咪唑乙煙酸高效降解細菌的篩選及其原生質(zhì)體制備的研究(完成)

1、東北農(nóng)業(yè)大學學士學位論文 學號：A03050160咪唑乙煙酸高效降解細菌的篩選及其原生質(zhì)體制備的研究學生姓名：王任指導教師：李春艷 教授所在院系：資源與環(huán)境學院所學專業(yè)：生物技術研究方向：應用微生物東 北 農(nóng) 業(yè) 大 學中國·哈爾濱2010 年 5 月Dissertation for Bachelors Degree of Mrtheart Agricultural University NO.：A03050160Study on the Screening of Imazethapyr Degradation Bacteria and Protoplast PreparationC

2、andidate: Wang RenSupervisor: Pro. Li ChunyanCollege: Resources Environment collegeSpeciality: BiotechnologyOrientation: Applied MicrobiologyNortheast Agricultural UniversityHarbin ChinaMay. 2010摘要除草劑咪唑乙煙酸是咪唑琳酮類性除草劑。咪唑乙煙酸具有殺草譜廣、選擇性強、活性高等優(yōu)點，在世界范圍內(nèi)得到廣泛應用。自從1993年咪唑乙煙酸國產(chǎn)化，成本下降，用量大幅增加，在我國大豆產(chǎn)區(qū)得到大面積的推廣和應用。

3、咪唑乙煙酸殘效期長，使下茬敏感作物容易產(chǎn)生藥害，因此其在土壤中的歸趨行為越來越引起重視。原生質(zhì)是有組織的生活物質(zhì)，是細胞生命活動的物質(zhì)基礎。原生質(zhì)體是由原生質(zhì)特化而來。原生質(zhì)體技術的關鍵是對細胞壁進行消化，以形成大量的原生質(zhì)體，并使原生質(zhì)體能高頻率的再生細胞壁，回復到正常細胞狀態(tài)。本文利用富集馴化技術從長期生產(chǎn)咪唑乙煙酸的農(nóng)藥廠排污口處污泥及污水中馴化培養(yǎng)得到能夠降解咪唑乙煙酸的細菌1株, 標記為P310-1，該菌株能夠以咪唑乙煙酸為唯一碳源穩(wěn)定生長。本實驗采用化學方法制備篩選所得的降解菌的原生質(zhì)體，經(jīng)測定，當穩(wěn)定劑為pH6.5、再生培養(yǎng)基的pH為7.5時，菌株P310-1原生質(zhì)體制備及再生的

4、最佳條件為：溶菌酶濃度、溫度、酶解時間條件為：2.9 mg/ mL、35、3.50 h。并采用藥敏片方法測定降解菌的抗藥性，并將其作為遺傳標記，為對降解菌的后續(xù)原生質(zhì)體融合研究提供試驗數(shù)據(jù)。關鍵詞：咪唑乙煙酸；降解菌；分離；原生質(zhì)體制備AbstractHerbicide imazethapyr is the imidazolinone herbicide. Imazethapyr is a one of broad spectrum herbicides, also has high selectivity and high activity, therefore it had been wi

5、dely used around the world. Since 1993, the imazethapyr has been localization, and its cost has reduced, application amount has increased, it began to get the promotion and application of large area in Soybean producing areas of our country. The longer residual period of imazethapyr could make drug

6、misadventure for sensitive crops, so the fate of its in the soil has been more and more attention.Archoplasm is the organizational living material, is the the material basis of cell vital movement, all the archoplasm has the similar basic components and characteristics. Protoplast is specializatione

7、d from the archoplasm. The key of protoplast technology is to digest the cell wall to form a large number of the protoplasts, and to make protoplast can regeneration cell wall altofrequently, so that to back to the normal cell state. In this paper, the bacteria 1 degrading imazethapyr can be acquire

8、d from the sludge and sewage in the long-term producting-imazethapyr factory by enrichment acclimation technique, labeled as P310-1, this bacteria can be stabilizly live with imazethapyr as the sole carbon.In this study, the protoplasts degradation bacteria prepared by chemical screening was determi

9、ned that when the stabilizer is pH6.5 and regeneration medium pH was 7.5, protoplast preparation and regeneration optimum conditions of Strain P310-1: lysozyme concentration, tempera- ture, reaction time conditions were: 2.9 mg / mL、 35 、 3.50h.And the drug resistance of degradation bacteria was det

10、ermined by using susceptibility test, and as genetic markers for providing the research test data on study of the subsequent of degradation bacteria protoplast fusion.Key words: imazethapyr ; degradation bacteria; screen; protoplast preparation目錄摘要IAbstractII1 前言11.1 咪唑啉酮類除草劑的發(fā)展概況1咪唑啉酮類除草劑的應用1咪唑啉酮類除

11、草劑作為長殘效除草劑的危害1治理生物降解菌的優(yōu)點11.2 咪唑乙煙酸的簡介1理化性質(zhì)11.3 生物修復2生物修復的定義、分類，微生物修復2微生物降解農(nóng)藥的研究2基因工程菌在微生物降解、生物修復中的應用31.4 原生質(zhì)體融合的研究進展3定義、原理、應用方向3構建方法、影響因素3原生質(zhì)體融合在微生物降解中的應用41.5 本研究的目的及意義42 材料與方法62.1 試驗材料6試驗儀器6試驗藥品及試劑6試驗培養(yǎng)基的配制72.2試樣采集7試樣來源7試樣采集72.3 降解菌的馴化與分離純化82.4 回接試驗及高效降解菌篩選82.5 降解菌株的形態(tài)學觀察8降解菌菌體形態(tài)的觀察8降解菌菌落形態(tài)的觀察8降解菌液

