新生兒缺氧缺血性腦病動物模型的建立

1、新生兒缺氧缺血性腦病動物模型的建立【關(guān)鍵詞】 新生兒 缺氧缺血性腦病 動物模型新生兒缺氧缺血性腦?。╤ypoxicischemic encephalopathy, HIE）是指由于圍產(chǎn)期窒息缺氧導(dǎo)致腦的缺氧缺血性損傷，患兒生后出現(xiàn)一系列神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的表現(xiàn)。如果不經(jīng)過積極正規(guī)的治療，患兒的死亡率高，存活者常留下或輕或重的神經(jīng)后遺癥。HIE不僅嚴(yán)重威脅著新生兒生命健康，并且是國內(nèi)外傷殘兒童重要病因之一，給家庭和社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)1。在國內(nèi)外圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)界中，至今對HIE缺乏安全有效的治療方法，特別是對傳統(tǒng)常用藥物如苯巴比妥鈉、地塞米松及甘露醇等，國外嚴(yán)格的對照研究發(fā)現(xiàn)，這些藥物對腦損害及預(yù)后的改善

2、并不理想，這主要是因為新生兒大腦與成人大腦在發(fā)育和功能等方面存在有巨大的差異2，對成人安全有效的藥物并不一定適用于新生兒。由于近年來對HIE發(fā)病機(jī)制的研究取得很多進(jìn)展，因此，根據(jù)發(fā)病機(jī)制去尋求改善腦損害的藥物一直是國內(nèi)外圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要課題。HIE發(fā)病機(jī)制和合理用藥的實驗研究基于動物實驗，要力尋解決HIE治療難題的途徑，首先要涉及HIE模型的制備。長期以來，圍繞著如何建立一種適用有效的HIE動物模型的問題，國內(nèi)外醫(yī)學(xué)工作者做了長期大量的研究工作。 1 模型動物的選擇 缺氧缺血造成的腦損傷在不成熟的大鼠、兔、綿羊及猴等實驗動物模型中得到證明，這些模型也已經(jīng)提供了大量重要的信息，不僅闡明了組織損

3、傷的病理和生理機(jī)制，而且為各種特殊治療策略的有效性提供了有力的證據(jù)。因此，在動物實驗研究中，常以缺氧缺血性腦損傷新生動物作為研究對象。Yager 等3曾在2004年作過統(tǒng)計，在200多種新生兒HIE相關(guān)動物實驗中，大鼠應(yīng)用最廣泛（29%），接著是豬（25%）和羊（20%）。在這些動物模型中，胚胎期或新生的恒河猴和未成熟的大鼠被研究應(yīng)用得最廣泛，因為這兩種新生動物在神經(jīng)解剖及生理復(fù)制等方面與人類最為接近，其中新生大鼠優(yōu)勢更多，如容易獲取，母鼠孕期短、繁殖快，1窩可生815只，費(fèi)用低，有利于實驗條件的控制，而新生豬、猴、羊等來源較困難，死亡率高，費(fèi)用高。因此，長期以來，國內(nèi)外醫(yī)學(xué)工作者常把新生大鼠

4、作為研究新生兒HIE的首選實驗動物。 2 模型動物年齡的選擇 用于新生兒HIE實驗的模型動物有很多，我們以應(yīng)用最多的新生大鼠為例。不同年齡的大鼠其大腦發(fā)育程度是不一樣的，研究發(fā)現(xiàn)，新生7 d大鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)是不成熟的，其發(fā)育程度類似于孕3234周的人類胎兒或新生兒4，大腦皮層的神經(jīng)分層完整，生發(fā)機(jī)制退化，白質(zhì)也已有少量髓鞘形成，其能量代謝、神經(jīng)遞質(zhì)、血流動力學(xué)、蛋白質(zhì)代謝以及免疫炎性改變等均能被很好地加以特征化5，其繼發(fā)能量衰竭及腦電圖類型與嚴(yán)重窒息新生兒的臨床發(fā)現(xiàn)相似，這對于評價神經(jīng)保護(hù)藥物的短期和長期療效尤為重要。因此長期以來，研究者大多采用新生7 d的大鼠作為新生兒HIE模型動物。隨著

