基因工程的工具酶

1、基因工程的工具酶n 限制性核酸內(nèi)切酶n DNA連接酶n DNA聚合酶n 堿性磷酸酶n 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶限制性核酸內(nèi)切酶是一類能識別雙鏈DNA分子特異性核酸序列的DNA水解酶。是體外剪切基因片段的重要工具限制性核酸內(nèi)切酶不僅是DNA重組中重要的工具，而且還可以用于基因組酶切圖譜的鑒定防御機制: n 任何物種都有排除異物、保護自身的防御機制 n 人：免疫系統(tǒng) n 細菌：限制與修飾系統(tǒng) 寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象限制與修飾系統(tǒng)是細胞的一種防衛(wèi)手段, 各種細菌都能合成一種或幾種能夠切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶，它們以此來限制外源DNA存在于自身細胞內(nèi)，但合成這種酶的細胞自身的DNA不受影響，因為這種細

2、胞還合成了一種修飾酶，對自身的DNA進行了修飾，限制性酶對修飾過的DNA不能起作用。這種現(xiàn)象被稱為寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象。限制酶 (restriction enzyme)修飾酶 (modifying enzyme)核酸酶切位點：既可以在3,5-磷酸二酯鍵的3酯鍵處（A），也可以在5酯鍵處（B）切斷磷酸二酯鍵1） 核酸限制性內(nèi)切酶的類型2） 核酸限制性內(nèi)切酶的基本特性3） 同裂酶和同尾酶4） 核酸限制性內(nèi)切酶的命名法5） 影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素限制性核酸內(nèi)切酶的類型及特性按照限制酶的組成、與修飾酶活性的關(guān)系以及切斷核酸的情況不同，分為三類： 型 型* 型第一類（I型）限制性內(nèi)切酶： 能

3、識別專一的核苷酸順序 并在識別點附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的雙鏈 但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機的 這類限制性內(nèi)切酶在DNA重組技術(shù)或基因工程中用處不大，無法用于分析DNA結(jié)構(gòu)或克隆基因 如：EcoB、EcoK等第二類(II型)限制性內(nèi)切酶： 能識別專一的核苷酸順序（回文對稱順序） 并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈 是DNA重組技術(shù)中最常用的工具酶之一 這種酶識別的專一核苷酸順序最常見的是4個或6個核苷酸，少數(shù)也有識別5個核苷酸以及7個、8個、9個、10個和11個核苷酸的回文對稱順序：有一個中心對稱軸，從這個軸朝二個方向“讀”都完全相同n 切割后形成具有粘性末端（cohesiv

4、e end）的DNA片段n 切割后形成具有平末端（blunt end）的DNA片段限制酶在識別序列的對稱軸上切割，形成的DNA片段沒有突出的單鏈第三類（ III型）限制性內(nèi)切酶也有專一的識別順序，但不是對稱的回文順序,在識別順序旁邊幾個核苷酸對的固定位置上切割雙鏈。但這幾個核苷酸對不是特異性的。這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長度DNA片段，具有各種單鏈末端，因此不能應(yīng)用于基因克隆同裂酶和同尾酶n 同裂酶（同切酶或異源同工酶） ： 兩種限制性內(nèi)切酶的識別核苷酸順序和切割位置都相同，有時其差別只在于當(dāng)識別順序中有甲基化的核苷酸時，一種限制性內(nèi)切酶可以切割，另一種則不能。 例如： Hpa和Msp的

5、識別順序都是CCGG 如果其中有5-甲基胞嘧啶，則只有Hpa能夠切割n 同尾酶： 有時兩種酶切割序列不完全相同，但卻能產(chǎn)生相同的粘性末端，這類酶被稱為同尾酶 可以通過DNA連接酶將這類末端連接起來，但原來的酶切位點將被破壞，有時可能會產(chǎn)生一個新的酶切位點 如：Xba1、Nhe1以及Spe1切割的DNA序列不同，但均給出相同的“CTAG”粘性末端。這些粘性末端連接后，以上的酶將不能再切割，但卻產(chǎn)生了一個新的4核苷酸的酶切位點，即 Bfa1的酶切位點限制性核酸內(nèi)切酶的命名法n 取微生物屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成三個斜體字母加以表示，遇有株名，再加在后面。如果同一菌株先后發(fā)現(xiàn)幾個不同的酶

6、，則用羅馬數(shù)字加以表示n EcoR I E: 表示大腸桿菌屬名第一個字母 co: 表示種名頭兩個字母 R: 表示菌株名 I: 表示該菌中第一個被分離出來的酶影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素n 反應(yīng)的溫度n DNA的純度n 溶液中離子濃度及種類n 緩沖液的pH值n 酶切時間n DNA的分子結(jié)構(gòu)限制性內(nèi)切酶在保溫過程中的活性變化（圖解）反應(yīng)體系n 10 X Buffern DNAn 酶n H2O注意酶的濃度：并不是加得越多越好！根據(jù)DNA的量選取合適的酶量1個酶單位：以20L反應(yīng)體系中反應(yīng)1小時，使1 g DNA完全消化所需要的酶量DNA末端長度對限制酶切割的影響n 限制酶切割DNA時對識別序列兩端

