10min*3-5次，1: 5000含辣根過氧化物 酶的二抗孵育1h,用PBST洗膜約10min*3-5次,ECL法與含蛋白及抗體的PVDF 膜反響，暗室壓片曝光，洗出膠片。3.2細(xì)胞核內(nèi)HSF-1蛋白的測量先用細(xì)胞核、細(xì)胞漿蛋白提取試劑盒P0027, Beyotime提取心肌細(xì)胞核蛋白，后續(xù)過程與HSP70的測定相似。其一抗為大鼠HSF-1單克隆抗體ab19913, abeam, American,二抗為辣根過氧

20、化物酶標(biāo) 記山羊抗大鼠IgGH+LZB2307,北京中山金橋。3.30-GlcNAc蛋白水平測定采用非變性 SDS-PAGE法電泳別離蛋白，上層 膠濃度5%，下層膠濃度6%，其余步驟與HSP70水平測定相似。其一抗為小鼠 單克隆抗O-GlcNAc CTD110.6，abeam, American，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo) 記山羊抗小鼠IgG H+LZB2305,北京中杉金橋。3.4內(nèi)參選用抗Tubulin小鼠單克隆抗體AT819，Beyotime，具體測量方 法與HSP70 致。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三遍以上，各組實(shí)驗(yàn)得到的膠片用成像系統(tǒng) Labworks， America n進(jìn)行拍照，并采用 tot

21、allab2.0 Phoretix In ter natio nal，En gla nd 軟 件進(jìn)行分析。4. 電泳遷移率變動(dòng)實(shí)驗(yàn) Electrophoretic mobility shift assay ， EMSA：該方法用來測定 HSF-1 這一轉(zhuǎn)錄因子與其特定 HSE 序列的結(jié)合活性。 HSE 探針采用如下序列 GCCTCGATTGTTCGCGAAGTTTCG 上海生工生物公司合 成。同位素使用-32PATP 5,000Ci/mmol at 10mCi/ml北京雙源，EMSA 步 驟按照EMSA/Gel-Shift試劑盒Beyotime說明書進(jìn)行，依次進(jìn)行標(biāo)記探針， 配置 EMSA 膠

22、， EMSA 結(jié)合反響等步驟。以 0.5XTBE 作為電泳液進(jìn)行電泳， 所得凝膠緊貼膠片，于-80C曝光24-72h，洗片并用成像系統(tǒng)拍照，totallab2.0(Phoretix In ter natio nal, En gla nd) 軟件進(jìn)行分析，通過比擬各組條帶灰度值 HSF-1轉(zhuǎn)錄活性。5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)均以均值一標(biāo)準(zhǔn)差(xs)表示，組間數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0軟件(SPSS inc Chicago)行單因素方差分析，采用 Prism4.0軟件(GraphPad software, San Diego)作圖，Pv 0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.各組細(xì)胞不同干預(yù)后6h細(xì)胞生存率

23、及培養(yǎng)液LDH活力變化(=?m Ha100-8 7 353210 o o 9 9 9 9 & 9 9 9 9LGL2000*15001000*500-Fig! 各組心肌細(xì)胞生存率及細(xì)胞培養(yǎng)液LDH活力. 谷氨St胺顯著減少LPS造成的心肌細(xì)胞1DH釋放梆這 種作用可被Al loxan削弱或被PUGNAc模擬。* PV 0. 05 vs G組：$ PV0. 05 vs L組：# PV0. 05 vs GL組口C=controlL=LPSGLA=Gln+LPS+Alioxar»GLP=Gln+LPS+PUGNAcrnmn GL=Gln+LPS各組心肌細(xì)胞干預(yù)后 6h 生存率無統(tǒng)計(jì)

24、學(xué)差異。細(xì)胞培養(yǎng)液 LDH 活力在一 定程度上能反映心肌細(xì)胞的壞死情況。從 Fig1 可以看出，與 C 組相比，其余四 組L組、GL組、GLA組、GLP組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液LDH活力明顯增高Pv0.05 , *表示；與L組相比，Gln能減少心肌細(xì)胞LDH釋放GL組，Pv0.05, $表 示。與 GL 組相比， Alloxan 能使細(xì)胞培養(yǎng)液 LDH 活力顯著增高 GLA 組， P v 0.05 , #表示。2.Gln增強(qiáng)LPS刺激心肌細(xì)胞HSP70蛋白表達(dá)水平、胞核 HSF-1水平及轉(zhuǎn)錄活 性、 O-GlcNAc 修飾水平。從圖Fig2A中可以看出，同C組相比，L、GL組HSP70的表達(dá)水平都有不

