黃曲霉毒素的檢測

1、中藥中黃曲霉毒素檢測方法中藥中黃曲霉毒素檢測方法學(xué)習(xí)匯報學(xué)習(xí)匯報真菌毒素簡介真菌毒素簡介1黃曲霉毒素的檢測意義黃曲霉毒素的檢測意義2黃曲霉毒素的種類及性質(zhì)黃曲霉毒素的種類及性質(zhì)3現(xiàn)有檢測方法介紹現(xiàn)有檢測方法介紹4中藥黃曲霉毒素檢測藥典收載狀況中藥黃曲霉毒素檢測藥典收載狀況5藥典檢測方法詳解藥典檢測方法詳解6 安全防護措施安全防護措施7中藥中黃曲霉毒素檢測方法研究中藥中黃曲霉毒素檢測方法研究真菌毒素簡介真菌毒素簡介n是真菌在適宜的環(huán)境條件下，在食品或飼料里生長所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，對人類和動物都有害真菌毒素簡介真菌毒素簡介毒素名稱毒素名稱 毒素來源毒素來源 毒性毒性 黃曲霉毒素（常見毒素）黃曲霉、寄

2、生曲霉等肝毒性黃綠青霉毒素 黃綠青霉 神經(jīng)毒性橘青霉毒素橘青霉腎毒性黃天精和環(huán)氯素島青霉肝毒性T2毒素擬分枝鐮刀菌和梨孢鐮刀菌心衰、出血黃曲霉毒素的起源黃曲霉毒素的起源 第一次發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素的起源事件：第一次發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素的起源事件： 1960年，英國發(fā)現(xiàn)有10萬只火雞死于一種以前沒見過的病，被稱為“火雞X病”，主要癥狀為食欲減退，羽翼下垂，染病后昏睡死亡，死時頭腳向后伸。解剖可見肝出血、壞死，腎腫大。再后來鴨子也被波及。追根溯源，最大的嫌疑是飼料。這些可憐的火雞和鴨子吃的是花生餅?；ㄉ炇腔ㄉビ椭笫Ｏ碌臍堅?，富含蛋白質(zhì)，是很好的禽畜飼料?？茖W(xué)家們很快從花生餅中找到了罪魁禍?zhǔn)祝环N真菌產(chǎn)生

3、的毒素。它被命名為“aflatoxin ”，就是現(xiàn)在所說的黃曲霉毒素。黃曲霉毒素黃曲霉毒素點擊錄入內(nèi)容點擊錄入內(nèi)容點擊錄入內(nèi)容點擊錄入內(nèi)容顯微鏡下的黃曲霉黃曲霉毒素的檢測意義黃曲霉毒素的檢測意義 n毒性極強毒性極強1993年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機構(gòu)劃定為類致癌物，是一種毒性極強的劇毒物質(zhì)，僅次肉毒霉素，是目前已知霉菌中毒性最強的。黃曲霉毒素的檢測意義黃曲霉毒素的檢測意義 n毒性極強毒性極強急性毒性急性毒性：比氰化鉀大10倍，比砒霜大68倍。 慢性毒性慢性毒性：肝臟損害，呈急性肝炎、出血性壞死、肝細(xì)胞脂肪變性和膽管增生。脾臟和胰臟也有輕度的病變。 黃曲霉毒素的檢測意義黃曲

4、霉毒素的檢測意義 n存在極其廣泛存在極其廣泛主要存在于土壤，動植物及各種堅果中。家庭自制發(fā)酵食品等也經(jīng)常發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素。一般在熱帶和亞熱帶地區(qū)，食品中黃曲霉毒素的檢出率比較高。未能及時曬干或儲藏不當(dāng)?shù)募Z食容易產(chǎn)生，在農(nóng)作物正常的生長期中也可以形成。黃曲霉毒素的檢測意義黃曲霉毒素的檢測意義n存在極其廣泛存在極其廣泛中藥中容易產(chǎn)生黃曲霉毒素的有：種子、果實、糧谷類中藥材或含此類藥材的中成藥；發(fā)酵類中藥；貯存期中藥材、中成藥; 油性成分多的中藥材歐盟歐盟（g/kg）德國德國（g/kg）中國香港中國香港（g/kg）中國（中國（g/kg）黃曲霉毒素黃曲霉毒素Alfatoxin B1食用花生食用花生 8，