12、體培養(yǎng)觀察82.6 降解菌株原生質(zhì)體制備及再生影響因素的研究9降解菌株P310-1遺傳標記篩選9菌株P310-1原生質(zhì)體的制備及再生93 結果與分析123.1 咪唑乙煙酸降解菌株的篩選123.2 降解菌株原生質(zhì)體制備及再生的研究12降解菌株P310-1遺傳標記篩選12降解菌株D310-1生長曲線繪制13菌株P310-1原生質(zhì)體制備及再生影響因素分析144 討論164.1 咪唑乙煙酸降解菌的篩選164.2 降解菌P310-1原生質(zhì)體制備及再生影響因素165 結論18參考文獻19致謝211 前言1.1 咪唑啉酮類除草劑的發(fā)展概況 咪唑啉酮類除草劑的應用咪唑啉酮類除草劑是20世紀80年代美國氰胺公司

13、發(fā)現(xiàn)的一類超高效除草劑。主要用于大豆、花生、蔬菜等旱田作物，防除眾多的一年生和多年生禾本科雜草以及闊葉雜草、莎草科雜草等。咪唑啉酮類除草劑的作用機理是：這類除草劑是乙酰乳酸合成酶（ALS）或乙酰羥酸合成酶（AHAs）的抑制劑，即通過根、莖、葉吸收，并在木質(zhì)部和韌皮部傳導，積累于植物分生組織內(nèi)，抑制植物的乙酰乳酸合成酶，阻止支鏈氨基酸，如頡氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的生物合成，從而破壞蛋白質(zhì)的合成，干擾DNA合成及細胞的分裂與生長，最終造成植株死亡。 咪唑啉酮類除草劑作為長殘效除草劑的危害咪唑啉酮類除草劑作為一種長殘效除草劑很難分解。比如我國北方地區(qū)的寒冷氣候條件使土壤中長殘效除草劑很難在短時間內(nèi)降

14、解。嚴重影響了種植業(yè)結構調(diào)整和換茬輪作，南方多季種植結構仍會造成除草劑的殘留藥害。因此有關長殘效除草劑的危害問題日趨嚴重。 治理生物降解菌的優(yōu)點生物降解菌在處理長殘效除草劑的危害方面具有速度快、消耗低、效率高、條件溫和，無二次污染、對環(huán)境友好等顯著優(yōu)點，為從根本上解決長殘效除草劑的危害問題提供了無限的希望。1.2 咪唑乙煙酸的簡介 理化性質(zhì)咪唑乙煙酸，通用名稱咪草煙(imazethapyr)， 純品外觀為白色無味結晶體，熔點172750.蒸汽壓<0.013 mPa(60)。15時在水中的溶解度為1.3 mg/L，丙酮中48.2 g/L，二氯甲烷185 g/L，甲醇105 g/L

15、。原藥有效成分含量為92%，熔點169173，常溫條件下貯存穩(wěn)定。制劑外觀為棕色透明液體，相對密度1.01，沸點與水接近，不易燃，不易爆炸，貯存穩(wěn)定期2年以上?；瘜W名稱為:5乙基2 (4異丙基4甲基5氧代2咪唑琳酮2基)煙酸，分子式C15H19N3O3，分子量289.3，其化學結構式如下圖: 咪唑乙煙酸可被植物的葉片和根系吸收，在木質(zhì)部與韌皮部內(nèi)傳導，積累于分生組織。其作用方式是抑制乙酞乳酸合成酶(ALS)，從而造成支鏈氨基酸纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸的生物合成受阻，破壞蛋白質(zhì)合成，使植物生長受抑制而死亡。而被豆科植物吸收后，在體內(nèi)很快被分解，在大豆體內(nèi)的半衰期僅16 d，故對大豆安全。1.3

16、生物修復 生物修復的定義、分類，微生物修復生物修復(Bioremediation)是指利用微生物或其他生物將存在于土壤、地下水和海洋中的有毒、有害污染物降解為二氧化碳和水或轉(zhuǎn)化為無害物質(zhì)的處理方法，與物理化學方法相比，被公認為是一種有效、安全、廉價和無二次污染的方法。一般分為植物修復、動物修復和微生物修復三種類型。根據(jù)生物修復的污染物種類，它可分為有機污染生物修復和重金屬污染的生物修復和放射性物質(zhì)的生物修復等。微生物修復技術是指通過微生物的作用清除土壤和水體中的污染物，或是使污染物無害化的過程。它包括自然和人為控制條件下的污染物降級或無害化的過程。微生物代謝方式豐富多樣，底物范圍廣，從復雜的有

17、機大分子如纖維素、木質(zhì)素甚至包括人造的高聚化合物尼龍到簡單無機小分子如H2和CO2。作為生態(tài)系統(tǒng)的重要成員，微生物必將在污染物的去除中發(fā)揮重要的作用，成為生物修復中的主力軍。與焚燒、填埋、化學處理等方法相比，微生物修復具有廉價、環(huán)境破壞性小、可行等優(yōu)點。因而對象土壤和地下水污染的原位修復，應用生物學的方法是非常具有潛力和競爭力的。 微生物降解農(nóng)藥的研究農(nóng)藥微生物降解作用其實質(zhì)是酶促反應，農(nóng)藥微生物降解途徑已有大量研究，大多數(shù)農(nóng)藥的微生物降解途徑已明了。綜合來說，農(nóng)藥微生物降解的途徑包括氧化、還原、水解、脫鹵、縮合、脫梭、異構化等。農(nóng)藥本身的物理性質(zhì)，尤其是內(nèi)部化學鍵、濃度、水溶性、分子極性、生

18、物可利用性、化合物的吸附性、降解代謝的基因池存在與否和環(huán)境因子 (溫度、鹽度、pH、氧化還原電位、營養(yǎng)可利用程度)等是影響農(nóng)藥等頑固性化合物生物降解和修復的主要因素。微生物對環(huán)境污染物修復能否最終實現(xiàn)不僅僅依賴于其本身的降解能力，而且也依賴于污染物的生物可利用性以及細菌與土著微生物之間的競爭能力等因素?；衔锎嬖诘慕缑嬗绕渲匾?，因為其不僅影響農(nóng)藥的吸附性，而且能影響不同的微生物類群形成和基因的水平轉(zhuǎn)移性。因此，污染物的生物可利用性成為成功生物修復的重要障礙之一，增加污染物的溶解性和生物可利用性是生物學方法進行成功修復的必要條件。近幾年來，科研工作者開始研究細菌的趨化性(chemotaxis)和

