雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗(沙鼠腎細(xì)胞)

1、雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗（沙鼠腎細(xì)胞）Shuangjia Shenzonghezheng Chuxuere Miehuoyimiao （Shashushen Xibao）Haemorrhagic Fever with Renal Syndrome BivalentVaccine（Gerbil Kidney Cell ）, Inactivated本品系用型和型腎綜合征出血熱（簡(jiǎn)稱(chēng)出血熱）病毒分別接種原代沙鼠腎細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)、收獲病毒液，病毒滅活、純化，加入氫氧化鋁佐劑后制成，用于預(yù)防型和型腎綜合征出血熱。1 基本要求生產(chǎn)和檢定用設(shè)施、原材料及輔料、水、器具、動(dòng)物等應(yīng)符合 “凡例”的有關(guān)要求。2

2、制造2.1 生產(chǎn)用細(xì)胞生產(chǎn)用細(xì)胞為原代沙鼠腎細(xì)胞。 細(xì)胞管理及檢定應(yīng)符合“生物制品生產(chǎn)和檢定用動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程”規(guī)定。.1細(xì)胞制備選用1020日齡的清潔級(jí)沙鼠， 無(wú)菌取腎， 剪碎，經(jīng)胰蛋白酶消化分散細(xì)胞，加入適宜的培養(yǎng)液，接種培養(yǎng)瓶， 置37培養(yǎng)，形成均勻單層細(xì)胞。來(lái)源于同一批沙鼠、于同一容器內(nèi)消化制備的沙鼠腎細(xì)胞為一個(gè)細(xì)胞消化批，源自同一批沙鼠、于同一天制備的多個(gè)細(xì)胞消化批為一個(gè)細(xì)胞批。22 毒種 名稱(chēng)及來(lái)源生產(chǎn)用毒株為型出血熱毒株Z10株和型出血熱毒株Z37株， 或經(jīng)批準(zhǔn)的其他適應(yīng)沙鼠腎細(xì)胞的I型和II型出血熱毒株。 種子批的建立應(yīng)符合 “生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程”規(guī)定。

3、型和II型出血熱病毒分別接種乳鼠腦制備原始種子批和主種子批， 主種子批毒種接種原代沙鼠腎細(xì)胞制備工作種子批。型出血熱毒種Z10株原始種子批應(yīng)不超過(guò)第12代； 主種子批應(yīng)不超過(guò)第13代； 工作種子批應(yīng)不超過(guò)第14代；II型出血熱毒種Z37株原始種子批應(yīng)不超過(guò)第10代， 主種子批應(yīng)不超過(guò)第11代；工作種子批應(yīng)不超過(guò)第12代 。 種子批毒種的檢定主種子批應(yīng)進(jìn)行如下全面檢定，工作種子批應(yīng)至少進(jìn)行.1項(xiàng)檢定。.1鑒別試驗(yàn)各將各型毒種10倍系列稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度分別與已知的相應(yīng)型別的出血熱病毒血清參考品等量混合，同時(shí)以正常兔血清做空白對(duì)照， 置37水浴中和90分鐘，接種于單層Vero-E6細(xì)胞， 于34.5

4、±1培養(yǎng)， 觀察10-14天。以免疫熒光法測(cè)定， 中和指數(shù)應(yīng)大于1000。 同時(shí)設(shè)病毒陽(yáng)性對(duì)照、細(xì)胞陰性對(duì)照。.2病毒滴定將各型毒種10倍系列稀釋?zhuān)∵m宜稀釋度接種Vero-E6細(xì)胞，于34.5±1培養(yǎng)10-12天，以免疫熒光法測(cè)定，病毒滴度應(yīng)不低于6.0LgCCID50/ml。.3無(wú)菌檢查依法檢查（附錄XII A）, 應(yīng)符合規(guī)定。.4支原體檢查依法檢查（附錄XII B）, 應(yīng)符合規(guī)定。.5病毒外源因子檢查依法檢查（附錄XII C）, 應(yīng)符合規(guī)定。.6免疫原性檢查取主種子批毒種制備雙價(jià)原疫苗，接種體重為2kg左右的白色家兔4只（家兔血清出血熱病毒抗體檢測(cè)應(yīng)為陰性），每只后腿

5、肌內(nèi)注射1.0ml，14天后以同法再注射1.0ml。第1次免疫后4周采血分離血清，用蝕斑減少中和試驗(yàn)測(cè)中和抗體，中和用病毒為出血熱病毒76-118株和UR株；同時(shí)用參考血清作對(duì)照（應(yīng)符合參考血清效價(jià)的標(biāo)示值），每只家兔的I型和II型出血熱病毒中和抗體滴度均應(yīng)不低于1：10。 毒種保存凍干毒種保存于-20以下，液體種子批毒種應(yīng)于-60以下保存。23 單價(jià)原液細(xì)胞制備同.1 項(xiàng)。培養(yǎng)液培養(yǎng)液為加入適量滅能新生牛血清和MEM液或其他適宜培養(yǎng)液。新生牛血清的質(zhì)量應(yīng)符合要求（附錄XIII D）。對(duì)照細(xì)胞外源因子檢查依法檢查（附錄 XII C）,應(yīng)符合規(guī)定。病毒接種和培養(yǎng)當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)成致密單層后， 按0.2

