腦舒膠囊對免疫低下小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用

1、腦舒膠囊對免疫低下小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用                     作者：吳章懷，秦大蓮，岳永花，鄧莎，周淼，劉劍 【摘要】   目的研究腦舒膠囊對免疫低下小鼠免疫功能的影響。方法環(huán)磷酰胺0.02g/kg皮下注射制備免疫低下小鼠模型;碳粒廓清法觀察小鼠單核巨噬細胞吞噬功能;溶血素抗體測定法觀察小鼠溶血素抗體生成;足墊增厚法觀察小鼠遲發(fā)型超敏反應。結(jié)果1.33g/kg腦舒膠囊

2、能提高免疫低下小鼠單核巨噬細胞吞噬功能;0.67g/kg和1.33g/kg腦舒膠囊能增加免疫低下小鼠溶血素抗體生成，并拮抗環(huán)磷酰胺誘導的免疫低下小鼠足墊腫脹度減輕。但兩劑量組間無明顯量?殘叵怠崧勰允娼耗以諞歡潭壬夏芨納蘋妨柞匪?致小鼠免疫低下的非特異性免疫功能，增加其特異性細胞免疫和體液免疫功能。 【關(guān)鍵詞】   腦舒膠囊; 小鼠; 免疫低下; 免疫功能Abstract：ObjectiveTo study the effect of Naoshu capsule on immune function of immune deficit mice. MethodsImmune defi

3、cit mouse model was made with 0.02g/kg cyclophosphamide by subcutaneous injections. The phagocytic activity of monocytes ,the haemolysin antibody formation and the delayed hypersensitivity reaction in mice were observed by means of carbon particle clearance ,haemolysin antibodies and foot pad thicke

4、ning test,respectively.ResultsIn the immune deficit mice ,1.33g/kg Naoshu capsule could enhance the phagocytic activity of monocytes, 0.67g/kg and 1.33g/kg Naoshu capsule could increase content of haemolysin antibody,and decrease footpad swelling induced by cyclophosphamide.But, there is no obvious

5、dose-effect relationship between 0.67g/kg and 1.33g/kg Naoshu capsule therapeutic groups. ConclusionNaoshu capsule can improve non-specific immunity,and enhance specific cellular immunity and humoral immune function in immune deficit mice induced by cyclophosphamide.Key words： Naoshu capsule; Mouse;

6、 Immune deficit; Immune function腦舒膠囊(Naoshu Capsule)由我院多年用于“癡癥”的驗方經(jīng)加工制成。研究結(jié)果顯示，腦舒膠囊可明顯改善A25-35誘導的大鼠阿爾茨海默病(AlzhEimers disease, AD)的學習記憶功能。近年研究發(fā)現(xiàn)，AD患者腦內(nèi)存在嚴重的免疫炎癥反應1,2。而人參、黃精、葛根等均有免疫調(diào)節(jié)作用，因此認為，由人參、黃精、葛根等組成的腦舒膠囊改善AD大鼠學習記憶能力可能與其免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。本文以環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide，CY)皮下注射制備免疫低下小鼠模型，觀察腦舒膠囊對免疫低下小鼠免疫功能的影響。 1 材料

7、 1.1 動物昆明種小鼠，雄性，體重2022 g;豚鼠，雄性，體重400450 g，川實動證第07-16號(240115)，瀘州醫(yī)學院實驗動物科提供。1.2 藥物與主要試劑腦舒膠囊(Naoshu Capsule)，0.5g/粒，含原生藥 2.875g/粒，批號070403，瀘州醫(yī)學院藥研所提供;環(huán)磷酰胺：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品;鹽酸左旋咪唑片(Levamisole，LMS)，廣東邦民制藥廠有限公司生產(chǎn);印度墨汁，北京西中化工廠產(chǎn)品，用NS稀釋，NS與墨汁的體積比為51，經(jīng)超聲波發(fā)生器處理2 min，3 000r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清液;Alsever's溶液的配置，