19、調(diào)控污染環(huán)境中降解基因的水平轉(zhuǎn)移來增強細菌的生物修復效果。 基因工程菌在生物修復中的應用傳統(tǒng)生物處理污染物的方法大多是對自然生長的微生物群體加以馴化,繁殖利用,即微生物的混合培養(yǎng)。微生物混合培養(yǎng)在處理污染物的過程中,因其代謝過程復雜,能量利用不經(jīng)濟,使污染物的降解效率不高,而且大多混合培養(yǎng)的微生物菌間的相互關系和作用機制的研究還不夠深入。因此,目前對于其協(xié)同作用關系的菌株篩選和組合是一個隨機過程,缺乏有效的理論指導,而且,對于已經(jīng)應用的混合微生物培養(yǎng)體系也不能有效地協(xié)調(diào)菌間關系,使其達到最佳生態(tài)水平,發(fā)揮最大效應,影響了生物降解效率。因而,人們開始引入一些新興的生物工程技術,從一般的篩選工作轉(zhuǎn)

20、入到降解代謝途徑,降解酶系組成以及其遺傳的控制機制上來,在此基礎上,實現(xiàn)定向育種,定向構建具高效生物降解能力的基因工程菌。利用生物工程技術構建的基因工程菌,既具有混合菌的功能,又擁有純培養(yǎng)菌株營養(yǎng)要求單一,生理代謝穩(wěn)定,易于調(diào)控等優(yōu)點外,還具生長繁殖迅速、絮凝性好和具高降解活性的特征。1.4 原生質(zhì)體融合的研究進展 定義、原理、應用方向原生質(zhì)體融合（protoplast fusion)是20世紀70年代發(fā)展起來的重要基因重組技術。經(jīng)過30余年的發(fā)展，己經(jīng)成為細菌遺傳育種的一項基木技術。原生質(zhì)體融合也稱細胞融合(cell fusion)，是將雙親株細胞通過酶解破壁(動物細胞除外)，使之成為球狀的

21、原生質(zhì)體，然后等量混合十高滲緩沖液中，在物理的(如電融合)或化學的(如聚乙二醇)或生物的(如仙臺病毒)助融作用下，使雙親的原生質(zhì)體發(fā)生相互凝集，通過細胞質(zhì)融合(plasmogamy)、核融合(karyogamy)，進行基因組建的交換、重組，然后在適宜的條件下再生出細胞壁，獲得融合子(fusant重組子)的過程。原生質(zhì)體融合技術不但可以改良菌種遺傳性狀、提高有用代謝產(chǎn)物產(chǎn)量，還可以綜合不同菌株代謝特征，產(chǎn)生新的有用代謝產(chǎn)物，在工業(yè)生產(chǎn)和遺傳育種上展示出美好的應用前景。同轉(zhuǎn)化、接合、轉(zhuǎn)導、雜交和轉(zhuǎn)染等傳統(tǒng)基因重組方式相比較，原生質(zhì)體融合具有廣泛適應性和隨機性，能夠打破菌株的種屬界限，實現(xiàn)遠緣菌株間

22、的融合；可以使遺傳物質(zhì)傳遞更為完整，獲得更多基因重組機會；可以和其他育種方法相結合，綜合雙親的多種優(yōu)良性狀；在工業(yè)菌株的選育過程中，可以實現(xiàn)定向育種；能夠用于遺傳分析等基礎理論研究等。這些方而的優(yōu)點，對于微生物育種工作者極具吸引力。 構建方法、影響因素細胞去壁可以在高滲穩(wěn)定劑存在的溶液中加入裂解酶和(或)細胞合成抑制劑的作用來達到。至于原生質(zhì)體再生為正常型細胞的條件，在原核微生物和真核微生物中都已很好地確定。在大多數(shù)情況下，用于融合試驗的菌株具有營養(yǎng)缺陷、抗藥性、溫度敏感性、呼吸缺陷、形態(tài)或顏色標記。達到互補是原生質(zhì)體融合成功的標記。當然，還要采用必要的控制測定回復突變或除原生質(zhì)體融合外的其它

23、途徑達到的基因轉(zhuǎn)移。融合頻率的計算通常是根據(jù)互補的頻率，但這二種頻率不能認為是相同的，例如融合也可以在二株無互補關系的菌株間發(fā)生。融合頻率一般常以互補的菌落數(shù)(采用營養(yǎng)缺陷型菌株融合.在非完全培養(yǎng)基上長出的菌落)對非互補的菌落數(shù)(僅生長在完全培養(yǎng)基上的菌落)的比較值表示.這類初步的融合產(chǎn)物還要用細胞學、生化學和遺傳學的方法來確證.融合的程序開始是由于強烈脫水而引起原生質(zhì)體的粘合，不同程度地形成聚集物。原生質(zhì)體收縮且高度變形.大量粘著的原生質(zhì)體形成非常緊密的接觸，接著可能是如同在紅血球膜上觀察到的緊密接觸處的膜間蛋白質(zhì)顆粒的轉(zhuǎn)位和它們的聚集，然后似乎是鄰近的裸露蛋白膜之間的脂-脂相互反應。由于C

24、a2+強烈地促進脂分子的擾動和重新組合，結果接觸處的膜形成小區(qū)域的融合，形成小的原生質(zhì)橋，然后增大，跟著二個原生質(zhì)體融合。1974年，匈牙利的Ferenczy報道了離心力誘導法對白地霉營養(yǎng)缺陷型突變株的原生質(zhì)體融合。隨后人們相繼用NaCl ,KCl和Ca(NO3)2等作為誘變劑進行融合，但融合頻率都很低。聚乙二醇在適量Ca2+存在下能有效地誘導植物原生質(zhì)體融合，Ca2+主要是通過維持膜結構的完整性來實現(xiàn)原生質(zhì)體的穩(wěn)定性與活性。原生質(zhì)體膜外在蛋白上二價陽離子的存在使膜脂流動性減慢、穩(wěn)定性增強，這種維持穩(wěn)定性的效果大小與膜表面分了數(shù)量的多少呈正比例關系，PEG種類對原生質(zhì)體融合的影響不大。此外，其

