CTC檢測技術(shù)PPT課件

1、外周血循環(huán)腫瘤細胞檢測技術(shù)GDS_70000_Title_v1 2ASCO Annual Report ：2015 臨床腫瘤學(xué)進展臨床腫瘤學(xué)進展液體活檢引領(lǐng)未來十年腫瘤治療液體活檢引領(lǐng)未來十年腫瘤治療液體活檢樣本之液體活檢樣本之CTCsGDS_70000_Title_v1 3CTCs的概念的概念 1896年Ashworth患者外周血中發(fā)現(xiàn)與原發(fā)腫瘤細胞體積和形態(tài)相似的細胞 目前CTCs定義為自發(fā)或因診療操作脫離實體瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶進入外周血循環(huán)的腫瘤細胞 在腫瘤轉(zhuǎn)移灶形成前即可在外周血中檢測到循環(huán)腫瘤細胞 Ashworth TR. Aust Med J, 1869, 14: 146-147Al

2、lard WJ, et al. Clin Cancer Res, 2004, 10: 6897-6904GDS_70000_Title_v1 4循環(huán)腫瘤細胞的特性循環(huán)腫瘤細胞的特性Wu et al.Clin Chem Lab Med 2013, 10.1515Allard, W. J. et al. Clin Cancer Res 2004;10:6897-6904GDS_70000_Title_v1 5循環(huán)腫瘤細胞的特性循環(huán)腫瘤細胞的特性Mego, M, Nat. Rev. Clin. Oncol.2010 細胞表面抗原標志物表達差異 攜帶不同的分子信息 轉(zhuǎn)移潛力差異異質(zhì)性異質(zhì)性GDS_70

3、000_Title_v1 6循環(huán)腫瘤細胞的特性循環(huán)腫瘤細胞的特性Bednarz-Knoll,et al. Cancer Metastasis Rev (2012) 31:673687CTCs可以是間質(zhì)型、上皮型、上皮間質(zhì)混合型、成團的CTCs(CTM)GDS_70000_Title_v1 7Breast Cancer：N Engl J Med 351:781-791,2004Prostate Cancer : Lancet Oncol 10:233-239, 2009Colorectal Cancer: J Clin Oncol 26:3213-3221, 2008CTC對于無進展生存期與總生

4、存期的有效預(yù)測CTCs檢測的臨床可行性檢測的臨床可行性GDS_70000_Title_v1 8 如何檢測CTCs？CTCs的富集：如何獲取CTCs？ 每10mL血液中可能僅含有幾個到幾十個循環(huán)腫瘤細胞，而10mL血液中含有的白細胞約有1億個，紅細胞有500億個。 從紅細胞和白細胞中富集惡性腫瘤細胞CTCs的鑒定：如何鑒定所獲細胞為CTCs？ 將惡性腫瘤細胞與紅細胞、白細胞、正常上皮細胞、造血干細胞等區(qū)分開來循環(huán)腫瘤細胞的檢測循環(huán)腫瘤細胞的檢測GDS_70000_Title_v1 9CTCs檢測技術(shù)檢測技術(shù)Harouaka R, Kang Z, Zheng SY, et al. Pharmaco

5、l Ther. 2014 Feb;141(2):209-21. GDS_70000_Title_v1 10原 理技術(shù)產(chǎn)品免疫捕獲法(根據(jù)細胞表面標志物)陽性富集法：CellsearchTM系統(tǒng)CTC芯片（CTC-chip）MACSCell Separation陰性篩選法：Easy SepCyttel過濾法(根據(jù)細胞大小)ISET膜過濾 密度梯度離心（根據(jù)細胞密度）OncoQuick分離體系CTCs的檢測方法及代表技術(shù)產(chǎn)品的檢測方法及代表技術(shù)產(chǎn)品GDS_70000_Title_v1 11免疫捕獲法磁珠分選u原理： 將特異性抗原包被在已有同源二抗的磁珠上制成免疫磁珠再與靶細胞上抗抗原結(jié)合成“靶細胞

6、抗原抗體磁珠”復(fù)合物，在磁場作用下向一定方向移動，從而富集靶細胞.u分選策略陽性富集：使用表面耦聯(lián)抗目的細胞抗體的磁珠，細胞與磁珠結(jié)合后直接在磁場中被分離出來。負性篩選：通過去除無關(guān)細胞使目的細胞得以純化GDS_70000_Title_v1 12陽性富集CellsearchTM系統(tǒng)/CTC芯片（CTC-chip）/MACSCell Separation 磁性細胞分選系統(tǒng)l原理： 采用抗EpCAM（CD326）結(jié)合免疫磁珠捕獲EpCAM陽性CTCsl特點： 捕獲的CTCs純度較高 能夠捕獲到血液中上皮型、上皮間質(zhì)混合型的CTCs 無法捕獲到間質(zhì)型CTCs（EpCAM陰性）GDS_70000_Ti