5、研究的深入，超低齡大鼠（如生后12 d大鼠）也被用于試驗中，并且揭示出極度不成熟大腦在損傷易感性上有重要的差異，這為新生兒HIE的研究開辟了一條新的途徑。和新生7 d大鼠相比，超低齡大鼠的腦損傷要求更長時間和更嚴(yán)重程度的缺氧，而隨之產(chǎn)生的同側(cè)腦皮質(zhì)下白質(zhì)損傷也更加嚴(yán)重，主要是少突膠質(zhì)細(xì)胞的始祖細(xì)胞的死亡，這種神經(jīng)細(xì)胞雖然是過渡性的，卻起著非常重要的作用，它的過早死亡也許能更好地解釋在許多早產(chǎn)兒中普遍存在的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常以及單一的腦白質(zhì)損傷現(xiàn)象。 3 模型動物的誘導(dǎo)方法 建立動物模型的過程應(yīng)該盡量與新生兒HIE發(fā)病過程相似，這樣才能更好地模擬新生兒HIE的發(fā)生發(fā)展。單純?nèi)毖趸騿渭內(nèi)毖蛉毖醢槿?/p>

6、血是誘導(dǎo)缺氧缺血性腦損傷常用的方法，這些方法在某些研究細(xì)節(jié)上有著明顯的差別。長期以來，國內(nèi)外采用的新生兒HIE動物模型的誘導(dǎo)方法主要有： 3.1 經(jīng)典法 該法由Vannucci于1981年在Levine的成年大鼠缺氧缺血性腦損傷模型基礎(chǔ)上經(jīng)過改進(jìn)而建成，至今二十多年在全世界被廣泛應(yīng)用。其具體操作方法如下：生后7 d大鼠麻醉后行左頸總動脈結(jié)扎術(shù)，術(shù)后恢復(fù)48 h后置于氧濃度為8%、環(huán)境溫度為37 的密閉容器內(nèi)持續(xù)缺氧3.5 h。該法具有不少優(yōu)點，譬如容易實施，在血流變化以及細(xì)胞代謝紊亂等方面與出生時窒息情況很相似，花費(fèi)不多就能提供長時程的神經(jīng)病理性損害及功能的評估，還能用大量的動物做出保護(hù)性試劑

7、的劑量反應(yīng)性評價等。使用該方法，大腦損傷通常局限于頸總動脈結(jié)扎那一側(cè)的大腦半球，隨著缺氧持續(xù)時間的不同，出現(xiàn)選擇性神經(jīng)元死亡和梗塞，在大腦皮質(zhì)、海馬、紋狀體及丘腦都能看見組織損傷，皮質(zhì)下及腦室周圍白質(zhì)的損傷也能被觀察到6。這種模型已被證實在缺氧缺血性腦損傷對運(yùn)動能力、行為、癲癇發(fā)作、大腦成熟過程及其他機(jī)制的短期和長期影響的研究上是非常有用的。最近，隨著大腦缺氧缺血分子生物改變的確定，該模型已被用于基因改變的未成年大鼠的特殊研究。 3.2 局部短暫腦缺血及再灌注法 該法由S. Renolleau等建立，多年來已由Sola等人多次改進(jìn)7，基本操作如下：新生7 d大鼠麻醉后電凝左側(cè)大腦中動脈，再用夾

8、子夾閉左側(cè)頸總動脈1 h造成大腦局部缺血，1 h后去除夾子，使左頸總動脈再通，從而誘導(dǎo)再灌注形成。最近的研究表明，這類模型在腦缺血的不同時段其再灌注程度是不一樣的。在缺血后期，大量腦細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)嚴(yán)重酸中毒及ATP完全消失的現(xiàn)象，缺血后腦皮質(zhì)血流量很快下降到腦缺血前11%的水平。再灌注過程中，細(xì)胞內(nèi)的ATP及pH值在3 h內(nèi)都能恢復(fù)，頸動脈血流量也能恢復(fù)。該模型的誘導(dǎo)過程與新生兒HIE的發(fā)病過程相似811，主要用于研究暫時性缺血誘導(dǎo)的單純?nèi)毖]有缺氧）及再灌注后半胱氨酸天冬氨酸酶對新生鼠大腦的影響和半胱氨酸天冬氨酸酶抑制劑對新生兒HIE是否具有潛在治療作用。在臨床上，隨著新生兒重癥監(jiān)護(hù)的加強(qiáng)，腦

9、的缺血再灌注損傷經(jīng)常發(fā)生于新生兒HIE的搶救治療過程中，而該模型成功誘導(dǎo)新生7 d大鼠產(chǎn)生了腦缺血再灌注過程。此外，通過閉塞局部腦血管也能更好地界定腦梗塞范圍。 3.3 宮內(nèi)缺氧缺血法 多年以來，在新生兒HIE研究中最大的不足就是對宮內(nèi)缺氧缺血所致腦損傷不能進(jìn)行準(zhǔn)確真實的描述，而宮內(nèi)缺氧缺血正是新生兒HIE重要病因之一。最近幾年，國內(nèi)外醫(yī)學(xué)工作者正在逐步彌補(bǔ)這種不足，應(yīng)用最多的宮內(nèi)缺氧缺血模型有兩種：一種是誘導(dǎo)孕羊患上低氧血癥12；另一種是結(jié)扎孕羊臍帶13，從而造成胎羊?qū)m內(nèi)缺氧缺血性腦損傷。研究者應(yīng)用這兩種模型，獲取了豐富的神經(jīng)生理學(xué)相關(guān)資料，但這兩種模型仍然有很大缺陷：（1）孕羊體型大，價格