25、融合率還受其他諸因素的影響。影響原生質(zhì)體融合的因素很多，特別是環(huán)境中的陽離子存在，融合時的pH也對原生質(zhì)體融合有較明顯的影響。一般來講Ca2+ ,Mg2+有助于融合。如有0.O1 mol/L Ca2+存在時，可得到較高的融合率，但在缺乏鈣離子時，若pH較低，融合頻率也較高。這是因為鈣離子和帶負電荷的PEG與細胞膜表面分子相互作用，使原生質(zhì)體帶電，彼此易于附著發(fā)生凝集所致。 原生質(zhì)體融合在微生物降解中的應用利用原生質(zhì)體融合技術可將遺傳性狀不同的兩個細胞融合為一個新細胞,獲得集雙親優(yōu)良性狀于一體的理想菌株。目前,微生物降解有機污染物的研究方向是構建高效降解基因工程菌,現(xiàn)一般采用種間原生質(zhì)融合,并取

26、得了一些成果。原生質(zhì)體融合可以綜合不同菌株代謝特征，產(chǎn)生新的有用代謝產(chǎn)物，能夠打破菌株的種屬界限，實現(xiàn)遠緣菌株間的融合，可以遺傳物質(zhì)傳遞更為完整，獲得更多基因重組機會;可以和其他育種方法相結合，綜合雙親的多種優(yōu)良性狀;在工業(yè)菌株的選育過程中，可以實現(xiàn)定向育種;能夠用于遺傳分析等基礎理論研究等?？梢耘嘤龈咝?yōu)良的降解基因工程菌。1.5 本研究的目的及意義長殘效除草劑在我國使用面積迅速擴大，我國農(nóng)業(yè)種植業(yè)結構單一，輪作復雜，農(nóng)民施藥技術水平低，噴灑器械落后等原因，造成長殘效除草劑對后茬作物的藥害連年發(fā)生，日趨嚴重，己給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴重損失，并嚴重影響了農(nóng)業(yè)種植業(yè)結構的調(diào)整。目前解決長殘效除草劑

27、的污染和毒害問題，己成為一個亞待解決的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)問題和環(huán)保問題。本研究立足大豆田咪唑乙煙酸的使用情況，針對咪唑乙煙酸殘留的問題，旨在篩選出能夠高效降解咪唑乙煙酸的微生物，并對其進行原生質(zhì)體制備及再生研究，目的是為培養(yǎng)出更高效的降解基因工程菌提供有效的理論及實驗依據(jù)，為其能夠在生產(chǎn)實踐中應用奠定堅實的理論基礎，為推動生物修復除草劑耕地污染的研究和發(fā)展，解決長殘效除草劑殘留藥害問題提供一條有效的途徑，使其能更好的服務農(nóng)業(yè)，對進一步促進我國種植業(yè)結構的調(diào)整和經(jīng)濟的快速發(fā)展、治理生態(tài)環(huán)境、實現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展、保證綠色食品生產(chǎn)基地安全等方面起到至關重要的作用。 2 材料與方法2.1 試驗材料 試驗儀器采

28、樣器材類：鐵鍬、鐵叉、刀具、樣品袋、樣品箱以及適合特殊采樣要求的工具等。 采樣文具類：樣品標簽、采樣記錄表、鉛筆、資料夾等。微生物實驗室常用儀器設施：培養(yǎng)皿、試管、接種環(huán)、接種針、酒精燈、電爐、鋁鍋、紗布、標簽紙酸度計等。表2-1 實驗所用主要儀器名稱型號生產(chǎn)廠家雙人單面凈化工作臺SW-CJ-2FD蘇州凈化設備有限公司生化培養(yǎng)箱SPX-250B-Z上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠手提式高壓蒸汽滅菌器YXQ-SG46-280S上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠數(shù)顯鼓風干燥箱GZX-9240上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠空氣浴振蕩器HZQ-C中國哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司萬分之一電子天平AL204

29、上海梅特勒-托利多儀器有限公司分光光度計TU-1810 S北京普析通用儀器有限責任公司光學顯微鏡YS100日本 Nikon臺式高速離心機TGL-20-B湖南星科科學科學儀器有限公司超聲波振蕩器AS2060BAutomatic Science Instrument Co.Ltd循環(huán)水式多用真空泵SHB-鄭州長城科工貿(mào)有限公司旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE52C上海亞榮生化儀器廠高效液相色譜儀AgelienT1100美國安捷輪科技有限公司電熱恒溫水浴鍋DK-98-I天津市泰斯特儀器有限公司PCR儀PTC-200MJResearch公司電泳儀DYY-11北京市六一儀器廠移液器各型號北京吉爾森科技有限公司 試驗藥品及

30、試劑98.4咪唑乙煙酸原藥由沈陽同樣化工有限公司提供，原藥用甲醇溶解。低熔點瓊脂糖、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉為奧瑞星生物工程公司產(chǎn)品，抗生素藥敏片購自杭州天和微生物試劑有限公司，磷霉素由東北制藥總廠提供，利福平、溶菌酶、PEG、Tris、RNaseA為Sigma公司藥品， EDTA-Na2為B.M分裝，其他藥品和試劑均為國產(chǎn)分析純。 試驗培養(yǎng)基的配制 降解菌株篩選用培養(yǎng)基馴化培養(yǎng)基（g/L）：K2HPO4 O.1 g，CaSO4 0.04 g，MgSO47H2O 0.2 g，NaCl 0.1 g，F(xiàn)eSO47H2O 0.001 g，(NH4)2SO4 0.1 g，調(diào)pH 7.0-7.2，蒸餾水定

31、容1000 mL，121 滅菌20 min，配制固體培養(yǎng)基時按2%的比例添加瓊脂粉。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g，NaCl 10.0 g，蒸餾水定容1000 mL，pH調(diào)至7.0，121 ，高壓滅菌20 min，配制固體培養(yǎng)基時按2%的比例添加瓊脂粉，121 ，高壓滅菌20 min?；A鹽培養(yǎng)基（g/L）：K2HPO4 0.7 g，KH2PO4 0.9 g，MgSO47H2O 0.125 g，Na2MoO42H2O 0.005 g，pH調(diào)至6.0，121 高壓滅菌20 min，配制固體培養(yǎng)基時按2%的比例添加瓊脂粉，121 ，高壓滅菌20 min。2.1.

