細(xì)菌總數(shù)的測定

1、細(xì)菌總數(shù)的測定水與人類的生產(chǎn)活動(dòng)和日常生活息息相關(guān)。經(jīng)濟(jì)建設(shè)的高速發(fā)展，往往會(huì)使生活用水的水源水受到水中有害有毒物質(zhì)的污染；而生活污水、人、畜糞便會(huì)使甚或用水的水源水受到腐生性微生物的污染。被污染的水都不宜飲用。當(dāng)水體中含大量的病原問生物是往往會(huì)引起傳染病的發(fā)生，人體和動(dòng)物體的腸道中大約有400多種細(xì)菌，雖然，其中的腐生菌進(jìn)入水體不會(huì)引發(fā)人類的疾病，但隨著糞便一起排除的致病菌，如霍亂弧菌、傷寒沙門氏菌、痢疾志賀氏菌、阿米巴蟲、脊髓灰質(zhì)炎病毒和傳染性感染病毒等致病性微生物，則會(huì)引發(fā)人體的腸道傳染病。為保護(hù)人體健康，防止因水源水污染而造成的疾病發(fā)生和流行，必須對生活用水及其水源水進(jìn)行嚴(yán)格的水中細(xì)菌

2、學(xué)檢查。測定水樣是否合乎引用標(biāo)準(zhǔn)，一般包括：水中細(xì)菌總數(shù)測定和大腸菌群測定。本實(shí)驗(yàn)以自來水和天然水為水樣進(jìn)行細(xì)菌總數(shù)的測定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1)學(xué)習(xí)水樣的采取和水樣中細(xì)菌總數(shù)測定的方法(2)了解和掌握平板菌落計(jì)數(shù)的原則二、試驗(yàn)原理水中的細(xì)菌數(shù)可反映出水體被有機(jī)物污染的程度。細(xì)菌總數(shù)越多，說明水中有機(jī)物的含量就越高，本試驗(yàn)應(yīng)用平板菌落計(jì)數(shù)來測定水樣中的細(xì)菌總數(shù)。由于水中細(xì)菌的種屬不一，它們對營養(yǎng)成分和生長條件的要求差別很大，不可能設(shè)計(jì)出一種培養(yǎng)基在同一固定的條件下，能滿足水中所有細(xì)菌的營養(yǎng)要求使其都能生長繁殖，形成菌落。然而，腸道中的絕大多數(shù)腐生性和致病性的細(xì)菌，可在營養(yǎng)豐富的牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基上進(jìn)

3、行生長，出現(xiàn)肉眼可見的菌落，雖然這樣設(shè)計(jì)出來的水中細(xì)菌的總數(shù)實(shí)際上是一種近似值，但它基本上能代表水樣中細(xì)菌的數(shù)量。故而水中的細(xì)菌總數(shù)的測定和計(jì)算是指：在牛肉膏蛋白陳瓊脂培養(yǎng)基上，1ml水樣，經(jīng)37C,24h培養(yǎng)后所生出來的總菌數(shù)(包括腐生和致病細(xì)菌)，我國飲用水的衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)規(guī)定：在1ml自來水中細(xì)菌總數(shù)不得超過100個(gè)(1X102)。三、試驗(yàn)材料和用具(1)培養(yǎng)基牛肉骨蛋白陳瓊脂培養(yǎng)基(2)用具滅菌三角燒杯(體積為50ml或100ml),具玻塞的試劑瓶(體積為250ml,需滅菌)，滅菌培養(yǎng)基(=9cm),滅菌吸管或滅菌的塑料吸嘴，稀釋水樣用無菌水(在16mmx160mm試管中加9ml蒸儲(chǔ)水，滅

4、菌)，酒精四、試驗(yàn)方法(1)以無菌操作、用10倍稀釋法稀釋水樣。(2)用平皿傾注制備待測水樣平皿。五、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、水樣的采取(1)自來水先將自來水龍頭用火焰(酒精燈火用長柄銀子夾酒精棉球)灼燒2-3min滅菌，再開啟水龍頭水水流出5min。以滅菌三角燒杯接取水樣，待測(為節(jié)約用水，自來水龍頭一次滅菌后，試驗(yàn)者依次采取水樣)。(2)池塘水、河水或湖水應(yīng)取距水面10-15cm的深層水樣。先將已滅菌具玻璃的試劑瓶，瓶口向下浸入水中，在水中翻轉(zhuǎn)式瓶口向上，開啟瓶塞，待水盛滿后，在水中將瓶塞蓋好，再取出水面。取樣后應(yīng)立即進(jìn)行試驗(yàn)。如不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，應(yīng)于4c冰箱保存。2、細(xì)菌總數(shù)測定(1)自來水(以下操

5、作均需用無菌操作法進(jìn)行)用滅菌吸管或微量家養(yǎng)器吸取1ml水樣，注入滅菌培養(yǎng)中，共做2個(gè)平皿。分別向平皿中傾注15-20ml熔化并冷卻到45c左右的牛肉膏蛋白陳瓊脂培養(yǎng)基，制成平板，并立即輕輕搖勻(切忌濺到皿蓋上)，使水樣于培養(yǎng)基充分混合。取另一平皿，只加培養(yǎng)基，不加水樣，作為空白對照平板。待培養(yǎng)基充分凝固后，倒置于37c溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24h,進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。2個(gè)平板的平均菌落數(shù)即為1ml水樣的細(xì)菌總數(shù)。(2)池塘水、河水或湖水水樣稀釋。取1ml水樣水加入到第一支裝有9nl無菌水的試管中，振蕩均勻，水樣被稀釋10倍，稀釋度為10-1,再從此管中吸取1ml稀釋水樣介入到第二支裝有9ml無菌水的試管中，