5、食用堅果、玉米、調(diào)味品食用堅果、玉米、調(diào)味品 5，食用干制水果及其制品食用干制水果及其制品 2，生乳、熱處理牛奶，嬰幼兒食生乳、熱處理牛奶，嬰幼兒食品品 0.1，嬰幼兒奶粉嬰幼兒奶粉 0.1，嬰幼兒食療食品嬰幼兒食療食品0.1.藥材藥材 2藥材藥材 5玉米、花生及其制品玉米、花生及其制品 20，大米、植物油大米、植物油 10，其他糧食、豆類、發(fā)酵食品其他糧食、豆類、發(fā)酵食品 5，嬰幼兒配方食品嬰幼兒配方食品 5.藥材藥材 5黃曲霉毒素黃曲霉毒素AlfatoxinsB1,B2,G1,G2食用堅果、玉米、調(diào)味品食用堅果、玉米、調(diào)味品 10，食用干制水果及其制品食用干制水果及其制品 4.藥材藥材 4

6、藥材藥材 10藥材藥材 10黃曲霉毒素的檢測意義黃曲霉毒素的檢測意義n國際上對中藥材中黃曲霉毒素的檢測越來越多國際上對中藥材中黃曲霉毒素的檢測越來越多黃曲霉毒素的種類及性質(zhì)黃曲霉毒素的種類及性質(zhì) 根據(jù)在紫外線照射下產(chǎn)生熒光顏色的不同，分為B族和G族兩大類及其衍生物ACCD PPTB族：藍(lán)色熒光1G族：黃綠色熒光212黃曲霉毒素的種類及性質(zhì)黃曲霉毒素的種類及性質(zhì)n生長溫度生長溫度最低6-8，最高達(dá)44-46，32時黃曲霉毒素B1的產(chǎn)量最高。 黃曲霉毒素的種類及性質(zhì)黃曲霉毒素的種類及性質(zhì)n化學(xué)結(jié)構(gòu)化學(xué)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)類似結(jié)構(gòu)類似，目前發(fā)現(xiàn)約20余種，已分離鑒定出12種：B1,B2,G1,G2,M1,M2,

7、P1,Q,H1,GM,B2a和毒醇. 基本結(jié)構(gòu)基本結(jié)構(gòu)：二呋喃環(huán)和香豆素,B1是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌?即含有一個雙呋喃環(huán)和一個氧雜萘鄰?fù)ㄏ愣顾兀?前者為基本毒性結(jié)構(gòu)，后者與致癌有關(guān). 黃曲霉毒素的種類及性質(zhì)黃曲霉毒素的種類及性質(zhì)n化學(xué)結(jié)構(gòu)化學(xué)結(jié)構(gòu)B1,B2,G1,G2,M1,M2M1是B1在體內(nèi)經(jīng)過羥化而衍生成的代謝產(chǎn)物M1、M2主要存在于牛奶中B1：最常見、毒性及致癌性最強黃曲霉毒素化學(xué)結(jié)構(gòu)式 黃曲霉毒素化學(xué)結(jié)構(gòu)式 黃曲霉毒素化學(xué)結(jié)構(gòu)式 理化性質(zhì)理化性質(zhì)相對分子量為312-346難溶于水、易溶于油，甲醇、丙酮和氯仿等有機溶劑，但不溶于石油醚、己烷和乙醚中中性溶液及弱酸性溶液中較穩(wěn)定，

8、強酸性溶液中稍有分解，強堿溶液中分解迅速純品為無色結(jié)晶.在紫外光燈下，B1、B2發(fā)藍(lán)色熒光，G1、G2發(fā)綠色熒光耐高溫，一般烹調(diào)溫度不能破壞，B1的分解溫度為268紫外線對低濃度黃曲霉毒素有一定的破壞性黃曲霉毒素現(xiàn)有檢測方法介紹黃曲霉毒素現(xiàn)有檢測方法介紹n薄層層析法薄層層析法：靈敏度低，定量困難nHPLC-紫外檢測法紫外檢測法：不衍生，靈敏度低，采用UPLC可以增強靈敏度nHPLC-熒光檢測法熒光檢測法：需衍生，靈敏度高（目前藥典采用此法）黃曲霉毒素現(xiàn)有檢測方法介紹黃曲霉毒素現(xiàn)有檢測方法介紹n免疫化學(xué)分析方法免疫化學(xué)分析方法 酶聯(lián)免疫吸附法：快速、簡便、單一毒素、假陽性多免疫親和柱-熒光分光光