32、3.2 原生質(zhì)體制備試驗用培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，牛肉膏5 g，NaCl5 g，葡萄糖10 g，0.5 M蔗糖,10 mM MgCl2·6H2O。高滲溶液(g/L)：蔗糖188 g， MgCl2·6H2O 0.4 g, 加蒸餾水至1 L。溶菌酶液：以無菌的高滲溶液為溶劑配制成10 mg/L的溶菌酶溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾滅菌。其中，完全培養(yǎng)基、高滲溶液根據(jù)不同試驗目的調(diào)節(jié)pH值，各培養(yǎng)基均121滅菌20 min，在配制固體培養(yǎng)基時按2%添加瓊脂粉。2.2 試樣采集 試樣來源污泥來源：沈陽市某常年生產(chǎn)咪唑乙煙酸化工廠排污口處的污泥，污泥樣品為黑褐

33、色，含粒狀砂石。廢水水源：沈陽市某常年生產(chǎn)咪唑乙煙酸化工廠排污口河段水面下1015 cm深度的河水，河水基本透明，呈微黃色有一定量的懸浮物，微異味。 試樣采集按梅花形分布取的耕地土樣、蛇形法取污泥及水樣，按1：1的比例將兩種取樣混合作為待測樣。2.3 降解菌的馴化與分離純化取50 g混合樣放入100 ml馴化培養(yǎng)基中，加入咪唑乙煙酸，使其終濃度為100 mg/L，28、140 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)5 d，然后取出10 ml菌液加入到90 ml新鮮馴化培養(yǎng)液中，穩(wěn)定該濃度培養(yǎng)5 d，然后每隔5 d以10%(體積分數(shù))的接種量接入新鮮的含咪唑乙煙酸馴化培養(yǎng)液中，以梯度差100 mg/L逐漸提高咪

34、唑乙煙酸濃度，每濃度穩(wěn)定培養(yǎng)一次，至終濃度為1000 mg/L。將馴化培養(yǎng)液制備成 10-5 -10-9 系列稀釋液，采用稀釋倒皿法、含1000mg/L咪唑乙煙酸的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基分離對咪唑乙煙酸有降解能力的細菌，30培養(yǎng)至長出但菌落，然后根據(jù)其不同的外觀形態(tài)挑取單菌落，采用劃線法反復純化降解菌株，直至獲得單菌落。2.4 回接試驗及高效降解菌篩選將純化獲得的菌株用劃線轉(zhuǎn)接至含咪唑乙煙酸濃度為1000 mg/L的固體馴化培養(yǎng)基上，30 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，同時轉(zhuǎn)回接至含咪唑乙煙酸濃度為1000 mg/L的馴化培養(yǎng)液中，取生長狀況良好，可使液體搖瓶中同時出現(xiàn)渾濁的菌株以上述條件繼續(xù)轉(zhuǎn)接，保留可穩(wěn)定傳

35、代3代以上的菌株，采用液相色譜法檢測篩選所獲菌株的對咪唑乙煙酸的降解能力，選擇降解能力最高的菌株進行后續(xù)試驗。將所得降解菌株分別接種于含咪唑乙煙酸濃度為1000 mg/L牛肉蛋白胨試管斜面培養(yǎng)基上，4冰箱保存?zhèn)溆谩?.5 降解菌株的形態(tài)學觀察2.5.1 降解菌菌體形態(tài)的觀察將固體基礎培養(yǎng)基上不同生長期的降解菌體進行革蘭氏染色、芽孢染色，在光學顯微鏡，相差顯微鏡鏡下觀察菌體形態(tài)。2.5.2 降解菌菌落形態(tài)的觀察按無菌操作要求，制作的基礎培養(yǎng)基固體平板，30-37恒溫去冷凝水后，采用劃線法接種菌懸液，倒置平板，于30培養(yǎng)，至出現(xiàn)單菌落。菌落形態(tài)觀察：形態(tài)、大小、邊緣、表面、隆起形狀、透明度、菌落及

36、培養(yǎng)基的顏色。2.5.3 降解菌液體培養(yǎng)觀察按無菌操作要求，用接種環(huán)沾取少量菌懸液接種于液體基礎培養(yǎng)基搖瓶中，30，200 r/min培養(yǎng)，分別于1 d、2 d、3 d、4 d后觀察培養(yǎng)物是否產(chǎn)生菌膜、渾濁、沉淀或掛壁情況。2.6 降解菌株原生質(zhì)體制備及再生影響因素的研究2.6.1 降解菌株P310-1遺傳標記篩選本研究采用以抗生素對降解菌的抑制做菌株的遺傳標記。取0D600=1.0的新鮮菌液100L，涂布法均勻涂布于牛肉膏蛋白胨固體平板上，同時以無菌鑷子取含抗生素的紙片置于含菌平板上，采用藥物紙片瓊脂擴散法(簡稱紙片法)進行降解細菌P310-1抗生素敏感性試驗。將加載藥敏片的菌板30倒置培養(yǎng)

