NG2與少突狀膠質(zhì)細胞

1、在在EAE中，中，NG2與神經(jīng)炎癥、血腦屏與神經(jīng)炎癥、血腦屏障改變、障改變、OPCs反應(yīng)及反應(yīng)及DCs激活有關(guān)激活有關(guān)影響因子：影響因子：12.21312.213Accepted: 15 March 2016 Moransard 等人研究等人研究EAE在在NG2KO mice的的作用，作用，發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)與與WT mice并沒有發(fā)現(xiàn)任何并沒有發(fā)現(xiàn)任何差異差異 而本作者采用通過樣的方法，發(fā)現(xiàn)而本作者采用通過樣的方法，發(fā)現(xiàn)NG2在在EAE中發(fā)揮著重要的作用中發(fā)揮著重要的作用實驗方法實驗方法 工具工具 1.ELISA1.ELISA-酶聯(lián)免疫吸附試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗 2.EAE2.EAE 建模方法建模方法

2、3.3.工具鼠工具鼠 4.bone marrow chimeramouse 5.5.血管內(nèi)皮通透性試驗血管內(nèi)皮通透性試驗1.ELISA-酶聯(lián)免疫吸附試驗OD2.EAE 建模方法 EAE模型是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)小血管周圍出現(xiàn)單核細胞浸潤及髓鞘脫失為特征的自身免疫性疾病，是人類多發(fā)性硬化（MS）的理想動物模型。 雌鼠步驟： MOG35-55(200ug)+PBS水溶液水溶液100ul H37RA(結(jié)核分枝桿菌結(jié)核分枝桿菌300ug)+ 然后然后300ul不完全弗氏佐劑超不完全弗氏佐劑超 聲乳化聲乳化 尾靜脈一次每只尾靜脈一次每只0.1ml+百日咳病毒（原液百日咳病毒（原液400ng/ul) 用用PBS

3、稀釋使用稀釋使用,每只老鼠腹腔注射每只老鼠腹腔注射0.1ml，第第2天注射。天注射。皮皮下兩側(cè)下兩側(cè)尾靜脈尾靜脈利用同源重組技術(shù) WT C57Bl/6J mice F1 NG2+/- Mice F2 NG2-/- Mice & NG2+/+ Mice WT Mice 純合的 NG2KO mice 3.工具鼠工具鼠the insertion of a 1100-bp neomycin-resistanceF1WT4.bone marrow chimeramouse 骨髓嵌合體小鼠 =淋巴造血系統(tǒng)嵌合體 = 放射性嵌合體 徹底破壞受者機體骨髓的造血系統(tǒng)，最大程度的殺滅腫瘤細胞 骨髓含造血干細胞，血

4、液也有 白血病 同基因型5.FITC-dextran 血管內(nèi)皮通透性試驗 腦微血管內(nèi)皮細胞（BMEC）擁有豐富的酶系統(tǒng)，但缺乏收縮蛋白，故正常生理狀態(tài)下組胺、5-羥色胺、白三烯C4等血管活性物質(zhì)較少影響血腦屏障 而病理狀態(tài)下因BMEC酶系統(tǒng)活性改變，活性物質(zhì)將影響B(tài)MEC，從而進一步影響血腦屏障的通透性。 開放的血腦屏障能讓大分子如右旋糖酐通過 在在EAE中，中，NG2與神經(jīng)炎癥、血腦屏與神經(jīng)炎癥、血腦屏障改變、障改變、OPCs反應(yīng)及反應(yīng)及DCs激活有關(guān)激活有關(guān)Introduction1.NG2-硫酸軟骨素蛋白多糖，OPCs和激活的周細胞表達，NG2、PDGFR 是OPCs（ NG2NG2 c

5、ell cell ）的marker，當(dāng)其分化成少突狀膠質(zhì)細胞時，這兩個marker不表達 CNS損傷時，OPCs反應(yīng)性增殖，表達NG2的細胞在炎癥部位聚集 EAE and MS，急性期，OPC的數(shù)量顯著增加，在慢性后期中，顯著減少 OPCs分化為少突狀膠質(zhì)細胞，促進髓鞘的生成 CNS微血管中，周細胞促進血管生成，促進緊密連接的形成，從而保護BBB通透性和維持內(nèi)皮細胞屏障的功能； CNS損傷時，充當(dāng)炎癥傳感器，免疫監(jiān)視，執(zhí)行中性粒細胞 巨噬細胞的功能2.表明NG2與CNS損傷的炎癥息息相關(guān) 膠質(zhì)瘢痕 :由于缺氧、低血糖、感染、中毒等均能引起腦組織的損傷而導(dǎo)致星形膠質(zhì)細胞增生。反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞增

