微生物檢測(cè)技術(shù)作業(yè)--生物芯片

1、1.定義定義 生物芯片生物芯片(biochip)是采用光導(dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣等方法，將大量生物大分子生物大分子，如核酸片段、多肽分子、細(xì)胞，甚至組織切片等生物樣品有序地固化于支持物支持物的表面，組成密集的二維分子排列，然后與已標(biāo)記的待測(cè)生物樣品中的靶分子進(jìn)行雜交，通過特定的儀器對(duì)雜交信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行快速、并行、高效地檢測(cè)分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量及質(zhì)量。 由于這種技術(shù)通常采用玻片或硅片作為固相支持物，且在制備過程中模擬計(jì)算機(jī)芯片的制備方法，所以稱之為生物芯片技術(shù)生物芯片技術(shù)。 常用的固相支持物：硅片、玻璃片、塑料片、凝膠、尼龍膜等 檢測(cè)儀器：激光共聚焦掃描儀或電荷偶聯(lián)攝影像機(jī)等2.分類分類

2、 根據(jù)芯片上固定的探針不同探針不同，分為：基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片和組織芯片； 根據(jù)芯片的工作原理工作原理，分為：元件型微陣列芯片、通道型微陣列芯片和生物傳感芯片； 根據(jù)制作過程制作過程，分為：原位合成芯片和合成點(diǎn)樣法制作的芯片。2.分類分類總的來說，生物芯片技術(shù)包括三大領(lǐng)域： 基因芯片基因芯片 蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片 芯片實(shí)驗(yàn)室芯片實(shí)驗(yàn)室3.生物芯片的工作原理生物芯片的工作原理 3.1 基因芯片基因芯片基本原理基本原理：將大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱進(jìn)而判斷樣品中靶分子的數(shù)量和質(zhì)量。圖3-1 基因芯片3.1 基因芯片基因芯片 成千上萬網(wǎng)

3、格狀密集排列的基因探針，通過已知堿基順序的DNA片段來結(jié)合堿基互補(bǔ)序列的單鏈DNA，從而確定相應(yīng)的序列，通過這種方式來識(shí)別異?；蚧蚱洚a(chǎn)物等。 基因芯片使合成和固定高密度的數(shù)以萬計(jì)的探針分子以及對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)、靈敏、準(zhǔn)確地檢測(cè)分析變得切實(shí)可行。3.1 基因芯片基因芯片 基因芯片按照用途可分為三類：測(cè)序芯片測(cè)序芯片、表表達(dá)芯片達(dá)芯片和比較芯片比較芯片（診斷芯片診斷芯片）。 其中，測(cè)序芯片測(cè)序芯片出現(xiàn)的最早，研究的最多，主要用于測(cè)序研究。3.1.1 測(cè)序芯片的基本工作原理：測(cè)序芯片的基本工作原理： 在測(cè)序芯片上，5個(gè)堿基組成的共451024個(gè)所有可能序列均通過末端附著于芯片表面上。待測(cè)序的樣品

4、樣品DNA和一組標(biāo)記的核苷酸五聚體組標(biāo)記的核苷酸五聚體（標(biāo)記探針）以及連接酶連接酶一同在芯片上溫育。芯片測(cè)序流程圖芯片測(cè)序流程圖芯片測(cè)序流程圖芯片測(cè)序流程圖 1024X1024=1048754 最終的序列可通過軟件根據(jù)探針的重疊而讀出來。3.1.2 其他兩種基因芯片其他兩種基因芯片 表達(dá)芯片表達(dá)芯片：這種芯片是通過測(cè)量特定基因的mRNA的量來推斷基因的表達(dá)活性的，所以芯片的堿基序列是特異的。雜交的結(jié)果必須同陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行比較才能最終確定。 比較芯片比較芯片(診斷芯片)：這種類型的芯片主要應(yīng)用于基因組的比較中。采用這種芯片可以檢查基因的失常水平。3.2 蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片 基本原理基本原理：蛋白