37、48-72h后，取出觀察抑菌圈大小，從而確定菌株P310-1對每種抗生素的敏感性，平行試驗3次。試驗用抗生素紙片如下:新生霉素、林可霉素、磷霉素、氟哌酸、環(huán)丙沙星、克拉霉素、萬古霉素、頭孢霉素、先峰噻肟、多粘菌素、甲氧胺嘧啶、米諾霉素、麥迪霉素、乙酰螺旋霉素、萘啶酸、替考拉寧、紅霉素、苯唑青霉素、四環(huán)素、強力霉素、克林霉素、呋喃妥因、阿奇霉素、阿米卡星、羧芐青霉素、氨芐青霉素、青霉素G、依諾沙星、慶大霉素、利福平、卡那霉素、鏈霉素。2.6.2 菌株P310-1原生質(zhì)體的制備及再生 采用光電比濁法測定細菌數(shù)量，繪制生長曲線。取繼代3次的降解菌純培養(yǎng)菌株按2%體積接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，500

38、 mL三角瓶裝液200 mL，設五個重復瓶，置于30，200 r/min恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)。每次取樣3 mL，測定600 nm處的吸光值(測前振蕩培養(yǎng)液，使細胞均勻分布，對細胞密度大的培養(yǎng)液用培養(yǎng)基適當稀釋，使其光密度OD600在 0.10.65之間)。當一個重復瓶中的樣品體積消耗大約30 mL后，換一個重復瓶取樣，以消除體積改變過大或者取樣操作過程中不慎污染帶來的誤差。以不加菌的培養(yǎng)基為對照，6 h以后再每隔4 h取一次樣(預實驗表明6 h不會進入對數(shù)生長期)，至菌體生長達到衰亡期為止。以培養(yǎng)時間為橫坐標，以吸光值OD600nm為縱坐標繪制曲線。2.6.2.2 原生質(zhì)體制備再生培養(yǎng)方法取生長

39、至適宜時期的菌體，7000 r/min離心5 min，棄上清，無菌水洗滌菌體2次，高滲穩(wěn)定劑洗滌2次，將菌體懸于高滲溶液中，調(diào)節(jié)菌液濃度使其OD600在1.3左右，取3 ml至無菌試管中，加入一定量的溶菌酶液，于恒溫水浴中作用一定時間，期間不定時震蕩試管，使溶菌酶作用均勻充分，作用完成后取1ml 3500r/min離心10min以終止酶作用，柔和操作，避免破壞原生質(zhì)體，加高滲溶液1ml懸浮原生質(zhì)體；取原生質(zhì)體懸浮液50L至200倍無菌水中，震蕩混勻，靜置60 min，取50L以完全培養(yǎng)基雙層平板法（底層瓊脂濃度2%,雙層瓊脂濃度0.7%）30恒溫培養(yǎng)，觀察菌體細胞經(jīng)溶菌酶作用的破壁情況。取50

40、 L原生質(zhì)體懸浮液至200倍體積的高滲穩(wěn)定劑中，混勻后取50L以完全培養(yǎng)基雙層平板法30恒溫培養(yǎng)，觀察原生質(zhì)體破壁情況。另取不加酶處理、其他操作一致的菌液做對照。2.6.2.3 細胞破壁再生率計算公式細菌破壁后形成只有細胞膜包裹原生質(zhì)的原生質(zhì)體，原生質(zhì)體對滲透壓十分敏感，在低滲條件下容易發(fā)生破裂，所以必須以高滲透壓溶液維持原生質(zhì)體的穩(wěn)定，而酶解液也必須用相應的高滲穩(wěn)定液來配制。將經(jīng)酶作用生成的原生質(zhì)體懸液移至蒸餾水中，在室溫中放置60min，在此過程中，由于滲透壓作用，原生質(zhì)體將爆裂而不能再生，進行再生培養(yǎng)后按以下公式計算原生質(zhì)體的破壁及再生率。原生質(zhì)體形成率=(A-B)/A ×10

41、0%原生質(zhì)體再生率=（C-B）/(A-B) ×100%式中：A：酶解前每0.5L菌液在高滲平板上長出的菌落數(shù)B：酶解后每0.5L菌液蒸餾水中爆裂60min后在高滲平板上長出的菌落數(shù)C：酶解后每0.5L菌液在高滲平板上長出的菌落數(shù)2.6.2.4 菌株P310-1原生質(zhì)體制備和再生條件的探索1 菌齡對原生質(zhì)體制備和再生的影響分別取培養(yǎng)至菌株生長對數(shù)期初期（OD600=1.30±0.5）、對數(shù)期中期（OD600=1.60±0.5）、穩(wěn)定期初期（OD600=1.80±0.5）的降解菌懸液，按2.6.2.2進行其他處理，觀察菌齡對破壁及再生的影響。2 穩(wěn)定劑配比及

42、pH值對菌株P310-1原生質(zhì)體釋放的影響1）高滲溶液影響高滲穩(wěn)定劑的種類及濃度：選則NaCl與蔗糖加MgCl2·6H2O兩組分別配置滲透壓穩(wěn)定劑，其中蔗糖加MgCl2·6H2O按照表2-2中所列濃度值配置成不同比例，分別試驗以確定最佳的種類及比例。以不加穩(wěn)定劑的培養(yǎng)基做對照試驗。表2-2 高滲穩(wěn)定劑配比種類濃度 (M)NaCl0.6蔗糖+MgCl2·6H2O蔗糖0.4、0.45、0.5、0.55、0.6MgCl2·6H2O0、0.01、0.02、0.03高滲穩(wěn)定劑的pH值:調(diào)節(jié)高滲穩(wěn)定劑的pH以選擇有利于溶菌酶作用的酸堿環(huán)境，pH調(diào)節(jié)范圍：pH58差值