9、度法：高效、無毒、假陽性多微柱篩選法 ：半定量，測總量一步式黃曲霉毒素檢測金標(biāo)試紙法 ：快速、現(xiàn)場大批量初篩nHPLC/MS/MS ：不衍生，靈敏度高，假陽性少，成本高LC-MS/MSLC-MS/MSHPLCHPLCTLCTLCGCGC色譜學(xué)方法色譜學(xué)方法黃曲霉毒素現(xiàn)有檢測方法介紹黃曲霉毒素現(xiàn)有檢測方法介紹免疫學(xué)方法免疫學(xué)方法ELISA膠體金黃曲霉毒素現(xiàn)有檢測方法介紹黃曲霉毒素現(xiàn)有檢測方法介紹n2005年增補本年增補本附錄附錄：第一次增加了黃曲霉毒素測定法歷年中國藥典標(biāo)準(zhǔn)收載狀況歷年中國藥典標(biāo)準(zhǔn)收載狀況 n2010年版一部年版一部正文：正文：僵蠶、陳皮、酸棗仁、桃仁、胖大海品種項下增加了黃曲霉

10、毒素殘留量檢查附錄：附錄：繼續(xù)收載了黃曲霉毒素測定法歷年中國藥典標(biāo)準(zhǔn)收載狀況歷年中國藥典標(biāo)準(zhǔn)收載狀況 歷年中國藥典標(biāo)準(zhǔn)收載狀況歷年中國藥典標(biāo)準(zhǔn)收載狀況 n 2010年版一部第二增補本年版一部第二增補本： 修訂了附錄方法 刪除了流速規(guī)定 增訂了另一種衍生方法：即光化學(xué)衍生法 取消了免疫親和柱的品牌規(guī)定n2015年版總則草案年版總則草案歷年中國藥典標(biāo)準(zhǔn)收載狀況歷年中國藥典標(biāo)準(zhǔn)收載狀況 增加了第二法：增加了第二法：高效液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜法附注附注：當(dāng)測定結(jié)果超出限度時,采用第二法進(jìn)行確認(rèn)2351 黃曲霉毒素測定法黃曲霉毒素測定法n2015年版總則草案年版總則草案歷年中國藥典標(biāo)準(zhǔn)收載狀況歷年中國藥

11、典標(biāo)準(zhǔn)收載狀況 糧谷類、種子類、油性成分多的品種應(yīng)注意黃曲霉毒素的檢測處方中含有易污染的藥材以及生粉投料的中成藥品種應(yīng)注意相關(guān)真菌毒素的檢測9305 中藥中真菌毒素測定指導(dǎo)原則中藥中真菌毒素測定指導(dǎo)原則n2015年版總則草案年版總則草案歷年中國藥典標(biāo)準(zhǔn)收載狀況歷年中國藥典標(biāo)準(zhǔn)收載狀況 根據(jù)具體品種和具體污染狀況，參考相關(guān)品種國外藥典和各國、各國際組織相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)等規(guī)定，盡可能控制在最低范圍內(nèi)B1 限量和 B1、 B2、 G1、 G2 總和的限量9302 中藥有害殘留物限量制定中藥有害殘留物限量制定 指導(dǎo)原則指導(dǎo)原則歷年中國藥典標(biāo)準(zhǔn)收載狀況歷年中國藥典標(biāo)準(zhǔn)收載狀況 n2015年版正文年版正文未查

12、到具體品種規(guī)定是否有變化黃曲霉毒素藥典檢測方法詳解黃曲霉毒素藥典檢測方法詳解n 液相條件：C18，甲醇-乙腈-水（40:18:42）n 衍生方式：柱后碘衍生、柱后光化學(xué)衍生。n 混合對照品溶液的制備：液體標(biāo)液（B1B2G1G2=10.310.3 ug/ml）梯度稀釋500倍。n 供試品溶液的制備：15g粉末，3gNaCl，70%甲醇提取，免疫親和柱純化。n 測定： 吸取混合對照品溶液5l、10l、15l、20l、25l，注入色譜儀，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取供試品溶液20-25l，測定。中藥中黃曲霉毒素藥典檢測方法詳解中藥中黃曲霉毒素藥典檢測方法詳解 n方法來源方法來源：中國藥典2010年版第二增補本