5、質(zhì)芯片, 是指以蛋白質(zhì)分子蛋白質(zhì)分子作為配配基基,將其有序地固定在固相載體的表面形成微陣列；用標(biāo)記了熒光的蛋白質(zhì)或其他它分子與之作用，洗去未結(jié)合的成分，經(jīng)熒光掃描等檢測(cè)方式測(cè)定芯片上各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，來分析蛋白之間或蛋白與其它分子之間的相互作用關(guān)系。3.2.1 蛋白質(zhì)芯片的分類蛋白質(zhì)芯片的分類按照制作方法和用途，蛋白質(zhì)芯片可分為兩類：蛋白質(zhì)檢測(cè)芯片蛋白質(zhì)檢測(cè)芯片 蛋白質(zhì)功能芯片蛋白質(zhì)功能芯片3.2.1.1 蛋白質(zhì)檢測(cè)芯片蛋白質(zhì)檢測(cè)芯片 蛋白質(zhì)檢測(cè)芯片，蛋白質(zhì)檢測(cè)芯片，是將具有高度親和特異性的探針分子固定在基片上，用以識(shí)別復(fù)雜生物樣品中的目標(biāo)多肽，當(dāng)放射性同位素或熒光標(biāo)記的靶分子與芯片上的探針分子

6、結(jié)合后，通過檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。3.2.1.2 蛋白質(zhì)功能芯片蛋白質(zhì)功能芯片 蛋白質(zhì)功能芯片蛋白質(zhì)功能芯片是研究蛋白質(zhì)間、蛋白質(zhì)修飾、 DNA- 蛋白質(zhì)間、 RNA- 蛋白質(zhì)間、蛋白質(zhì)與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)與藥物、酶與底物、小分子蛋白質(zhì)等相互作用的芯片。它是將所研究體系中的每種天然蛋白質(zhì)點(diǎn)加在基片上制成芯片 , 用于天然蛋白質(zhì)活性及分子親和性的高通量平行研究。3.2.2 蛋白質(zhì)芯片的工作流程蛋白質(zhì)芯片的工作流程以抗體芯片為例以抗體芯片為例抗體芯片工作流程：抗體芯片工作流程： 從樣品中抽提蛋白質(zhì) 用熒光染料分別標(biāo)記蛋白質(zhì) (direct labeling, paired Ab s

7、andwich assay). 洗滌去掉未結(jié)合的染料 與蛋白芯片反應(yīng) 掃描，分析結(jié)果兩種標(biāo)記方法兩種標(biāo)記方法直接標(biāo)記直接標(biāo)記Direct Labeling 雙抗體夾心法雙抗體夾心法 Dual Antibody Sandwich 直接標(biāo)記直接標(biāo)記Direct Labeling 樣本中所有的蛋白都用熒光或者生物素biotin進(jìn)行標(biāo)記 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 對(duì)于每個(gè)靶蛋白只需要一個(gè)特異性的抗體，可檢測(cè)那些只有一個(gè)抗體的靶蛋白 缺點(diǎn)缺點(diǎn): 檢測(cè)靈敏度的下降和數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性的下降 標(biāo)記位點(diǎn)可能嚴(yán)重改變抗原結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致抗原 抗體結(jié)合位點(diǎn)的破壞 雙抗體夾心法雙抗體夾心法 Dual Antibody Sandwich

8、抗體點(diǎn)在芯片上，捕捉抗原底物后，再加入檢測(cè)抗體 ，后續(xù)加入每個(gè)抗體與點(diǎn)于芯片上的抗體是一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，即對(duì)應(yīng)著同一個(gè)抗原。 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn): 通過兩個(gè)特異性抗體與抗原的結(jié)合，提高了特異性，因而夾心法比直接標(biāo)記法更靈敏 缺點(diǎn)缺點(diǎn): 可能導(dǎo)致交叉反應(yīng)和抗體的沉淀 ELISA 方法檢測(cè)抗體芯片結(jié)果：方法檢測(cè)抗體芯片結(jié)果： The Enzyme-Linked Immunoab Sorbent Assay 是經(jīng)典的用于檢測(cè)樣品中抗原抗體結(jié)合的方法。ELISA技術(shù)在抗原或抗體上結(jié)合了酶反應(yīng)基團(tuán)。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進(jìn)行定性或定量分析。 DNA芯片