43、0.5。按2.6.2.2進行其他處理，觀察穩(wěn)定劑種類、濃度及酸堿度對菌體細胞破壁與再生的影響。3 再生培養(yǎng)基對菌株P310-1原生質(zhì)體再生的影響 再生培養(yǎng)基配比：分別試驗MNP 、MNP 、完全培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基5種再生培養(yǎng)基子培養(yǎng)菌株P310-1原生質(zhì)體時的情況。再生培養(yǎng)基初始pH值調(diào)至7.0。再生培養(yǎng)基的pH：調(diào)節(jié)雙層再生培養(yǎng)基的pH，選擇有利于原生質(zhì)體再生的酸堿環(huán)境，pH調(diào)節(jié)范圍：6.58.0差值0.5。按2.6.2.2進行其他處理，觀察再生培養(yǎng)基配比及酸堿度對菌體細胞破壁與再生的影響。4 酶解濃度、時間、溫度對原生質(zhì)體制備和再生的影響設定預實驗，分別研究酶解濃度、時間、溫度

44、對菌株P310-1原生質(zhì)體制備和再生存的影響，試驗梯度依次為：終濃度達0.58.5 mg/ml梯度差值0.5 mg/ml， 0.53.5 h差值0.5 h及32、35、37、39，其主要范圍值確定在： 2.1、2.5、2.9 mg/ml，酶解時間：2、2.75、3.5，酶解溫度：35、37、39。因其間的相互影響作用，采用正交試驗確定使原生質(zhì)體制備和再生達到最佳的酶解濃度、時間、溫度組合。按2.6.2.2進行其他處理，觀察酶解濃度、時間、溫度對原生質(zhì)體制備和再生的影響。設計三組條件的正交組合見表2-3，正交實驗Lg(33)組合見表2-4。表2-3 原生質(zhì)體制備影響因素代號影響因素菌株P310-

45、11酶濃度（mg/ml）2.12.52.92溫度（）3537393時間（h）22.753.5表2-4 正交實驗組合表Lg(33)列號酶濃度（mg/ml）溫度（）時間（h）1111212231334213522162327312832393313 結果與分析3.1 咪唑乙煙酸降解菌株的篩選經(jīng)過馴化、分離篩選后，最終獲得一株可以咪唑乙煙酸為唯一碳源，在含1000 µg /ml咪唑乙煙酸的無機鹽平板上穩(wěn)定的高效降解咪唑乙煙酸的降解細菌，標記為P310-1。在細菌培養(yǎng)基固體平板上培養(yǎng)，表面光滑濕潤，邊緣整齊，不透明。革蘭氏染色見其形態(tài)特征：G-，無芽孢，在生長周期中有先桿狀后橢圓形的轉(zhuǎn)變。菌

46、株特征具體描述見圖3-1及表3-1。圖3-1 P310-1菌落特征表3-1 降解菌株P310-1的形態(tài)特征菌體形態(tài)菌落形態(tài)培養(yǎng)液狀態(tài)形狀先桿狀后橢圓黃褐色、不規(guī)則圓形、粘稠、有彈性、不易挑取、表面光滑、邊緣整齊、無熒光、中心隆起的大菌落液體表面不形成菌膜，整個培養(yǎng)液呈白色，均勻、粘稠、有掛壁現(xiàn)象，4d后培養(yǎng)基顏色逐漸加深大小1.0-2.5m ×1.5-4.0m革蘭氏染色芽孢纖毛周生莢膜膨大脂質(zhì)粒+3.2 降解菌株原生質(zhì)體制備及再生的研究3.2.1 降解菌株P310-1遺傳標記篩選降解菌株P310-1的生長受不同抗生素影響見表3-2。表3-2 菌株P310-1的抗生素抗性試驗結果抗生素

47、（g/片）P310-1（cm）抗生素（g/片）P310-1（cm）抗生素（g/片）P310-1（cm）萬古霉素（30）3.0林可霉素（2）2.0依諾沙星（10）1.2阿米卡星（30）2.1慶大霉素（10）2.7利福平（5）0卡那霉素（30）3.0替考拉寧（30）0米諾環(huán)素（30）3.5阿奇霉素（15）1.8四環(huán)素（30）3.2新生霉素（30）3.7紅霉素（15）2.3頭孢噻吩（30）0強力霉素（30）3.0克林霉素（2）2.8多粘菌素B（30）1.2苯唑青霉素（1）0克拉霉素（15）4.2環(huán)丙沙星（5）2.0磷霉素（200）4.2氨芐青霉素（10）2.2乙酰螺旋霉素（30）3.1羧芐青霉素（1

48、00）2.0麥迪霉素（30）2.6青霉素G（10）2.5氟哌酸（10）2.4先鋒噻肟（30）2.6鏈霉素（10）3.5萘啶酸（30）2.9甲氧胺嘧啶3.3呋喃妥因（30）0注：表中所測數(shù)據(jù)為抑菌圈的直徑。根據(jù)抑菌圈在0-5 mm表示無作用，6-15 mm弱作用，>15 mm強抑制作用，由藥敏試驗結果可知：利福平、替考拉寧、頭孢噻吩、苯唑青霉素、呋喃妥因?qū)310-1無作用，依諾沙星、多粘菌素B有弱作用，試驗范圍內(nèi)的其他抗生素均有強抑制作用；3.2.2 降解菌株D310-1生長曲線繪制 按照2.6.2.1操作獲得降解菌株P310-1的生長周期分布，見圖3-2。由圖可知，菌株P310-1在牛

49、肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)生長迅速，30 h后即可進入穩(wěn)定期，按照延滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰減期時間分布選擇適合原生質(zhì)體試驗的生理狀態(tài)進行后續(xù)試驗。圖3-2 降解菌株P310-1生長曲線3.2.3 菌株P310-1原生質(zhì)體制備及再生影響因素分析 3.2.3.1 菌齡對原生質(zhì)體制備和再生的影響在本試驗中，菌株P310-1菌體生長至對數(shù)期中、后期（穩(wěn)定期初期）時菌體破壁及再生效果接近，后期效果略好于中期，明顯優(yōu)于初期。表3-3 不同菌齡的破壁及再生效果初始OD600值菌株P310-1破壁率%再生率%破壁率×再生率1.810051.280.511.699.8849.940.501.310044