6、MOI分別接種出血熱病毒I型和II型毒種(每個(gè)型別的同一工作種子批毒種應(yīng)按同一MOI接種)，置適宜的溫度下培養(yǎng)一定時(shí)間后， 棄去培養(yǎng)液， 用PBS沖洗去除牛血清， 加入適量的維持液， 置33-35繼續(xù)培養(yǎng)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間。病毒收獲培養(yǎng)適宜天數(shù)，收獲病毒液。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，可換以維持液進(jìn)行多次病毒收獲。同一細(xì)胞批的同一次病毒收獲液經(jīng)檢定合格后可合并為單次病毒收獲液。2.3.6 單次病毒收獲液檢定按3.1項(xiàng)進(jìn)行。2.3.7 單次病毒收獲液保存于28保存不超過(guò)30天。2.3.8病毒滅活單次病毒收獲液中按1：4000的比例加入-丙內(nèi)酯（應(yīng)在規(guī)定的蛋白質(zhì)含量范圍內(nèi)進(jìn)行病毒滅活），置28滅活適宜的時(shí)間后， 于

7、適宜的溫度放置適宜的時(shí)間，以確保-丙內(nèi)酯完全水解。病毒滅活到期后， 每個(gè)病毒滅活容器應(yīng)立即取樣， 分別進(jìn)行病毒滅活驗(yàn)證試驗(yàn)。2.3.9合并、離心、超濾濃縮同一細(xì)胞批的多次單次病毒收獲液經(jīng)檢定合格后可合并為單價(jià)病毒收獲同一細(xì)胞批的多次單次病毒收獲液經(jīng)檢定合格后可合并為單價(jià)病毒收獲液， 經(jīng)離心去除細(xì)胞碎片后，再進(jìn)行適當(dāng)倍數(shù)的超濾濃縮至規(guī)定的蛋白質(zhì)含量范圍。0純化采用柱色譜法或其他適宜的方法將濃縮后的單價(jià)病毒收獲液進(jìn)行純化。1 除菌過(guò)濾純化后的單價(jià)病毒收獲液經(jīng)除菌過(guò)濾后，即為單價(jià)病毒原液。2 單價(jià)原液檢定按3.2項(xiàng)進(jìn)行。3 單價(jià)原液保存于28保存不超過(guò)30天。2.4 半成品制備配制將型和型出血熱病毒

8、原液分別按抗原量為1：128稀釋后等量混合，加入適宜穩(wěn)定劑以及適量的硫柳汞作為防腐劑， 并加入終濃度為0.5mg/ml氫氧化鋁佐劑，即為半成品。 半成品檢定按3.3項(xiàng)進(jìn)行。2.5 成品分批應(yīng)符合 “生物制品分批規(guī)程”規(guī)定。 分裝應(yīng)符合 “生物制品分裝和凍干規(guī)程”規(guī)定。 規(guī)格每瓶為1.0ml。每1次人用劑量為1.0ml。 包裝應(yīng)符合 “生物制品包裝規(guī)程”規(guī)定。3 檢定3.1 單次病毒收獲液檢定 無(wú)菌檢查依法檢查（附錄XII A）,應(yīng)符合規(guī)定。支原體檢查依法檢查（附錄XII B）,應(yīng)符合規(guī)定。 病毒滴定按.2方法進(jìn)行病毒滴定。各型單次病毒收獲液的病毒滴度應(yīng)不低于6.5 Lg CCID50 /ml。

9、病毒滅活驗(yàn)證試驗(yàn)按滅活后的單次病毒收獲液總量的0.1%抽取供試品，透析后接種Vero-E6細(xì)胞， 連續(xù)盲傳3代，每10-14天為1代，每代以免疫熒光法檢查病毒抗原，結(jié)果均應(yīng)為陰性。抗原含量采用酶聯(lián)免疫法，抗原量應(yīng)不低于1：64。32 單價(jià)病毒原液檢定 無(wú)菌檢查依法檢查（附錄XII A）,應(yīng)符合規(guī)定。抗原量采用酶聯(lián)免疫法，抗原量應(yīng)不低于1：512。 蛋白質(zhì)含量應(yīng)不高于80g/ml， （附錄VI B第二法）。 牛血清白蛋白殘留量應(yīng)不高于50ng/ml（附錄VIII F）。33 半成品檢定無(wú)菌檢查依法檢查（附錄XII A）,應(yīng)符合規(guī)定。3.4 成品檢定 鑒別試驗(yàn)按.6項(xiàng)進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。效價(jià)測(cè)定不合

10、格時(shí)，鑒別試驗(yàn)不成立。 外觀應(yīng)為微乳白色混懸液體，久置形成可搖散的沉淀，無(wú)異物。 裝量按附錄I A裝量項(xiàng)進(jìn)行， 應(yīng)不低于標(biāo)示量。 化學(xué)檢定.1 pH值應(yīng)為7.28.0（附錄V A）。.2 硫柳汞含量應(yīng)不高于70g/ml（附錄VII B ） 。.3 氫氧化鋁含量應(yīng)不高于0.70mg/ml（附錄VII F） 。效價(jià)測(cè)定按.6項(xiàng)進(jìn)行。免疫4只家兔， 每只家兔對(duì)I型和II型出血熱病毒的中和抗體滴度均應(yīng)不低于1：10。 熱穩(wěn)定性試驗(yàn)疫苗出廠前應(yīng)進(jìn)行熱穩(wěn)定性試驗(yàn)。于37放置7天，按.6項(xiàng)進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，如合格，視為效價(jià)測(cè)定合格。 無(wú)菌檢查依法檢查（附錄XII A）,應(yīng)符合規(guī)定。 異常毒性檢查依法檢查（附錄XII F）,應(yīng)符合規(guī)定。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查應(yīng)小