9、與蛋白芯片最大的區(qū)別是靶分子和探針芯片與蛋白芯片最大的區(qū)別是靶分子和探針分子的結(jié)構(gòu)差異分子的結(jié)構(gòu)差異 相對(duì)于DNA 芯片, 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)面臨更多困難。 蛋白質(zhì)之間的相互作用的變化性更強(qiáng)。 相對(duì)于PCR 技術(shù)這樣可以大量擴(kuò)增DNA 的技術(shù), 尚未有可以大量擴(kuò)增蛋白質(zhì)的成熟技術(shù)。 蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化工作十分艱巨, 而且經(jīng)常不能保持蛋白質(zhì)的完整功能。 許多蛋白質(zhì)很不穩(wěn)定。3.2.3 捕獲分子捕獲分子捕獲分子對(duì)于開發(fā)特異、敏感的蛋白芯片至關(guān)重要。捕獲分子對(duì)于開發(fā)特異、敏感的蛋白芯片至關(guān)重要。 理想的捕獲分子應(yīng)具有下列特點(diǎn)理想的捕獲分子應(yīng)具有下列特點(diǎn) : 對(duì)靶分子有高度的特異性和親和力 ; 容易進(jìn)行生

10、產(chǎn)和操作 ; 具有可利用的大分子文庫(kù)用來建立高度密集的微陣列 ; 如果困難可以實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大作用。主要的捕獲分子主要的捕獲分子： 抗體 適配體（寡聚核苷酸） 多肽與肽樣寡聚體 小分子配體 重組蛋白3.3 芯片實(shí)驗(yàn)室芯片實(shí)驗(yàn)室(lab-on-a-chip)芯片實(shí)驗(yàn)室芯片實(shí)驗(yàn)室為高度集成化的集樣品制備、基因擴(kuò)增、核酸標(biāo)記及檢測(cè)為一體的便攜式生物分析系統(tǒng)，它最終的目的是實(shí)現(xiàn)生化分析全過程均集成在一片芯片上完成，從而使現(xiàn)有的許多繁瑣、費(fèi)時(shí)、不連續(xù)、不精確和難以重復(fù)的生物分析過程自動(dòng)化、連續(xù)化和微縮化，是未來生物芯片發(fā)展的最終目標(biāo)。 現(xiàn)在已有由加熱器、微泵、微閥、微流量控制器、微電極、電子化學(xué)和電子發(fā)光探

11、測(cè)器等組成的芯片實(shí)驗(yàn)室問世，并出現(xiàn)了將生化反應(yīng)、樣品制備、檢測(cè)和分析等部分集成的生物芯片。 總結(jié)：芯片實(shí)驗(yàn)室特點(diǎn)總結(jié)：芯片實(shí)驗(yàn)室特點(diǎn) 高度集成化的集樣品制備、基因擴(kuò)增、核酸標(biāo)記及檢測(cè)為一體的便攜式生物分析系統(tǒng)。 實(shí)現(xiàn)生化分析全過程集成在一片芯片上完成，從而使生物分析過程自動(dòng)化、連續(xù)化和微縮化。 芯片實(shí)驗(yàn)室是生物芯片技術(shù)發(fā)展的最終目標(biāo)。 芯片實(shí)驗(yàn)室的操作流程芯片實(shí)驗(yàn)室的操作流程 分子層面的單元操作主要包括進(jìn)樣、樣品處理、混進(jìn)樣、樣品處理、混合、反應(yīng)及分離合、反應(yīng)及分離。 進(jìn)樣進(jìn)樣：利用芯片平臺(tái)處理樣品，需要將樣品引入芯片的樣品處理通道或通道網(wǎng)絡(luò)，該步驟通常稱為進(jìn)樣。進(jìn)樣通常又可分為上樣和取樣兩個(gè)