50、.830.453.2.3.2 穩(wěn)定劑配比及其pH值對菌株P310-1原生質(zhì)體釋放的影響按照2.6.2.3（2）中所列的穩(wěn)定劑配比范圍，進行組合，逐一檢測，測得出發(fā)菌株的原生質(zhì)體各破壁和再生率。試驗結果證明0.55 M蔗糖+0.02 M MgCl2·6H2O為最佳組合，兩株菌的破壁率大于80%，破壁率×再生率均大于0.5。穩(wěn)定劑pH值對菌株P310-1原生質(zhì)體制備和再生的影響較大（表3-4），在穩(wěn)定劑為pH6.5時，菌株P310-1的破壁率×再生率達0.72，破壁率84.33%。表3-4 不同pH值對破壁及再生的影響初始pH值菌株P310-1破壁率%再生率%破壁率&

51、#215;再生率684.8280.270.686.584.3385.830.72779.3774.990.607.580.8573.330.593.2.3.3 再生培養(yǎng)基及其pH值對菌株P310-1原生質(zhì)體再生的影響由表3-5可以看出，菌株P310-1的原生質(zhì)體在5種再生培養(yǎng)基上都可以生長，但在MNP上再生長量很少；完全培養(yǎng)基中進行再生培養(yǎng)時，不易形成單菌落現(xiàn)象；完全培養(yǎng)基中再生培養(yǎng)，菌落較小，且生長時間較完全培養(yǎng)基中長；完全培養(yǎng)基中再生株菌生長較分散、菌落相對較小，2-3 d可完成再生培養(yǎng)，菌株P310-1可在完全培養(yǎng)基中良好再生原因可能在于此培養(yǎng)基中主要成分是蔗糖，而細菌、放線菌中多數(shù)菌采

52、用糖系統(tǒng)作穩(wěn)定劑。表3-5 不同培養(yǎng)基對再生的影響培養(yǎng)基菌株P310-1MNP MNP 完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基注：“”表示再生菌株較多，效果明顯，“”表示有再生菌株，“”再生菌株較少由再生培養(yǎng)基pH值對原生質(zhì)體再生影響的試驗顯示：菌株P310-1形成的原生質(zhì)體在pH6的再生培養(yǎng)基上生長效果不滿足實驗要求，pH，確定再生培養(yǎng)基的pH為7.5。3.2.3.4 酶解濃度、時間、溫度對原生質(zhì)體制備和再生的影響溶菌酶的濃度、作用時間及作用溫度是菌體原生質(zhì)體釋放、再生的關鍵，是影響原生質(zhì)體融合的主要因素。隨著溶菌酶濃度的增加，原生質(zhì)體化程度會增加，但過量的酶作用，會造成細胞壁去除過于徹底，缺少細胞

53、壁再生的引物，會導致再生率降低；酶濃度過大也會引起菌體凝聚成團，降低菌酶接觸面積，不利于原生質(zhì)體的制備；酶解時間短，酶解不徹底，酶解時間長，細胞壁溶解的徹底，但過長時間，溶菌酶繼續(xù)作用原生質(zhì)體，致其損傷、破裂，無法再生；酶解溫度適宜，使酶活性完全發(fā)揮，利于酶解反應，但如果酶解溫度過高，溶菌酶鈍化、失活，溫度過低，會延長酶解時間，影響試驗進程。由預實驗可知，在酶解過程中溶菌酶的濃度、作用時間及作用溫度對對原生質(zhì)體制備及再生影響是相互關聯(lián)的，試驗中將作綜合考慮，結果見表3-6。表3-6 菌株原生質(zhì)體制備正交試驗結果列號因素1因素2因素3破壁率×再生率11110.5421220.54313

54、30.7242130.7052210.5262320.6873120.6683230.4993310.58均值10.6000.6330.547均值20.6330.5170.627均值30.5770.6600.637極差0.0560.1430.090由預實驗可知，在酶解過程中溶菌酶的濃度、作用時間及作用溫度對原生質(zhì)體制備及再生的影響是有相互影響的，綜合考慮進行正交試驗，結果見表3-6。由各因素均值分析可知：菌株P310-1破壁及再生最佳組合條件為A2B3C3，即最佳條件配比為：酶解37、作用時間3.50 h、加溶菌酶2.9 mg/mL，根據(jù)極差分析各因素對破壁及再生影響大小順序依次為：溶菌酶作用

55、溫度>作用時間>酶濃度。4 討論4.1 咪唑乙煙酸降解菌的篩選本試驗采取液體富集培養(yǎng)方法，以長期使用長殘留除草劑咪唑乙煙酸的土壤為分離源，以咪唑乙煙酸為目標菌株生長的限制性底物，并逐漸提高選擇壓(增加咪唑乙煙酸的濃度)來誘導菌株的適應能力，經(jīng)長期的液體富集培養(yǎng)，然后在含藥的基礎培養(yǎng)液中進行篩選，在這種選擇壓力的作用下，淘汰不適應的菌群，適應的生存下來，并逐漸增強了其適應能力，即可分離、純化出可降解咪哇乙煙酸的高效菌株。制備土壤浸出液時，直接在無機鹽培養(yǎng)基中加入低濃度的農(nóng)藥，一方面利于選擇，因為目標菌能利用農(nóng)藥作為碳源和氮源在不含外源碳源和氮源的培養(yǎng)基中生長，而其他菌種由于缺少能源，不能生長。另一方面，在不斷更換新鮮培養(yǎng)基加大稀釋倍數(shù)的同時，也要加大農(nóng)藥的濃度，使菌種逐步被分離且性狀穩(wěn)定。 保存菌種時，需始終維持底物（咪唑乙煙酸）含量，避免篩選獲得菌株的降解能力的退化。 4.2 降解菌P310-1原生質(zhì)體制備及再生影響因素 本試驗是設定其他條件一定的情況下試驗其他條件對