7、tle_v1 13 magnet Anti-EpCAM Coated ferrofluids7.5mlAnti-CK (epithelial cells)Anti-CD45 (WBCs)DAPI (viable cells )Automated fluorescence detection systemmagnet使用抗EpCAM抗體抗體包被磁微粒，使其與腫瘤細胞結(jié)合，在特定磁場作用下達到分離CTC的目的。陽性富集陽性富集-CellsearchTMCTCWBCGDS_70000_Title_v1 14CellsearchTM CTCs鑒定鑒定CTCs的判定：DAPI（細胞核）陽性、角蛋白CKs

8、陽性、CD45陰性GDS_70000_Title_v1 15NormalBenignBaseline3-5 WeeksBaseline3-5 WeeksBaseline2-5 Weeks012345678910# of CasesN (%) 1 CTCN (%) 2 CTCN (%) 3 CTCN (%) 4 CTCN (%) 5 CTC29510 (3%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%)25519 (7%) 2 (1%) 2 (1%) 1 (0%) 1 (0%)177125 (71%)108 (61%)102 (58%) 94 (53%) 88 (50%)13273

9、(55%)53 (40%)47 (36%)42 (32%)40 (30%)413196 (47%)138 (33%)108 (26%) 90 (22%) 75 (18%)33489 (27%)48 (14%)41 (12%)34 (10%)26 ( 8%)11611111612112613113126312123121831224312219170 (78%)152 (69%)139 (63%)129 (59%)125 (58%)203123 (61%)106 (52%) 93 (46%) 86 (42%) 80 (39%)MCRC PatientsMBC PatientsAIPC Patie

10、ntsHealthyControlsBenignDiseasesBaseline3-5 WeeksBaseline3-5 WeeksBaseline2-5 WeeksCTC per 7.5mL of BloodCellsearch在各癌種中的檢出率GDS_70000_Title_v1 16 芯片的表層排布了78 000個包被抗 EpCAM抗體的微位點 血液樣本流經(jīng)芯片時，抗體與腫瘤細胞結(jié)合粘附在芯片上陽性富集陽性富集- CTCs-ChipGDS_70000_Title_v1 17 原理原理：聯(lián)合上皮細胞標志及腫瘤特異性標志通過免疫磁珠分選特異性腫瘤的CTCs聯(lián)合抗MUC1和EpCAM抗體檢測乳

11、腺癌和直腸癌通過RT-PCR擴增腫瘤標志物來鑒定CTCs特點特點：較單一使用EpCAM抗體更特異不適用于EpCAM和CK陰性或弱化的CTCsPCR鑒定敏感性高，但易造成假陽性陽性富集- Adna Test 檢測系統(tǒng)GDS_70000_Title_v1 18免疫捕獲技術(shù)缺陷（一代技術(shù)）技術(shù)應(yīng)用分析技術(shù)應(yīng)用分析參考文獻參考文獻CTCs分離具有特定表面抗原分離效率高，純度高J Transl Med. 2012, 10: 138.Clin Cancer Res. 2011, 17(2): 337-45.間質(zhì)細胞表型CTC間質(zhì)細胞表型CTC不表達上皮細胞標志物（如EpCAM）Breast Cancer

12、Res. 2008, 10(4): R69.BMC Cancer. 2012, 12: 178.CTMCTM多為間質(zhì)細胞表型CTM體積大導(dǎo)致捕獲效率低操作步驟多易使CTM人為分散Am J Pathol. 2011, 178(3): 989-96.Cancers. 2010, 2, 1236-1250.血小板包裹CTC抗體與抗原結(jié)合受血小板包裹阻隔Cancer Cell. 2011, 20(5): 576-90.CTCs分型只分離獲得特定類別的CTC，因此無法分型CTCs分析只能分析特定類別的CTCGDS_70000_Title_v1 19陰性富集 Cyttel/Cytelligen 檢測系統(tǒng)

13、原理原理: 利用CD45磁珠抗體吸附白細胞，在磁場作用 下去除白細胞，CTCs被富集沉淀 特點：特點： 可檢出EpCAM、CK陰性的間質(zhì)型CTCs 樣本處理步驟多，CTCs易丟失GDS_70000_Title_v1 20陰性篩選法-Cyttel步驟較多，CTCs容易丟失鑒定不穩(wěn)定 判定標準：DAPI陽性、CD45陰性，8號染色體擴增；特異性不足GDS_70000_Title_v1 21基于細胞大小過濾u原理：根據(jù)腫瘤細胞的體積大于白細胞體積分離CTCu代表技術(shù)：濾膜濾法分離上皮源腫瘤細胞（ISET）u方法：將全血經(jīng)過帶小孔8m的聚碳酸酯膜的過濾，即可除去白細胞 富集得到CTCs.u特點：細胞完

14、整性好；可完全分離上皮型、間質(zhì)型CTCs；可檢出循環(huán)腫瘤拴子；局限：不宜檢出細胞直徑小于8m的腫瘤如神經(jīng)內(nèi)分泌瘤HepG2 cells stained with anti-KL1濾膜法濾膜法GDS_70000_Title_v1 22密度梯度離心 原理： 根據(jù)腫瘤細胞與白細胞密度不同，通過梯度離心分離CTCs OncoQuick分離體系 方法： 密度梯度離心后，白細胞通過多孔濾膜被濾除，而CTCs被富集在介 質(zhì)層中，洗脫后得到CTCs. 特點：可分離CK陽性和陰性細胞 局限性：CTCs遷移可能至血漿層、紅細胞層和粒細胞層而丟失；CTCs微栓子可能沉入紅細胞層而丟失；與腫瘤細胞特性、離心時間和溫度