12、步驟。芯片實(shí)驗(yàn)室處理的對(duì)象一般是流體。 混合混合：混合是一個(gè)物理過程，其目的是實(shí)現(xiàn)參與過程的不同組分的均一分布。溶質(zhì)混合有兩種機(jī)理：一種為對(duì)流傳質(zhì)，另一種為擴(kuò)散傳質(zhì)。 反應(yīng)反應(yīng)：利用微反應(yīng)器進(jìn)行，微反應(yīng)器利用微芯片反應(yīng)技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)是可通過并行單元來實(shí)現(xiàn)柔性生產(chǎn)、規(guī)模放大、快速和高通量篩選等。 分離分離：電泳是芯片微分離中采用最為普遍的一種形式，芯片電泳的分離模式多種多樣，如區(qū)帶電泳、膠束電動(dòng)芯片電泳、介電電泳及電色譜等。以電泳分離為主體的分離技術(shù)，在整個(gè)芯片平臺(tái)技術(shù)的研究中占有特殊的地位。4.生物芯片的應(yīng)用生物芯片的應(yīng)用 4.1 基因芯片的應(yīng)用 4.1.1.感染性疾病的診斷 在生物芯片發(fā)展之前

13、：形態(tài)學(xué)形態(tài)學(xué)的觀察及血清學(xué)血清學(xué)的生化分析相互配合； 缺點(diǎn)缺點(diǎn)：耗時(shí)、花費(fèi)許多人力和成本 基因芯片基因芯片：同時(shí)觀察許多基因的表達(dá)，獲得的基因表達(dá)樣式與數(shù)據(jù)庫(kù)中的樣式做比對(duì)，就可以準(zhǔn)確地分析出造成感染性疾病的微生物種類。 例：發(fā)燒芯片例：發(fā)燒芯片 發(fā)燒芯片發(fā)燒芯片是一塊包含400個(gè)寡核苷酸的芯片，以一群特殊設(shè)計(jì)的寡核苷酸片段為探針，29種常見的病原菌可以在發(fā)燒芯片上顯出各自特有的基因表達(dá)式樣，再與數(shù)據(jù)庫(kù)建立的式樣比對(duì)后，就可達(dá)到快速鑒定感染性病原菌的目的。4.1.2. 16S rDNA和和23S rDNA作為探針來源作為探針來源 核糖體是細(xì)菌惟一的細(xì)胞器，是蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所 編碼rRNA的基

14、因是按16S-23S-5S的順序排列的，并由兩個(gè)非編碼區(qū)分開 16S rDNA和23S rDNA的保守區(qū)對(duì)真細(xì)菌界的所有細(xì)菌均具有同源性，所以要滿足能夠檢測(cè)出所有病原菌的需要，可以在此區(qū)選擇合適的探針和引物。 16S rDNA在科、屬、種間的變異程度不同，可以根據(jù)需要設(shè)計(jì)細(xì)菌不同階元的特異性引物和探針。例例1： 4小時(shí)以內(nèi)便可檢測(cè)和識(shí)別病原微生物的方法小時(shí)以內(nèi)便可檢測(cè)和識(shí)別病原微生物的方法 該方法的具體過程是： 使用隨機(jī)引物通過PCR法擴(kuò)增法擴(kuò)增細(xì)菌的核糖核糖23S rDNA 將擴(kuò)增產(chǎn)物與含有特定寡核苷酸探針的芯片進(jìn)行雜雜交交，然后通過檢測(cè)系統(tǒng)來檢測(cè)檢測(cè)。 利用該法對(duì)158例經(jīng)血培養(yǎng)鑒定為陽(yáng)性

