蛋白質(zhì)的純化方法

1、寶楓林www .biofli n. com蛋白質(zhì)純化的方法蛋白質(zhì)的分離純化方法很多，主要有：（一）根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法1、蛋白質(zhì)的鹽析中性鹽對蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質(zhì)的溶解度增加，此稱鹽溶；當(dāng)鹽濃度繼續(xù)升高時，蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出，這 種現(xiàn)象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的S04和NH4）有很強的水化力，可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層， 使之“失水”于是蛋白質(zhì)膠粒凝結(jié)并沉淀析出。 鹽析時若溶液pH在蛋白質(zhì)等電點則效果更好。由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度不 同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)混合蛋

2、白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質(zhì)溶介度降低。但有的蛋白質(zhì)（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清 蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時溶解度低，更容易鹽析。（2）pH值：大多數(shù)蛋白質(zhì) 在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。（3）蛋白質(zhì)濃度：蛋白質(zhì)濃度高時，欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)地一起沉淀出來（共沉現(xiàn)象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質(zhì)含量在 2.5-3.0%。蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。其中應(yīng)用最多的硫酸銨，它的優(yōu)點是

3、溫度系數(shù)小而溶解度大（25度時飽和溶液為4.1M，即767克/升; 0度時飽和溶解度為 3.9M，即676克/升），在這一溶解度范圍內(nèi)，許多蛋白質(zhì)和酶 都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質(zhì)變性。 硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間，當(dāng)用其他pH值進行鹽析時，需用硫酸或氨水調(diào)節(jié)。蛋白質(zhì)在用鹽析沉淀分離后，需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質(zhì)溶液裝入秀析袋內(nèi)（常用的是玻璃紙），用緩沖液進行透析，并不斷的更換緩沖液，因透析所需時間較長，所以最好在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽，所用的時間就比較短。2、等電點沉淀法蛋白

4、質(zhì)在靜電狀態(tài)時顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小， 各種蛋白質(zhì)的等電點有差別，可利用調(diào)節(jié)溶液的pH達到某一蛋白質(zhì)的等電點使之沉淀，但此法很少單獨使用，可與鹽析法結(jié)合用。3、低溫有機溶劑沉淀法用與水可混溶的有機溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度降低并析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質(zhì)較易變性，應(yīng)在低溫下進行。(二) 根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別的分離方法1、透析與超濾透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質(zhì)分開。超濾法是利用高壓力或離心力，強使水和其他小的溶質(zhì)分子通過半透膜，而蛋白質(zhì)留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質(zhì)。2、凝膠過濾法也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是

5、根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠(Sephadex ged )和瓊脂糖凝膠(agarose gel)。(三) 根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進行分離蛋白質(zhì)在不同pH環(huán)境中帶電性質(zhì)和電荷數(shù)量不同，可將其分開。1、電泳法各種蛋白質(zhì)在同一 pH條件下，因分子量和電荷數(shù)量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質(zhì)作為載體，電泳時兩性電解質(zhì)形成一個由正極到負(fù)極逐漸增加的pH梯度，當(dāng)帶一定電荷的蛋白質(zhì)在其中泳動時，到達各自等電點的pH位置就停止，此法可用于分析和制備各種蛋白質(zhì)。2、離子交換層析法離子交換劑有陽離子交換劑(如：羧甲

6、基纖維素；CM-纖維素)和陰離子交換劑(二乙氨基乙基纖維素；DEAE?FONT FACE="宋體” LANG="ZH-CN"纖維素)，當(dāng)被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上， 隨后用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來。(詳見層析技術(shù)章)(四) 根據(jù)配體特異性的分離方法-親和色譜法親和層析法(aflinity chromatography )是分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法，它經(jīng)常只需經(jīng)過一步處理即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來，而且純度很高。這種方法是根據(jù)某些蛋白質(zhì)與另一種稱

7、為配體(Ligand )的分子能特異而非共價地結(jié)合。其基本原理：蛋白質(zhì)在組織或細(xì)胞中是以復(fù)雜的混合物形式存在，每種類型的細(xì)胞都含有上千種不同的蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)的分離(Separation ),提純(Purification )和鑒定(Characterization )是生物化學(xué)中的重要的一部分，至今還沒的單獨或一套現(xiàn)成的方法能移把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合蛋白質(zhì)中提取出來，因此往往采取幾種方法聯(lián)合使 用。細(xì)胞的破碎1、高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約 1/3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先 撥至最慢處，開動開關(guān)后，逐步加速至所需速度。此法適用于動物內(nèi)臟組織、植物肉質(zhì)種子 等。2、玻

8、璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將 細(xì)胞研碎，此法細(xì)胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用于量少和動物臟器組織。3、超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶， 常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，在1KG至10KG 頻率下處理10-15分鐘，此法的缺點是在處理過程會產(chǎn)生大量的熱，應(yīng)采取相應(yīng)降溫措施。對超聲波敏感和核酸應(yīng)慎用。4、反復(fù)凍融法：將細(xì)胞在 -20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和 剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。5、 化學(xué)處理法：有些動物細(xì)胞，例如腫瘤細(xì)胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉 等細(xì)胞膜破壞，細(xì)菌細(xì)胞壁較厚，可采用溶菌酶處理效果更好。無論用哪一種方法破碎組織細(xì)胞，都會使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導(dǎo)致天然物