各種酶切位點的保護堿基引物設(shè)計必看

1、各 種 酶 切 位占八、酶不同，所需要的酶切位點的保護堿基的數(shù)量也不同。一般情況下，在 酶切位點以外多出3個堿基即可滿足幾乎所有限制酶的酶切要求。在資料上 查不到的，我們一般都隨便加3個堿基做保護。寡核昔酸近末端位點的酶切（Cleavage Close to the End of DNA Fragments （oligonucleotides）為了解不同內(nèi)切酶對識別位點以外最少保護堿基數(shù)目的要求，NEB采用了一系列含識別序列的短雙鏈寡核甘酸作為酶切底物進(jìn)行實驗。實驗結(jié)果對于確定雙酶切順序?qū)袔椭ū热缭诙嘟宇^上切割位點很接近時），或者當(dāng)切割位點靠近DNA末端時也很有用。在本表中沒有列出的酶，

2、則通常需在識別位點兩端至少加上 6個保護堿基，以確保酶切反應(yīng)的進(jìn)行。實驗方法：用 丫32PATP在T4多聚核甘酸激酶的作用下標(biāo)記0.1A260單位的寡核甘酸。取 1已標(biāo)記了的寡核甘酸與 20單位的內(nèi)切酶，在20。C條件下分別反應(yīng)2小時和20小時。反應(yīng)緩沖液含 70 mM Tris-HCl （pH ,10 mM MgCl 2,5 mM DTT 及適量的 NaCl 或 KCl （視酶的具體要求而定） 。20% 的PAGE （7 M尿素）凝膠電泳分析，經(jīng)放射自顯影確定酶切百分率。本實驗采用自連接的寡核甘酸作為對照。若底物有較長的回文結(jié)構(gòu)，切割效率則可能因為出現(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)而降低。酶寡核甘酸序列鏈長切割率

3、%2 hr20 hrAcc IGGTCGAC C800CG GTCGAC CG1000CCG GTCGAC CGG1200Afl IIICACATGT G800CCACATGT GG10>90>90CCC ACATGT GGG12>90>90Asc IGGCGCGCC8>90>90AGGCGCGCC T10>90>90TTGGCGCGCC AA12>90>90Ava ICCCCGGG G850>90CCCCCGGG GG10>90>90TCC CCCGGG GGA12>90>90BamH ICGGATCC

4、 G81025CG GGATCC CG10>90>90CGC GGATCC GCG12>90>90Bgl IICAGATCT G800GA AGATCT TC1075>90GGA AGATCT TCC1225>90BssH IIGGCGCGC C800AG GCGCGC CT1000TTG GCGCGC CAA1250>90BstE IIGGGT(A/T)ACC C9010BstX IAACTGCAGAA CCAATGCATTGG2200AAAACTGCAG CCAATGCATTGG AA242550CTGCAGAA CCAATGCATTGG ATGC

5、AT2725>90Cla ICATCGAT G800GATCGAT C800CC ATCGAT GG10>90>90CCC ATCGAT GGG125050EcoR IG GAATTC C8>90>90CG GAATTC CG10>90>90CCG GAATTC CGG12>90>90Hae IIIGGGGCC CC8>90>90AGC GGCC GCT10>90>90TTGC GGCC GCAA12>90>90Hind IIICAAGCTT G800CC AAGCTT GG1000CCC AAGCTT

6、GGG121075Kpn IG GGTACC C800GG GGTACC CC10>90>90CGG GGTACC CCG12>90>90Mlu IGACGCGT CCG ACGCGT CG810025050Nco ICCCATGG G800CATG CCATGG CATG145075Nde ICCATATG G800CC CATATG GG1000CGC CATATG GCG1200GGGIII CAIAIG AAACCC1800GGAATTC CATATG GAATTCC2075>90GGGAATTC CATATG GAATTCCC2275>90Nhe

7、IG GCTAGC C800CG GCTAGC CG101025CTA GCTAGC TAG121050Not ITT GCGGCCGC AA1200AIII GCGGCCGC IIIA161010AAATAT GCGGCCGC TATAAA201010ATAAGAAT GCGGCCGC TAAACTAT242590AAGGAAAAAA GCGGCCGC AAAAGGAAAA2825>90Nsi ITGC ATGCAT GCA1210>90CCA ATGCAT TGGTTCTGCAGTT22>90>90Pac ITTAATTAA800GTTAATTAA C10025CC