15、的樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果125份樣品(79.7)呈陽(yáng)性，在所有未檢出樣品中，9例為芯片上無對(duì)應(yīng)探針，16例為PCR擴(kuò)增無擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)，另外8例中，有7例雖然經(jīng)常規(guī)方法鑒定為金黃色葡萄球菌，但隨后它們不能進(jìn)一步被證實(shí)，只有一例經(jīng)分離得到金黃色葡萄球菌，被錯(cuò)誤地鑒定為凝固酶陰性葡萄球菌。 例例2：在未知標(biāo)本中快速檢測(cè)：在未知標(biāo)本中快速檢測(cè)6種立克次體的方法種立克次體的方法 該方法針對(duì)每種立克次氏體16S rDNA的可變區(qū)，分別設(shè)計(jì)和合成4條寡核苷酸探針，利用微陣列技術(shù)構(gòu)建立克次氏體檢測(cè)用生物芯片。 待測(cè)立克次氏體染色體DNA用16S rDNA通用引物擴(kuò)增摻入熒光素，然后與芯片雜交，利用各種立克次氏體的

16、6條特異性探針是否全部出現(xiàn)雜交信號(hào)來做出判斷。 結(jié)果表明以寡核苷酸為探針的生物芯片系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)6種立克次氏體的檢測(cè)。4.2 蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用蛋白質(zhì)芯片的應(yīng)用例：利用蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)例：利用蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)SARS病毒病毒 在直徑約1左右、鑲嵌在一個(gè)個(gè)小方格中的半明半暗小圓球組可以測(cè)出SARS病毒抗體，它就是檢測(cè)抗SARS病毒抗體的蛋白質(zhì)芯片。該蛋白質(zhì)芯片的檢測(cè)系統(tǒng)，包含N蛋白、E蛋白、S蛋白等SARS病毒抗原以及相應(yīng)的配套對(duì)照蛋白。 用該蛋白質(zhì)芯片對(duì)150例正常人和52例SARS病人的血清進(jìn)行了檢測(cè)，在95的SARS病人血清樣品內(nèi)發(fā)現(xiàn)了針對(duì)病毒的抗體，而血清中發(fā)現(xiàn)了抗體說明被測(cè)人已經(jīng)感染了SARS

17、病毒。150例正常人未發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象。 在對(duì)SARS病毒全基因序列分析的基礎(chǔ)上，克隆了10個(gè)基因，并對(duì)其中的5個(gè)基因進(jìn)行了蛋白質(zhì)表達(dá)，通過篩選發(fā)現(xiàn)，其中3個(gè)蛋白質(zhì)能與SARS病人血清發(fā)生特異性抗原抗體反應(yīng)。 通過已建立的蛋白質(zhì)芯片制備技術(shù)平臺(tái)，用篩選的抗原，研制出了SARS病毒多抗體檢測(cè)蛋白質(zhì)芯片。 SARS病毒多抗體檢測(cè)蛋白質(zhì)芯片，可同時(shí)對(duì)SARS病毒5種抗原的抗體進(jìn)行檢測(cè)，并可同時(shí)檢測(cè)IgG和IgM兩類抗體，每種抗體可同時(shí)重復(fù)檢測(cè)4次。 以上設(shè)計(jì)不僅使診斷結(jié)果更加準(zhǔn)確，而且使該芯片具有取樣微量、穩(wěn)定性好、靈敏度高、平行檢測(cè)、結(jié)果可量化顯示等特點(diǎn)。 SARS病毒抗體檢測(cè)蛋白質(zhì)芯片，除了可用于對(duì)臨床SARS病人的篩選和確診，還可用于研究SARS病毒編碼蛋白質(zhì)的抗原性、抗體產(chǎn)生特點(diǎn)及規(guī)律、疾病轉(zhuǎn)歸的分子機(jī)理研究、疫苗的評(píng)價(jià)以及分子流行病學(xué)的調(diào)查。 除了蛋白質(zhì)芯片外，還有內(nèi)置多種“非典”冠狀病毒基因序列的基因芯片。新的微探針涉及“非典”冠狀病毒的29700個(gè)DNA堿基對(duì)序列。5.生物芯片技術(shù)的研究方向及當(dāng)前面臨的困難生物芯片技術(shù)的研究方向及當(dāng)前面臨的困難 盡管基因芯片技術(shù)已經(jīng)取得了長(zhǎng)足的發(fā)展，但仍然存在著許多難以解決的問題，例如技