25、 同程度的提高Pv 0.05，以*表示。與L組相比，Gln能顯著提高HSP70的蛋 白表達(dá)水平GL組，Pv 0.05 ,以$表示。為了弄清該機(jī)制，我們研究了 HSP70 的轉(zhuǎn)錄因子HSF-1的表達(dá)情況。本實(shí)驗(yàn)HSP70的表達(dá)水平與心肌細(xì)胞核 HSF-1 水平及轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)。與 C組相比，L、GL組胞核HSF-1水平Fig2B及轉(zhuǎn) 錄活性Fig2C不同程度提高Pv 0.05，以*表示。與L組相比，GL組胞核 HSF-1水平及轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)Pv 0.05，以$表示。圖 Fig2D 反映心肌細(xì)胞 O-GlcNAc 修飾水平,圖中從低分子量到高分子量 蛋白中許多蛋白質(zhì)都存在 O-GlcNAc 修飾現(xiàn)象,

26、 故整張膠片上出現(xiàn)多處條帶。 將 整張膠片取五處樣,分別測定灰度值,相加后再予以標(biāo)化來說明每組的 O-GlcNAc 修飾水平。 與 C 組相比, L 組及 GL 組的 O 位糖基化修飾水平都有不 同程度的升高。與 L 組相比, GL 組 O-GlcNAc 蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步提高 Pv 0.05，以$表示。上述結(jié)果與干預(yù)后HSP70蛋白水平的變化趨勢保持一致，這 一點(diǎn)似乎暗示O-GIcNAc修飾水平與HSP70的表達(dá)水平具有某種聯(lián)系。3.Alloxan、PUGNAc干預(yù)后各組細(xì)胞 O-GIcNAc、HSP70蛋白水平及胞核 HSF-1 蛋白表達(dá)水平為了進(jìn)一步探討O-GIcNAc修飾在Gln誘導(dǎo)H

27、SP70表達(dá)機(jī)制中的作用，我 們在GL組的根底上運(yùn)用了對(duì)O-GIcNAc糖基化關(guān)鍵酶產(chǎn)生作用的藥物 Alloxan、 PUGNAc。其中Alloxan為OGT酶抑制劑，PUGNAc為OGA酶抑制劑。從Fig2D 可以看出，在給予Alloxan后心肌細(xì)胞O-GIcNAc修飾水平顯著減少Pv0.05, 以#表示，在給予PUGNAc后O-GIcNAc修飾水平顯著提高Pv 0.05，以#表 示。與此同時(shí)，心肌細(xì)胞核 HSF-1水平Fig2B及轉(zhuǎn)錄活性Fig2C在給予 O-GlcNAc 糖基化關(guān)鍵酶抑制劑后也發(fā)生變化,給予 Alloxan 后,心肌細(xì)胞核內(nèi) HSF-1表達(dá)水平降低，轉(zhuǎn)錄活性降低Pv 0.

28、05，以#表示；給予PUGNAc后心 肌細(xì)胞胞核 HSF-1 水平增高,轉(zhuǎn)錄活性提高,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義Pv0.05,以#表示。HSP70的變化趨勢Fig2A與心肌細(xì)胞核內(nèi) HSF-1表達(dá)水平Fig2B 一致，GLA組HSP70水平明顯減低，GLP組HSP70水平明顯升高，其差異有 統(tǒng)計(jì)學(xué)意義Pv 0.05，以#表示。A. WesiHTi blotC. IMSAIectroprecic moblllly shift assay) 0. Western blcitoP7HsB. wntem bbt* -f liuln宀 rjjszwsQnLL* 口卜丄曲工一-< utmdnh'J7

29、UUG 工D-GIcMAc* ttFree probe15Fig璉韓昶玉酗心刖獺腳嚨財(cái)罕,牖H時(shí)秤AfitO (C)、 0砒臥翳水平CD) *可劭搠臨胡瞬我PUGIWli擬.*pC儷viCr I p<C.05viLS,柿GMwG逸遞 Owntral Qttl GLIntLfSd GLPIntLPS<-PUGNAe乏 L'LFS Q GLft»GlrH4_PS*Alloxan7.5M0'-旳卩2.5f1DT-XGL GLArn<2 u-nri-qnJLJ* it0Tubulin討論：熱休克反響作為生物界普遍存在的保護(hù)機(jī)制，越來越受到研究者的關(guān)注。我們前