6、振蕩均勻，水樣被稀釋100倍，稀釋度為10-2,如此稀釋則水樣被稀釋1000倍，10000倍稀釋度分別為10-3、10-4、。稀釋倍數(shù)視水樣污濁程度而定，中度污濁水樣可稀釋到10-310-4,中度污濁水樣可稀釋到10-410-5。吸取稀釋后水樣方法1:用無菌吸管或微量加以昂起分別從低稀釋度向高稀釋度吸取1ml水樣，即10-1(1ml)-10-2(1ml)-10-3(1ml),每一稀釋度需用一支無菌吸管或塑料吸嘴，不可用同一吸管連續(xù)吸取，不然，培養(yǎng)后出現(xiàn)的菌落數(shù)偏高，誤差大。方法2:用同一無菌吸管或微量加樣器，可從高濃度向低濃度連續(xù)吸取1ml水樣，即10-3(1ml)-10-2(1ml)-10-

7、1(1ml),由于高稀釋度10-3比10-2的菌數(shù)少，用同一吸管逐次連續(xù)吸取1ml,培養(yǎng)后的菌落數(shù)，偏差不大，此法快速，簡便。向每一個(gè)加油不同稀釋度水樣的平皿內(nèi)，傾注15-20ml培養(yǎng)基，混勻，每個(gè)稀釋度做2皿，計(jì)數(shù)時(shí)取2個(gè)拼版菌落數(shù)的平均數(shù)，作為該稀釋度的菌落數(shù)。另作不加水樣平板為空白對照。37c溫箱，倒置培養(yǎng)24h,進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。3、菌落計(jì)數(shù)方法(1)計(jì)算相同稀釋度的平均菌落數(shù)細(xì)菌的菌體是微小的顆粒，在水中呈懸浮狀態(tài)而不像可溶性化學(xué)藥品在水中均勻分布呈真溶液。由于細(xì)菌在水中分布不均一，故取時(shí)1ml菌懸液中菌數(shù)的隨機(jī)性很大，在加上水樣與培養(yǎng)基的混合不夠充分，有是培養(yǎng)后平板中長出的菌落不單一，

8、成片狀菌苔，故部分成片狀。技術(shù)是，若其中一個(gè)平板有較大片狀菌苔生長時(shí)，棄之，不采用。取另一無片狀菌苔的平板菌落數(shù)作為該稀釋度的平均菌落數(shù)。若片狀菌苔僅占整個(gè)平板的1/2,而其余的菌落分布十分均勻，則可將菌落數(shù)乘以2代表全平板的菌落數(shù)，然后，再按下述原則機(jī)端該稀釋度的平均菌落數(shù)。(2)首先選擇平均菌落數(shù)在30-300之間稀釋度的平板，當(dāng)只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時(shí)，則以該平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，作為該水樣的細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行報(bào)告。如表一中例次1,10-2，稀釋度平板的平均菌落數(shù)為164,而10-2為1365,10-3為20,均不在30-300范圍內(nèi)，故取10-2稀釋度164個(gè)菌落數(shù)為平均菌落

9、數(shù)，以16400或1.6X10-4個(gè)/ml作為該水樣的細(xì)菌總數(shù)。(3)若有兩個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)均在30-300之間，則按兩個(gè)稀釋度菌落總數(shù)的比值來決定取數(shù)。如比值小于2,應(yīng)取兩者的平均值，乘以稀釋倍數(shù)進(jìn)行報(bào)告，如表1中例次2,10-2,稀釋度的平土菌落數(shù)為295,10-3為46,兩者均在30-300的范圍內(nèi)，而菌落數(shù)比值為1.6(10-3為46,換算成10-2為460,10-2為295,則460+295=1.55=1.6),取量稀釋度菌落數(shù)的平均值為37750(29500+46000)+2=37750,以37750或3.8X104個(gè)/ml作為該水樣的細(xì)菌總數(shù)。同法計(jì)算，表1中例次3的菌落數(shù)的

10、值大于2,則取其較小的細(xì)菌總數(shù)271(10-2)進(jìn)行報(bào)告。(4)若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300,則應(yīng)按稀釋度最高的品均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)進(jìn)行，見表1中的例次4。(5)若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30,則按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋配屬進(jìn)行報(bào)告。見表1中的例次5.(6)若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均均不在30-300之間，則以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)進(jìn)行報(bào)告，見下表中例次6。計(jì)算菌落總數(shù)方法舉例表例次/、同稀釋度的平均菌落數(shù)兩個(gè)稀釋度菌落數(shù)之比菌落總數(shù)/(個(gè)/ml)備注10-110-210-31136516420一16400,IP41.6X104兩位以后的數(shù)字采取四舍五入處理；以10的指數(shù)報(bào)告菌落總數(shù)22760295461.637750，即43.8X10432890271602.227100，即2.7X1044無法計(jì)數(shù)1650513一513000,即5.1X