10、昂貴；（2）能確證受累胎羊腦損傷的可靠依據(jù)很少，從而不能對受累胎羊隨后的神經(jīng)行為學(xué)后果進(jìn)行測試。最近，一種新的模型極大的彌補(bǔ)了上述模型的不足，即用足月胎兔替代胎羊，這種新的模型能模擬急性胎盤供血不足所致的新生兒HIE，通過該法存活的新生兔明顯顯示出由于腦損傷所致的持久的肌張力過高和運(yùn)動行為缺陷等。 同類的實驗?zāi)Ｐ瓦€有： 腦室周圍白質(zhì)軟化模型14以及可同時造成神經(jīng)元丟失和腦室周圍白質(zhì)軟化模型等15，研究者可根據(jù)不同的目的和需要酌情選擇適用的模型。 4 尚需解決的問題 在多年以來的HIE動物模型研究過程中，仍然存在著不少尚未解決的問題，譬如經(jīng)典法模型就存在以下問題：第一，新生兒HIE患者全身各個系

11、統(tǒng)均遭受不同程度缺氧缺血打擊，而該模型只結(jié)扎一側(cè)頸總動脈，僅引起單側(cè)大腦病變，而不能使全腦及全身其他系統(tǒng)一同受損，因此不能造成臨床上嚴(yán)重窒息后經(jīng)常引起的多器官損傷，也不易建立足月兒常見的旁矢狀竇區(qū)損傷和早產(chǎn)兒多見的腦室周圍白質(zhì)軟化的損傷。由此看來，該模型病變分布與新生兒HIE并不完全一致。第二，在臨床上，缺氧窒息是新生兒HIE發(fā)病的核心，且大多源于胎兒宮內(nèi)窘迫及新生兒窒息，缺氧往往同時伴有缺血的存在，兩者沒有截然分開。而該法是通過先結(jié)扎單側(cè)頸總動脈造成缺血，然后再通過持續(xù)吸入低濃度氧造成缺氧，從而將缺氧缺血兩個過程先后分開，這與臨床上不一致。第三，該法采用的是逐只麻醉后進(jìn)行手術(shù)，如果要同時進(jìn)行

12、大批量的模型研究就顯得力所不及，且麻醉和手術(shù)必然會增加各種人為、外界環(huán)境因素對模型動物損傷程度的影響，從而造成各模型動物在損傷程度上的不一致。第四，該法不能進(jìn)行心血管監(jiān)測和反復(fù)抽取血樣。此外，大鼠為平腦動物，不似人腦呈多腦回，大鼠腦損傷后也不像臨床上新生兒腦損傷的程度和類型常呈多樣化等。 其他模型也存在有很多不足。Yang等16做過統(tǒng)計，從1955年至2004年，在對新生兒HIE動物模型的研究中，其中關(guān)于缺氧缺血后對中樞神經(jīng)系統(tǒng)影響的各種測試多在損傷后1 h內(nèi)進(jìn)行，只有39%的實驗在腦損傷24 h后對各種指標(biāo)進(jìn)行測試，大多數(shù)的研究都以急性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)代謝終點作為評估指標(biāo)，而只有少量研究對臨床的神經(jīng)學(xué)行為后果以及神經(jīng)病理學(xué)作出評估。迄今為止，還沒有一種理想的動物模型被認(rèn)為對所有的新生兒HIE研究適用。雖然有些模型在某些方面明顯優(yōu)于其他模型，但這取決于它所特定的研究問題，譬如胎羊及新生羊羔和新生豬適用于急性及亞急性的生理和代謝機(jī)制的研究，而齒鼠類和靈長類動物經(jīng)常被用于長期的神經(jīng)病理學(xué)及行為學(xué)后果的試驗研究中。 5 期望 隨著時間的推移和研究的深入，各種HIE動物模型也處于不斷的改進(jìn)之中，譬如各種新技術(shù)新方法的使用（如采用外科顯微鏡來做各種結(jié)扎手術(shù)），誘導(dǎo)腦損傷過程中缺氧缺血時間和程度也不斷在變化等。隨著基因技術(shù)的迅速發(fā)展，各種轉(zhuǎn)基因動物也在該試驗研