30、期的工作說明，休克狀態(tài)下， Gin能誘導(dǎo)HSP70表達(dá)，產(chǎn)生炎癥因子， 改善血管反響性【4】。Gin作為一種平安、有效的熱休克蛋白表達(dá)誘導(dǎo)劑已成為學(xué) 術(shù)界的共識(shí)【2】【4】，但是具體機(jī)制未明。本實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞生存率都在 95%以上，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無顯著性差異，一方面說明本實(shí)驗(yàn)心肌細(xì)胞并無明顯死亡，另一方面也說明干預(yù)藥物Alloxan、PUGNAc的濃度相對(duì)平安。LDH是重要的心肌細(xì)胞酶，心肌細(xì)胞壞死時(shí)，LDH釋放到細(xì)胞培養(yǎng)液中，故測定心肌細(xì)胞培養(yǎng)液LDH活力能在一定程度上反響心 肌細(xì)胞壞死情況。本實(shí)驗(yàn)中，LPS可造成嚴(yán)重心肌細(xì)胞損傷。同時(shí)給予Gin、LPS 能一定程度逆轉(zhuǎn)LPS造成的LDH釋放。說

31、明Gin對(duì)LPS刺激心肌細(xì)胞有一定 保護(hù)作用，這可能與Gin誘導(dǎo)HSP70表達(dá)有一定的聯(lián)系。HSP70作為一種保護(hù) 性蛋白，對(duì)心肌細(xì)胞的生存狀態(tài)起到一定的改善。GL組HSP70水平提升幅度較L組高，說明Gin能進(jìn)一步誘發(fā)LPS刺激下心肌細(xì)胞的HSP70表達(dá)，發(fā)揮HSP70 對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用， 這一結(jié)果與先前我科的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及 Sanders【 3】等人研究 果蠅 Kc 細(xì)胞時(shí)的發(fā)現(xiàn)是一致的。并且高水平的 HSP70 能一定程度減輕細(xì)胞損 傷，減少 LDH 釋放。在此根底上，我們進(jìn)一步證實(shí)， HSP70 表達(dá)的增多與其關(guān) 鍵轉(zhuǎn)錄因子 HSF-1 表達(dá)水平有關(guān)。HSF-1是HSP70的重要轉(zhuǎn)錄因

32、子，目前研究顯示HSP在轉(zhuǎn)錄水平主要依靠 HSF-1 調(diào)節(jié)【8】。正常情況下， HSF-1 以無活性的單體形式在細(xì)胞漿呈泛素化狀態(tài)， 應(yīng)激后，游離的 HSF-1 單體增多，這些游離的 HSF-1 單體入核形成三聚體，磷 酸化，進(jìn)而活性增強(qiáng)，與HSP基因轉(zhuǎn)錄必須的核苷酸序列 HSE結(jié)合，促進(jìn)HSP 基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)【9】。本文以HSF-1作為橋梁來研究Gin在誘導(dǎo)HSP70表達(dá)機(jī)制 中的地位。通過分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果， 給予 Gln 能增加心肌細(xì)胞核 HSF-1 的表達(dá)水平， 增強(qiáng)HSF-1轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而啟動(dòng)HSP70的轉(zhuǎn)錄翻譯。心肌細(xì)胞胞核內(nèi)HSF-1水 平和HSF-1活性從某種程度上決定了 HSP70

33、的表達(dá)水平。最近研究發(fā)現(xiàn)，Gin能提高己糖胺合成途徑HBP終產(chǎn)物UDP-GIcNAc 的含量， 此物質(zhì)同時(shí)也是 O-GicNAc 修飾的底物， 能為 O-GicNAc 修飾提供糖基 【10】。 O-GicNAc 修飾修飾的增多進(jìn)而影響相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并發(fā)揮相應(yīng)生物 學(xué)功能。 O-GicNAc 修飾作為蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一種重要形式，可作為細(xì)胞的 “營養(yǎng)感受器和“應(yīng)激感受器【11】，調(diào)節(jié)細(xì)胞、蛋白、轉(zhuǎn)錄因子的功能及活性。 從Fig2D中可以看出，Gin可以提高LPS刺激心肌細(xì)胞O-GIcNAc修飾水平，這 與 HSF-1 及 HSP70 水平的變化趨勢一致。上述結(jié)果提示 Gin 有可能通過 H