13、附錄 V 黃曲霉毒素測定法 n基本步驟基本步驟提取過柱洗脫測定樣品前處理樣品前處理免疫親和柱免疫親和柱純化純化柱后衍生、柱后衍生、HPLC檢測檢測上樣上樣洗滌洗滌洗脫洗脫檢測流程檢測流程提取提取過濾除雜過濾除雜稀釋稀釋黃曲霉毒素檢測主要設(shè)備氣孔操作架免疫親和柱黃曲霉毒素檢測主要設(shè)備氣孔操作架免親和柱黃曲霉毒素檢測主要設(shè)備HPLC-熒光檢測器光化學(xué)衍生器黃曲霉毒素檢測主要設(shè)備免疫親和柱IAC洗脫，將結(jié)合在抗體上的待測物沖洗下來進(jìn)入儀器檢測 上樣，載體上的抗體結(jié)合樣品中的待測物清洗，將雜質(zhì)沖洗干凈抗待測物（半抗原）抗體待測物（半抗原）無關(guān)雜質(zhì)固相載體（凝膠）免疫親和柱的原理免疫親和柱的原理用大劑量

14、的黃曲霉毒素單克隆抗體固化在水不溶性的載體上然后裝柱而成方法詳解方法詳解n操作中可能出現(xiàn)的問題及注意點操作中可能出現(xiàn)的問題及注意點對照品溶液的配制 取樣 ：混勻，嚴(yán)格按要求取樣，要有代表性提取 ：方式可比較后選擇濾過 :普通濾紙有吸附，可采用玻璃纖維濾紙或離心方法詳解方法詳解n操作中可能出現(xiàn)的問題及注意點操作中可能出現(xiàn)的問題及注意點凈化和富集凈化和富集采用免疫親和柱，柱子是用大劑量的黃曲霉毒素單克隆抗體固化在水不溶性的載體上然后裝柱而成原理：抗原、抗體反應(yīng)，注意點：澄清、含醇量、pH、流速、脫水 n其它注意事項：其它注意事項：親和柱儲存、使用溫度，接頭、容器洗滌方法詳解方法詳解黃曲霉毒素標(biāo)液s

15、upelco黃曲霉毒素的衍生化黃曲霉毒素的衍生化n衍生原因衍生原因 B1、G1熒光遇水要淬滅，檢測前需要衍生化n藥典附錄收載的兩種衍生方法藥典附錄收載的兩種衍生方法碘衍生法：碘作為衍生劑，對衍生溫度有要求，試劑對儀器有腐蝕性，需要沖洗。光化學(xué)衍生法：紫外光燈（254）nm照射，操作簡單，對衍生溫度無要求，無需沖洗衍生原理衍生原理AFB1AFG1黃曲霉毒素的衍生化黃曲霉毒素的衍生化紫外光燈照射紫外光燈照射 增強B1、G1的熒光強度。黃曲霉毒素的衍生化黃曲霉毒素的衍生化黃曲霉毒素的檢測n熒光檢測器熒光檢測器，激發(fā)波長 = 360nm (或 365nm) ， 發(fā)射波長= 450nm n靈敏度高靈敏度

16、高，可用于痕量檢測檢測方法詳解檢測方法詳解 n方法難點：方法難點：痕量分析：PPb級別，靈敏度高，要有質(zhì)量保證體系：重復(fù)性、標(biāo)準(zhǔn)曲線、隨行回收、陰性樣品、陽性樣品、質(zhì)控樣品黃曲霉毒素在樣品中分布不均勻中藥樣品種類多，基質(zhì)各異，成分復(fù)雜，提取困難假陽性及假陰性的排除：多種方法比較，隨行空白，液質(zhì)聯(lián)用，關(guān)閉衍生器報告具體值報告具體值低于檢測限（標(biāo)出檢測限）低于檢測限（標(biāo)出檢測限） 報告具體值報告具體值限度內(nèi)限度內(nèi)限度外限度外結(jié)果報告黃曲霉毒素檢測安全防護措施黃曲霉毒素檢測安全防護措施 n應(yīng)有相應(yīng)的安全、防護措施，并不得污染環(huán)境應(yīng)有相應(yīng)的安全、防護措施，并不得污染環(huán)境n黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品禁用固體黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品禁用固體n實驗全程佩戴手套實驗全程佩戴手套n殘留有黃曲霉毒素的廢液或廢渣的玻璃器皿，殘留有黃