8、枸櫞酸三鈉?2H2O 8.0 g，枸椽酸0.5 g，無水葡萄糖18.7 g，氯化鈉4.2 g，蒸餾水加至1 L，過濾，10磅高壓滅菌20 min，4冰箱保存?zhèn)溆谩?2 方法 2.1 腦舒膠囊對小鼠單核巨噬細胞吞噬功能的影響參照小鼠碳粒廓清法3，取小鼠60只,隨機分為6組，分別為空白對照組、環(huán)磷酰胺模型組、LMS陽性對照組(LMS 0.025 g/kg組)和腦舒膠囊低、中、高(0.67，1.33，2.33 g/kg)3個劑量組，每組10只。適應環(huán)境3 d后開始腹腔注射給藥，1 次/d ,連續(xù)10 d，空白對照組和環(huán)磷酰胺模型組給予等容量生理鹽水，用藥組給予等容積不等濃度的不同藥液。第68天環(huán)磷酰

9、胺模型組和用藥組皮下注射環(huán)磷酰胺0.02 g/kg復制免疫低下小鼠模型，空白對照組皮下注射等體積生理鹽水。末次給藥后1 h尾靜脈注射印度墨汁稀釋液10 ml/kg，注射后1 min(t1)及5 min(t2)分別從眼眶靜脈叢取血20l，溶于3 ml 0.1%的Na2CO3溶液中搖勻，用722-分光光度計于680 nm波長測吸光度(A1，A2)，以0. 1 %Na2CO3 溶液作空白對照。最后將小鼠脫頸椎處死，分別取肝、脾稱濕重， 計算 廓清指數(shù)(clearance index, K)，然后按體重和肝、脾重量校正K值,計算吞噬系數(shù)。K= (IgA1-IgA2)/(t2-t1)，=K1/3

10、5;體重/(肝重+脾重)4。2.2 小鼠溶血素抗體生成實驗 采用雞紅細胞作免疫原溶血素抗體測定法(比色法) 5，取雄性昆明種小鼠60 只，分組、給藥同“2.1”項。各組于給藥的第2天腹腔注射75%雞紅細胞(CRBC)混懸液0.2 ml進行免疫。1 h 后，除空白對照組外，其余各組小鼠皮下注射環(huán)磷酰胺0.02 g/kg復制免疫低下小鼠模型。免疫7 d 后摘眼球取血1ml，靜置過夜，4 以3 500 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，分離血清，取血清用生理鹽水稀釋100 倍(血清50l稀釋至5ml)，再取稀釋血清2 ml加入5%CRBC混懸液1 ml，置冰浴中,每管加入1 ml10%豚鼠血清,隨即移

11、至37 恒溫水浴中,保溫30 mim，然后放入0冰箱中止反應，2 000 r/min 離心10 min ,取上清1 ml ,放置10 min 后,用分光光度計在540 nm處比色，測定各樣品的OD值，另設不加血清的空白對照 。2.3 雞紅細胞誘發(fā)小鼠遲發(fā)性超敏反應(DTH)實驗根據(jù) 文獻 5，采用足墊增厚法，取小鼠60只，分組、給藥方法、模型復制同“2.1”項。給藥的第2天，于各組小鼠左側(cè)足墊皮下注射10%CRBC懸液0.05ml致敏。于給藥的第8天末次給藥前30 min右側(cè)足墊皮下柱射5%CRBC懸液0.05 ml攻擊，末次給藥后24 h將小鼠脫頸處死，用外徑千分尺分別測量雙足足墊厚度，計算

12、24 h足墊腫脹度。腫脹度=右側(cè)足墊-左側(cè)足墊。 3 結(jié)果 3.1 腦舒膠囊對免疫低下小鼠碳粒廓清的影響與對照組比較，模型組小鼠碳粒廓清指數(shù)K值明顯降低(P<0.05);與模型組比較，1.33g/kg腦舒膠囊組和左旋咪唑組均有增加小鼠碳粒廓清指數(shù)K值的作用(P<0.05)，但吞噬系數(shù)各組間無統(tǒng)計學意義。結(jié)果見表1。表1 各組小鼠廓清指數(shù)K及吞噬指數(shù)空白對照組比較，P<0.05;與環(huán)磷酰胺模型組比較，*P<0.05;n=103.2 腦舒膠囊對免疫低下小鼠血清溶血素的影響與空白對照組比較，環(huán)磷酰胺模型組小鼠血清溶血素抗體的OD值明顯降低(P<0.05);與環(huán)磷酰胺模型