15、等有關(guān)；用血量多15-30mlGDS_70000_Title_v1 23流式細胞術(shù)原理：根據(jù)白細胞表達CD45抗原、CK陽性CTCs表達EpCAM，采用不同熒光素標記的抗CD45和抗EpCAM，通過流式細胞術(shù)分析和分選CK陽性細胞的CTC（CD45- EpCAM+）可在檢測的同時進行細胞形態(tài)、DNA倍數(shù)分析敏感性較低，需要的血液樣本量大缺乏規(guī)范的臨床操作方法GDS_70000_Title_v1 24技術(shù)技術(shù)優(yōu)勢優(yōu)勢局限性局限性陽性率陽性率樣本量樣本量參考文獻參考文獻CellsearchTM特異性好、重復(fù)性好、可自動化不能分型、漏檢轉(zhuǎn)移侵襲能力較強的間質(zhì)型CTCs及CTM71%（MBC）47%（

16、MCRC）78%（AIPC）7.5mLN Engl J Med. 2004，351:781-91.J Clin Oncol. 2008, 26:3213-3221.Clin Cancer Res. 2008, 14:6302-6309.CTCs-chip(HB-chip)特異性好、靈敏度高、HB芯片可富集到CTM不能分型、漏檢轉(zhuǎn)移侵襲能力較強的間質(zhì)型CTCs93%(MPC )0.9-5mlPNAS. 2010, 107: 1839218397 Cyttel可檢測出EpCAM、CK陰性的CTC、未對CTC進行任何標記不能分型、鑒定不穩(wěn)定、鑒定時易發(fā)生CTCs丟失64.5%(NSCLC)5mL周小

17、昀,癌癥進展. 2010,8(5): 484-490.ISET膜過濾CTC丟失少、適用于CK陰性腫瘤、適用于形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)和基因特異性分析不適合小神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細胞、特異性低、殘留大的白細胞80%（BC）1-15mlClin Cancer Res. 2010, 16(20): 50115018.常見CTCs一代檢測技術(shù)的比較GDS_70000_Title_v1 25臨床實踐亟需臨床實踐亟需新技術(shù)新技術(shù)實現(xiàn)實現(xiàn)CTCs分離、分型、分析分離、分型、分析GDS_70000_Title_v1 26GDS_70000_Title_v1 27先分離后鑒定，采用上皮+間質(zhì)標志物進行鑒定，不同表型的CTC均能

18、檢出。 技術(shù)原理GDS_70000_Title_v1 28CanPatrolTM-CTCs高效捕獲癌種例數(shù)陽性例數(shù)陽性率中位值均值SD CTCs范圍非小細胞肺癌 33028687%4 9190-240肝癌51139577%4 8110-83結(jié)直腸癌30224079%3 690-76乳腺癌21818484%4 8110-120胃癌14812886%5 890-46鼻咽癌1259677%2 460-33宮頸癌1574172%4 7110-62腎癌1459867%2 340-52膀胱癌987783%2 6130-43前列腺癌866980%3 44 0-32食管癌292793%5 890-43骨肉瘤3

19、73389%6 14200-95胰腺癌211886%4 9110-36子宮內(nèi)膜癌1212100%6 781-29頭頸癌262181%2 35 0-23卵巢癌11982%2 320-7黑色素瘤66100%5 1111 3-26腸癌5480%6 540-11惡性淋巴瘤5360%1 10210-48甲狀腺癌6583%2 32 0-7胸腺癌66100%4 78 1-21間質(zhì)瘤22100%7 76 3-11口腔癌11100%13 13壺腹癌33100%9 12122-26膽管癌22100%4 432-6惡性纖維組織細胞瘤22100%2 211-3肉瘤8788%4 550-12腦瘤88100%5 89 2

20、-27其他癌種776078%4 690-46共計2554209482%4 7120-240數(shù)據(jù)更新至數(shù)據(jù)更新至2015-01GDS_70000_Title_v1 29同步實現(xiàn)同步實現(xiàn)CTCsCTCs鑒定與分型鑒定與分型GDS_70000_Title_v1 30CTCs精準分型深入評估復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險精準分型深入評估復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險 間質(zhì)型CTCs轉(zhuǎn)移能力比上皮型、混合型CTCs強 CTM的轉(zhuǎn)移成瘤能力是單個CTCs的20-50倍GDS_70000_Title_v1 31 ：CTCs的全面深入分析GDS_70000_Title_v1 32 ：CTCs的全面深入分析GDS_70000_Title_v1 33 ：CTCs全基因組測序GDS_70000_Title_v1 34CanPatrolTM 技術(shù)特點和創(chuàng)新技術(shù)特點和創(chuàng)新GDS_70000_Title