6、生是腦組織損傷的修補反應(yīng)減弱星形膠質(zhì)細胞增生，有利于改善腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù) 膠質(zhì)瘢痕形成是一個極其 復(fù)雜的病理生理過程，包括組織水腫、炎癥反應(yīng)炎癥反應(yīng)、局 部缺血、谷氨酸受體高反應(yīng)性、脂質(zhì)過氧化作用、鈣離子超負(fù)荷、自由基損傷、反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞增生 EAE BBB滲透性改變的疾病 3.NG2 炎癥浸潤 CNS損傷有關(guān) 4 4.NG2KO mice ，EAE的臨床表現(xiàn)型更輕微 Unexpectedly，NG2有助于EAE的發(fā)病機制 OPCs及周細胞表達NG2原因 免疫細胞也表達NG2Abstract 在成年人的CNS中，OPCs表達NG2 在病理情況下，NG2是周細胞激活的marker EAE

7、 BBB滲透性改變的疾病 NG2 炎癥浸潤 CNS損傷有關(guān)1.在NG2KO mice中誘導(dǎo)EAE的發(fā)生 相比WT,NG2KO mice EAE臨床評分更輕微 OPCs的數(shù)量在EAE誘導(dǎo)后無改變2.發(fā)現(xiàn)NG2在免疫細胞中表達，如T細胞、巨噬細胞 樹突狀細胞3.評估了T細胞致腦炎性物質(zhì) WT NG2KO mice增殖的致腦炎物質(zhì)MOG35-55水平相同 However，NG2 KO mice T 細胞反應(yīng)偏向于Th2型反應(yīng)4.是否分泌了炎性因子，聯(lián)想到DCs，測定IL-12表達情況 NG2KO mice中，IL-12-expressingCD11c+細胞顯著減少 更重要的是，在WT mice中，I

8、L-12的表達在CD11c+NG2-cell比CD11c+NG2+cell 要更少5.是否NG2與免疫系統(tǒng)和CNS水平有關(guān)-骨髓嵌合體老鼠相比接受WT骨髓的mice，接受NG2KO mice骨髓的，EAE癥狀更輕微研究思路研究思路Results 1.NG2KO mice 的EAE表現(xiàn)型更輕微 2.NG2KO mice骨髓中，EAE相關(guān)的炎癥更輕微 3.EAE induced NG2KO mice，OPCs的數(shù)量無改變 4. EAE induced NG2KO mice，緊密蛋白的連續(xù)性分布與BBB功能有關(guān) 5.免疫細胞表達NG2 6. NG2KO mice ,T細胞對MOG反應(yīng)，炎癥較少 7.

9、 NG2KO mice，IL-12表達較少&NG2參與DC的激活 8.NG2不參與巨噬細胞的極化 9. NG2KO mice ,可調(diào)節(jié)的免疫反應(yīng)&保守的BBB導(dǎo)致了EAE輕微的表現(xiàn)型1.NG2KO mice 的EAE表現(xiàn)型更輕微A representative of three independent experiments is presented 26/33 100%=78.78%disease incidence (84 4.5 vs. 100 % in WT mice) Disease onset was delayed (13.06 3.66 vs. 8.16 1.71 days f

10、or WT mice) A representative of three independent experiments is presented CD45：血管周浸潤的炎性細胞，巨噬細胞：血管周浸潤的炎性細胞，巨噬細胞CoII IV :microvessel basal laminaTO-PRO-3：細胞核：細胞核脊髓截面染色小膠質(zhì)細胞&巨噬細胞激活的星形膠質(zhì)細胞Stress marker-positive cells 浸潤的T細胞大腦皮層大腦皮層脊髓脊髓2.NG2KO mice骨髓中，EAE相關(guān)的炎癥更輕微EAE相關(guān)的促炎性基因的相關(guān)的促炎性基因的mRNA的表達情況的表達情況3.EAE

11、induced NG2KO mice，OPCs的數(shù)量無改變 EAE and MS，急性期，OPC的數(shù)量顯著增加，在慢性后期中，顯著減少（脫髓鞘過程中） Whether NG2 缺失影響少突狀膠質(zhì)細胞的免疫反應(yīng)？ 首先要證明首先要證明NG2NG2是不存在的或不生成是不存在的或不生成 免疫熒光定量分析OPCs數(shù)量 確定確定PDGFRPDGFR確定NG2的確敲除了，且在NG2KOmice中不表達EAEthe insertion of a 1100-bp neomycin-resistance在NG2KO mice中，NG2特異性的信號沒有被發(fā)現(xiàn)（基于NG2敲除的前提下，理解為沒有生成），實驗更加嚴(yán)謹(jǐn)