13、組比較，腦舒膠囊0.67 g/kg和1.33 g/kg組均可明顯提高免疫低下小鼠的血清溶血素抗體的OD值(P<0.01)，但量-效關(guān)系不明顯 。結(jié)果見表2。表2 各組小鼠血清溶血素抗體的OD值與空白對照組比較，P<0.05;與環(huán)磷酰胺模型組比較，*P<0.01;n=103.3 腦舒膠囊對免疫低下小鼠遲發(fā)性超敏反應的影響與空白對照組比較，環(huán)磷酰胺模型組足墊厚度差明顯降低(P<0.05);與環(huán)磷酰胺模型組比較，腦舒膠囊0.67 g/kg組和1.33 g/kg組可明顯拮抗CY誘導的免疫低下小鼠足墊腫脹度減輕(P<0.05)。但量效關(guān)系不明顯。結(jié)果見表3。 4 討論 現(xiàn)認

14、為免疫炎癥損傷在AD發(fā)病過程中起重要作用。我們另外的實驗研究了腦舒膠囊的抗炎作用及其對AD大鼠海馬免疫炎性因子IL-1和IL-6表達的影響，結(jié)果均顯示，腦舒膠囊不僅具有較好抗炎作用，且可明顯減輕AD大鼠海馬IL-1和IL-6表達。而衰老免疫學說又認為，在衰老過程中免疫系統(tǒng)的功能隨之衰退6，因此，本文采用環(huán)磷酰胺復制小鼠免疫低下模型，以此觀察腦舒膠囊對機體免疫系統(tǒng)的作用和免疫功能的影響，了解腦舒膠囊改善AD大鼠學習記憶能力的作用是否與其增強免疫功能有關(guān)。表3 腦舒膠囊對免疫低下小鼠遲發(fā)性超敏反應的影響與空白對照組比較，P<0.05;與環(huán)磷酰胺模型組比較，*P<0.05，*P<0

15、.01;n=10本研究建立的免疫低下小鼠模型與對照組比較,各項指標均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05) ,說明模型復制成功。而碳粒廓清法測小鼠單核巨噬細胞吞噬功能、溶血素抗體法測小鼠溶血素抗體生成、足墊增厚法測腦舒膠囊對雞紅細胞致小鼠遲發(fā)型超敏反應的影響，分別觀察是機體非特異性免疫功能和特異性體液免疫、細胞免疫功能常用的藥理實驗方法。本研究結(jié)果表明,在碳粒廓清實驗中，1.33 g/kg腦舒膠囊能提高廓清指數(shù)K值 ,說明腦舒膠囊對網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能具有一定的激活、增強作用，提示腦舒膠囊對小鼠非特異性免疫功能具有增強作用。在小鼠溶血素抗體生成實驗和小鼠遲發(fā)型超敏反應實驗中，0.67 g/kg和

16、1.33 g/kg腦舒膠囊不僅可明顯改善環(huán)磷酰胺所致的小鼠血清溶血素含量降低現(xiàn)象,促進小鼠溶血素抗體生成，對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制有拮抗作用;亦可拮抗環(huán)磷酰胺誘導的免疫低下小鼠足墊腫脹度減輕。提示：腦舒膠囊對免疫低下小鼠的特異性體液免疫和細胞免疫功能,具有較好的免疫功能增強作用。但腦舒膠囊各劑量組間無明顯量效關(guān)系，且大劑量(2.66 g/kg)腦舒膠囊對環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠的免疫功能與模型組比較無差異。這個結(jié)果提示，使用腦舒膠囊從調(diào)節(jié)機體免疫功能角度防治AD,必須找到一個最適劑量才能達到較為理想的防治目的。 【 參考 文獻 】   1 Akiyama H, Barger S, BarnumS, et al. Inflammation and AlzhEimer's diseaseJ. Neurobiol Aging, 2000, 21(3): 383.2 Golde TE. Inflammat