8、TTAATTAA GG120>90Pme IGIIIAAAC800GGIIIAAAC C10025GGGIIIAAAC CC12050AGCIII GIIIAAAC GGCGCGCCGG2475>90Pst IGCTGCAG C800TGCA CTGCAG TGCA141010AACTGCAG AACCAATGCATTGG22>90>90AAAA CTGCAG CCAATGCATTGGAA24>90>90CTGCAG AACCAATGCATTGGATGCAT2600Pvu ICCGATCG G800AT CGATCG AT101025TCG CGATCG C

9、GA12010Sac ICGAGCTC G81010Sac IIGCCGCGG CTCC CCGCGG GGA8120500>90Sal IGTCGAC GTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC2800GC GTCGAC GTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG301050ACGC GTCGAC GTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA321075Sca IGAGTACT C81025AAAAGIACI III127575Sma ICCCGGG6010CCCCGGG G8010CCCCCGGG GG101050TCC CCCGGG GGA12>90>90Spe I

10、GACTAGT C810>90GG ACTAGT CC1010>90CGG ACTAGT CCG12050CTAG ACTAGT CTAG14050Sph IG GCATGC C800CAT GCATGC ATG12025ACAT GCATGC ATGT141050Stu IAAGGCCT T8>90>90GA AGGCCT TC10>90>90AAAAGGCCI III12>90>90Xba ICTCTAGA G800GC TCTAGA GC10>90>90TGC TCTAGA GCA1275>90CTAG TCTAGA CT

11、AG1475>90Xho ICCTCGAG G800CC CTCGAG GG101025CCG CTCGAG CGG121075Xma ICCCCGGG G800CCCCCGGG GG102575CCC CCCGGG GGG1250>90TCCC CCCGGG GGGA14>90>902,雙酶切的問題參看目錄，選擇共同的buffer o其實，雙酶切選哪種buffer是實驗的結(jié)果, takara公司從1979年開始生產(chǎn)限制酶以來，做了大量的基礎(chǔ)實驗，也積累了很多經(jīng)驗，目錄中所推薦的雙酶切 buffer完全是依據(jù)具體實驗結(jié)果得 到的。有共同buffer的，通常按照常規(guī)的酶切

12、體系，在 37 c進(jìn)行同步酶切。但 BamH I在37 c下有時表現(xiàn)出star活性，常用30 c單切。兩個酶切位點相鄰或沒有共同 buffer的，通常單切，即先做一種酶切，乙 醇沉淀，再做另一種酶切。3,酶切底物DNA ,切不開1）底物DNA上沒有相應(yīng)的限制酶識別位點，或酶切位點被甲基化。2） PCR引物的酶切位點前沒有保護堿基或引物合成有誤，致使沒有正確的酶切位點存在。PCR產(chǎn)物酶切前盡量進(jìn)行精制以更換 buffer。由于PCR產(chǎn) 物中帶入的其它物質(zhì)，會影響酶切，據(jù)報道，通常PCR產(chǎn)物的添加量占總反應(yīng)體積25%以下沒有問題。3）酶切條件的確認(rèn)，包括反應(yīng)溫度和反應(yīng)體系等。同樣的 DNA,同樣量

13、， 用不同的限制酶切情況可能不同，由于 DNA的空間結(jié)構(gòu)造成的。同樣的 DNA ,不同的反應(yīng)體系，酶切效果也可能不同，由于一些空間因素或不可測 因素造成的。4）公司出售的限制酶都是液體狀態(tài)，都是根據(jù)最佳反應(yīng)體系配制了濃度， 不可以再用buffer稀釋，因為酶濃度和活性之間不呈直線對應(yīng)關(guān)系，酶濃 度越稀，相對活性越低，并且越不穩(wěn)定，有時便會出現(xiàn)底物DNA不能被切斷的現(xiàn)象。不同公司的酶和buffer不要交叉使用，否則可能會影響酶切效果。5）酶的識別位點上的堿基被甲基化?？梢赃x用不受甲基化影響的同裂酶，或?qū)①|(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入甲基化酶欠損的宿主菌中，重新制備DNA ,也可以使用 PCR的方法對DNA進(jìn)行擴增，再做酶切。常用的有 XbaI容易受甲基化影 響，通常選用GM33做宿主菌轉(zhuǎn)化。6）底物不純，含有限制酶阻害物質(zhì)，影響酶切作用，需要重新純化DNA。一般做乙醇沉淀純化即可。如果質(zhì)粒中含鹽