培養(yǎng)系応用成熟脳細(xì)胞培養(yǎng)法開発

1、培養(yǎng)系応用成熟脳細(xì)胞培養(yǎng)法開発坂口卓也1,2,3、岡田竜美3,4、汐見理沙3,4、池井崇真3、宮本朋幸2,3,4、薬師寺宏匡2,3,4、大野節(jié)代2,3、三宅康之1,2,3、大野英治1,2,3,41加計(jì)學(xué)園細(xì)胞病理學(xué)、2倉(cāng)敷蕓術(shù)科學(xué)大學(xué)生命科學(xué)部生命科學(xué)科、3産業(yè)科學(xué)技術(shù)學(xué)部生命化學(xué)科、4大學(xué)院産業(yè)科學(xué)技術(shù)研究科機(jī)能物質(zhì)化學(xué)専攻背景目的記憶司海馬、特徴的細(xì)胞構(gòu)築持。 神経細(xì)胞 集合歯狀回領(lǐng)域顆粒細(xì)胞層、CA3CA1至領(lǐng)域錐體細(xì)胞層形成。歯狀回CA3、CA3CA1軸索投射興奮性形成。神経情報(bào)処理參與神経膠細(xì)胞 細(xì)胞 、共存。海馬細(xì)胞変性伴癡呆発癥病研究、海馬培養(yǎng)標(biāo)本多用。培養(yǎng)海馬標(biāo)本胎生期脳分散細(xì)

2、胞用、源相當(dāng)數(shù)動(dòng)物脳必要、細(xì)胞未熟必成熟脳反映欠點(diǎn)。點(diǎn)改善為、予長(zhǎng)期培養(yǎng)一旦成熟海馬細(xì)胞分散再培養(yǎng)新規(guī)培養(yǎng)系開発試。培養(yǎng)深麻酔下生後5日齢脳摘出、350m 厚海馬作成。下部培地満膜靜置、培地/大気界面培養(yǎng)行。1996年版 “National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publications No. 80-23)” 準(zhǔn)拠、全手術(shù)行。細(xì)胞分散再培養(yǎng)1-6週間培養(yǎng)海馬蛋白分解酵素処理後、細(xì)胞分散反応血清停止。細(xì)胞洗浄後、-L-施円形含 12 穴細(xì)胞蒔布培養(yǎng)開始。一部検討、海馬歯

3、狀回領(lǐng)域切出培養(yǎng)。免疫細(xì)胞化學(xué)的解析標(biāo)本0.1%-X処理、細(xì)胞膜透過性増大。細(xì)胞形質(zhì)解析為、次抗體用免疫反応基解析行。 TuJ1：標(biāo)識(shí)、突起中微小管構(gòu)成蛋白 -Tubulin対抗體。 抗繊維酸性蛋白 GFAP 抗體：細(xì)胞一種、標(biāo)識(shí)抗體。 RIP：細(xì)胞一種、標(biāo)識(shí)抗體。結(jié)果1週間培養(yǎng)海馬分散細(xì)胞一旦全突起失、後再培養(yǎng)行突起伸展。2-6週間培養(yǎng)海馬分散細(xì)胞、一旦全突起失後數(shù)日間突起伸展伴著形態(tài)変化観察。後者標(biāo)本細(xì)胞発現(xiàn)蛋白解析、TuJ1、抗GFAP抗體、RIP各陽性反応示細(xì)胞観察。、通常観察TuJ1抗GFAP抗體、TuJ1RIP両方陽性反応示細(xì)胞観察?？疾鞌?shù)週間培養(yǎng)脳細(xì)胞分散再培養(yǎng)、源動(dòng)物脳自體必要

4、成熟脳細(xì)胞培養(yǎng)系確立成功。TuJ1、抗GFAP抗體、RIP陽性反応示細(xì)胞各、相當(dāng)海馬細(xì)胞示唆。TuJ1抗GFAP抗體TuJ1RIP両方陽性反応示細(xì)胞、既知細(xì)胞中間體示唆。技術(shù)成熟脳細(xì)胞研究、特?fù)p傷後脳再生機(jī)構(gòu)解析為有用手段期待。參考資料坂口卓也、培養(yǎng)脳発芽起?生物物理206:176-180, 1996.坂口卓也、培養(yǎng)脳創(chuàng)薬研究応用33:614-616, 1997.坂口卓也、培養(yǎng)脳研究応用脳科學(xué)20:1345-1350, 1998胚性幹細(xì)胞由來胚様體細(xì)胞形態(tài)學(xué)的解析薬師寺宏匡2,3、宮本朋幸2,3、守本容子3、織田智博3、大野節(jié)代2、三宅康之1,2、坂口卓也1,2、大野英治1,2,31加計(jì)學(xué)園細(xì)

5、胞病理學(xué)、2倉(cāng)敷蕓術(shù)科學(xué)大學(xué)生命科學(xué)部生命科學(xué)科、3大學(xué)院産業(yè)科學(xué)技術(shù)研究科機(jī)能物質(zhì)化學(xué)専攻背景目的幹細(xì)胞分化制御技術(shù)確立、再生醫(yī)療鍵。細(xì)胞分化研究際、好適材料胚性幹細(xì)胞 ES細(xì)胞 。中ES細(xì)胞倫理的問題抵觸、細(xì)胞多形分化能解析為多用。ES細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行個(gè)細(xì)胞分化多様性発現(xiàn)、細(xì)胞間相互関係変化起。一、胚様體呼細(xì)胞塊形成。細(xì)胞塊、ES細(xì)胞分化集合器官機(jī)能始示唆。近年、ES細(xì)胞分化機(jī)構(gòu)関分子生物學(xué)的手法用研究盛行。分化誘導(dǎo)一端胚様體形成手法、形態(tài)解析詳細(xì)報(bào)告少。今回、胎生幹細(xì)胞形成胚様體対象形態(tài)學(xué)的解析行。胚様體形成機(jī)構(gòu)解明為、発現(xiàn)蛋白解析試。、効果的分化誘導(dǎo)行為新規(guī)胚様體形成法検討。方法129SV

6、由來凍結(jié)胎生幹細(xì)胞解凍後、LIF含増殖培地中C処理済初代線維芽細(xì)胞用3日間培養(yǎng)、継代行。後処理細(xì)胞剝離、LIF抜分化誘導(dǎo)培地、微生物用、製、Hanging drop法用胚様體形成。培養(yǎng)皿中胚様體微分干渉顕微鏡観察、胚様體採(cǎi)取包埋切片作成、HE染色、免疫染色施検索。結(jié)果微生物用、製、Hanging drop法胚様體形成確認(rèn)。形成胚様體拍動(dòng)型非拍動(dòng)型大別、連続切片cystic typenoncystic type2分。cystic type內(nèi)腔一層円柱上皮様細(xì)胞被覆、noncystic type、心筋様細(xì)胞、腺管様細(xì)胞種細(xì)胞観察。胚様體相互融合面特異形態(tài)観察、E-cadherin発現(xiàn)確認(rèn)。考察胚様體形成ES細(xì)胞培養(yǎng)皿底部付著、底部細(xì)胞反発性持必要。今回結(jié)果確認(rèn)共、既知材質(zhì)止新