12、-IFN-EAE研究研究NG2缺失缺失免疫熒光定量分析免疫熒光定量分析OPCsOPCs數(shù)量數(shù)量MBP:神經(jīng)纖維神經(jīng)纖維APP:損傷的軸突損傷的軸突4. EAE induced NG2KO mice，緊密蛋白的連續(xù)性分布與BBB功能有關(guān) 周細胞： 神經(jīng)血管形成 BBB功能 NG2KO mice 中，是否神經(jīng)炎癥水平降低與血腦屏障特異性改變有關(guān) 研究了內(nèi)皮細胞的緊密連接蛋白 、claudin-5、 occludin（咬合蛋白）的結(jié)構(gòu)和功能的分布血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能的改變與緊密連接蛋白的表達變化有關(guān)Dextran-FITC experiments 血管內(nèi)皮通透性試驗NG2KO mice周細胞缺乏NG2

13、影響TJs的動態(tài)組合 可替換信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 5.免疫細胞表達NG2 NG2KO mice，巨噬細胞產(chǎn)生更少的炎性物質(zhì)，浸潤能力減弱 NG2可能與其他炎性細胞浸潤CNS有關(guān) ， whether NG2 is expressed in WT mice or not by cells of the systemic immune system. ? T Cell BMDDCs BMDMsCD3:T CellCD11c：BMDDsCD11b:BMDMsDAPI：核酸，：核酸，DNA AT區(qū)區(qū)6. NG2KO mice ,T細胞對MOG反應(yīng)，炎癥較少 是否缺乏NG2的免疫細胞會影響疾病的表達情況 觀察T

14、Cell的增殖和細胞因子的表達情況 ConA:+ positive 植物血凝素類多克隆刺激劑，通過細胞表面的CD3- TCR復(fù)合體作用于T細胞,對小鼠T細胞增殖作用更強一些 單獨anti-CD3包被在板上能刺激純化T細胞增殖，加入anti-CD28作用更強 PLP:- negative MO35-55:EAE6. NG2KO mice ,T細胞對MOG反應(yīng)，炎癥較少 是否缺乏NG2的免疫細胞會影響疾病的表達情況 觀察T Cell的增殖和細胞因子的表達情況 ConA:+ positive 植物血凝素類多克隆刺激劑，通過細胞表面的CD3- TCR復(fù)合體作用于T細胞,對小鼠T細胞增殖作用更強一些 單

15、獨anti-CD3包被在板上能刺激純化T細胞增殖，加入anti-CD28作用更強 PLP:- negative MO35-55:EAE6. NG2KO mice ,T細胞對MOG反應(yīng)，炎癥較少 是否缺乏NG2的免疫細胞會影響疾病的表達情況 觀察T Cell的增殖和細胞因子的表達情況 ConA:+ positive 植物血凝素類多克隆刺激劑，通過細胞表面的CD3- TCR復(fù)合體作用于T細胞,對小鼠T細胞增殖作用更強一些 單獨anti-CD3包被在板上能刺激純化T細胞增殖，加入anti-CD28作用更強 PLP:- negative MO35-55:EAE6. NG2KO mice ,T細胞對MO

16、G反應(yīng)，炎癥較少 是否缺乏NG2的免疫細胞會影響疾病的表達情況 觀察T Cell的增殖和細胞因子的表達情況 ConA:+ positive 植物血凝素類多克隆刺激劑，通過細胞表面的CD3- TCR復(fù)合體作用于T細胞,對小鼠T細胞增殖作用更強一些 單獨anti-CD3包被在板上能刺激純化T細胞增殖，加入anti-CD28作用更強 PLP:- negative MO35-55:EAE抑炎抑炎促炎促炎T增增值值情情況況ConA-CD3-TCRConA-NG2-NG2 DCs 髓系DCs：IL-12 Th0 Th1 BMDDCs淋巴系DCs：IL-4 Th0 Th27. NG2KO mice，IL-12表達減少&NG2參與DC的激活是否是否IL-12表達與表達與NG2表達有關(guān)？表達有關(guān)？IL-12WTNG2-CD11c+ cells中，中，