7、的非識別序列有長度的要求，也就是說，在識別序列兩端必須有一定數(shù)量的核苷酸，否則很難發(fā)揮切割活性n 限制性內(nèi)切酶的Star activity 是指當(dāng)酶的反應(yīng)條件改變時，其在識別序列以外的位點進行切割修飾酶-甲基化酶又稱甲基轉(zhuǎn)移酶（methyltransferase)在真核和原核生物中存在大量的甲基化酶實驗室里大部分大腸桿菌菌株含有3個位點特異的甲基化酶:n Dam甲基化酶,由dam基因編碼,將S-腺苷甲硫氨酸的甲基基團轉(zhuǎn)移到GATC中A的N6位置上n Dcm甲基化酶,由dcm基因編碼,以前稱Mec甲基化酶,在C5位置修飾CCAGG和CCTGG的胞嘧啶(C)殘基, 位點256-512bp出現(xiàn)一次n

8、 EcoK I甲基化酶,識別AAC（N）6GTGC和GCAC（N）6GTT序列中的A的N6位置，位點少,約8 kb出現(xiàn)一次n Sss I甲基化酶 從某種Dam + 或Dcm +的菌株中分離的DNA可能抗從自身分離的限制性內(nèi)切酶的切割 例如: Mbo I 和Sau 3A I識別序列GATC 從Dam+大腸桿菌中分離到的DNA完全不受 Mbo I 的切割, 但是不抗Sau 3A I來自原核生物螺原體（Spiroplasma sp.），可使CG序列中的C在C5位置上甲基化 Sss I甲基化的DNA受E.coli中mcrA, mcrBC和mrr系統(tǒng)的限制許多酶對此甲基化酶敏感，如：Aat II, Cl

9、a I, Xho I, Sal I如果將外源DNA引入一個大腸桿菌的宿主,它可能會受宿主細胞中的限制系統(tǒng)的襲擊因此, 消除大腸桿菌重組分子宿主菌株中的限制系統(tǒng)具有重要意義（大腸桿菌的所有限制系統(tǒng)都集中在一個長約14 kb的遷移控制區(qū)內(nèi)）某些菌株在這些基因中的某個上攜帶突變 如: DH5菌株在hsdS基因內(nèi)有突變, 因此是EcoK I內(nèi)切酶缺陷型的 普遍應(yīng)用的菌株HB101是整個遷移控制區(qū)都缺失,因此缺乏所有的限制活性DNA連接酶：在體外將目的基因和載體共價連接構(gòu)成重組DNA分子T4 DNA連接酶大腸桿菌DNA連接酶反應(yīng)體系n 5 X Buffer (10 X Buffer )n Vectorn

10、 DNA Fragmentn T4 DNA Ligasen H2O連接反應(yīng)的溫度n 平末端 16 4-16 hourn 粘性末端 16 3 hour or 4 16 hourDNA聚合酶不同種類的DNA聚合酶在DNA的復(fù)制和修復(fù)中起到重要的作用n 大腸桿菌DNA聚合酶In Klenow 大片段n 耐熱 DNA聚合酶大腸桿菌DNA聚合酶I的酶活性： 1） 53 DNA聚合酶活性 2） 53 DNA外切酶活性（ 5端降解） 3） 3 5 DNA外切酶活性（糾錯）Klenow 大片段： 大腸桿菌DNA聚合酶I 經(jīng)蛋白酶處理后產(chǎn)生的大片段活性： 1）53 DNA聚合酶活性 2）3 5 DNA外切酶活性（糾錯）耐熱 DNA聚合酶 來自于嗜高溫的細菌， 主要用于PCR反應(yīng) 如：TaqDNA聚合酶 Vent DNA聚合酶 Pfu DNA聚合酶 Pwo DNA聚合酶 Tth DNA聚合酶堿性磷酸酶n 去除5磷酸基團n 底物: DNA、RNA、脫氧核糖核苷三磷酸n 應(yīng)用： a. 5端標(biāo)記之前的處理b. 處理克隆載體防止載體自連 c. 外源DNA片段的末端處理防止片段間的連接目前常用的有兩種：細菌堿性磷酸酶（BAP），耐高溫，不易失活，要終止和滅活它很困難小牛腸道堿性磷酸酶（CIP），可在65加熱45min滅活，活性高，因此更為常用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）n 從小牛胸腺中分離純化出來的特點