34、BP 途徑，增加 O-GicNAc 修飾的底物 UDP-GicNAc 的含量，為 O-GicNAc 修飾提 供糖基，從而增加 O-GicNAc 修飾水平。近來有文章報(bào)道 O-GicNAc 修飾對(duì) SP1、 NF啟、C-Jun等轉(zhuǎn)錄因子活性起到明顯作用11。因而我們推測 Gin可能通過 O-GicNAc 修飾這一感受器來影響轉(zhuǎn)錄因子 HSF-1 的含量或轉(zhuǎn)錄活性， 進(jìn)而影響HSP70的表達(dá)。為了驗(yàn)證上述推測，我們使用了兩個(gè)干預(yù) O-GlcNAc 修飾關(guān)鍵酶的抑制劑：OGT酶抑制劑Alloxan和OGA酶抑制劑PUGNAc。作為OGT酶抑制劑，Alloxan 可降低 O-GlcNAc 修飾水平 G

35、LA 組，并減少心肌細(xì)胞核內(nèi) HSF-1 水平及轉(zhuǎn)錄 活性，減少HSP70的蛋白水平，增加心肌細(xì)胞損傷。使用OGA酶抑制劑PUGNAc 能提高心肌細(xì)胞 O-GlcNAc 修飾水平 GLP 組，并能模擬 Gln 的作用，增加心 肌細(xì)胞核內(nèi)HSF-1水平及轉(zhuǎn)錄活性，增加HSP70的蛋白水平，減少心肌細(xì)胞損 傷。因而O-GIcNAc修飾對(duì)HSP70表達(dá)的影響主要是通過干預(yù)其轉(zhuǎn)錄因子 HSF-1 的核內(nèi)水平及轉(zhuǎn)錄活性來實(shí)現(xiàn)的， 結(jié)合 Gln 對(duì) O-GlcNAc 修飾的作用， 我們不難 發(fā)現(xiàn)Gln通過提高細(xì)胞O-GIcNAc修飾水平來誘導(dǎo)HSP70的表達(dá)。我們進(jìn)一步 推測干預(yù) O-GlcNAc 修飾水

36、平、調(diào)控 O-GlcNAc 糖基化的關(guān)鍵酶可能成為休克治 療的新靶點(diǎn)。 當(dāng)然，休克需要綜合治療， 綜合分析， 對(duì)于 O-GlcNAc 修飾與 HSP 表達(dá)的機(jī)制仍然需要我們進(jìn)一步評(píng)價(jià)。結(jié)論：LPS刺激心肌細(xì)胞給予Gln后，可以通過HBP途徑增加UDP-GIcNAc含量, 干預(yù) O-GlcNAc 糖基化的關(guān)鍵酶位點(diǎn)，從而增強(qiáng)心肌細(xì)胞 O-GlcNAc 修飾水平， 增加細(xì)胞核內(nèi)HSF-1含量及轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而促進(jìn) HSP70的蛋白表達(dá)，并對(duì)心肌 細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。鳴謝：本實(shí)驗(yàn)受到江蘇省自然科學(xué)基金的資助， 工程編號(hào)：BK2021303。在此表示感謝！參考文獻(xiàn)：1】 Juliann G K, Geor

37、ge C T. Heat shock protein 70 kDa :molecular biology , biochemistry , and physiologyJ . Pharmacol Ther , 1998 , 80 (2) : 1832201.2】 Paul E.Wischmeyer. Glutumine and Heat Shock Protein Expression. Nutrition. 2002.18.225-228.3】 Sanders M M, Kon C. Glutamine is a powerful effector of heat shock protein

38、 expression in Drosophila Kc cells J . J Cell Physiol , 199 , 146 : 1804】 Liang Jing, Qiong Wu and Fuzhou Wang.Glutamine induces heat-shock protein and protects against Escherichia coli lipopolysaccharide-induced vascular hyporeactivity in rats.Critical Care 2007, 11:R345】 GeraldW.Hart, Michael P. Housley. Cycling of O-linked&N-acetylglucosam ine on nu cleocytoplasmic protei ns NATURE, Vol 446,26 April.20076】Robert J. Konrad,a Fengxue Zhang,Alloxan is an