第六章離心技術(shù)

1、第六章 離心技術(shù)Chapter 6 Centrifugation第一節(jié) 原理與應(yīng)用Section 1 Principles and applications一、離心技術(shù)的誕生、發(fā)展以及應(yīng)用 離心技術(shù)（centrifuge technique）: 利用物質(zhì)在離心力的作用下，按其沉降系數(shù)的不同而進(jìn)行分離的一種技術(shù)。 誕生： 1872年，Misher使用離心機(jī)分離蜂蜜和牛奶； 發(fā)展： 1、1924年，瑞典的化學(xué)家Svedberg和Rinde制造了世界上第一臺(tái)具有光學(xué)系統(tǒng)的超速離心機(jī)45000rpm； 2、1926年，Svedberg用其制造的離心機(jī)測(cè)定馬血紅蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為68000； 3、19

2、40年， Svedberg和Pederson撰寫了世界上第一本有關(guān)離心技術(shù)的專著； 4、1955年，Anderson發(fā)明了區(qū)帶轉(zhuǎn)頭并證明了DNA的半保留復(fù)制的假說(shuō)； 5、20世紀(jì)90年代，出現(xiàn)碳素轉(zhuǎn)頭；一、基本原理及用途 、繞中心軸作圓周運(yùn)動(dòng)時(shí)，受到離心力的作用； 、強(qiáng)大的離心力作用于懸浮的粒子，使其沿離心力背離中心軸； 、不同大小的顆粒沉降速度不同而有效的分離；1、顆粒在離心場(chǎng)中的沉降 、相對(duì)離心力（RCF） 當(dāng)一個(gè)粒子（生物大分子或細(xì)胞器）在高速旋轉(zhuǎn)下受到離心力作用時(shí)，此離心力“F”由下式定義，即： F = ma = m2 ra 離心場(chǎng)加速度， m 沉降粒子的有效質(zhì)量，粒子旋轉(zhuǎn)的角速度，

3、r 粒子的旋轉(zhuǎn)半徑( cm )； 通常離心力常用地球引力的倍數(shù)來(lái)表示，因而稱為相對(duì)離心力 “ RCF （Relative Centrifugal Force）”。或者用數(shù)字乘“g”來(lái)表示，例如25000g，則表示相對(duì)離心力為25000。相對(duì)離心力是指在離心場(chǎng)中，作用于顆粒的離心力相當(dāng)于地球重力的倍數(shù)； 單位是重力加速度“g”（980cm/sec2）。 此時(shí)“RCF”相對(duì)離心力可用下式計(jì)算： RCF = 1.119105(rpm)2 r (n: rpm revolutions per minute每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)，r/min )RCF=F離心力F重力=m2rmg=(2n/60)2980r 由上式可見，

4、只要給出旋轉(zhuǎn)半徑r，則RCF和rpm之間可以相互換算。但是由于轉(zhuǎn)頭的形狀及結(jié)構(gòu)的差異，使每臺(tái)離心機(jī)的離心管，從管口至管底的各點(diǎn)與旋轉(zhuǎn)軸之間的距離是不一樣的，所以在計(jì)算是規(guī)定旋轉(zhuǎn)半徑均用平均半徑“rav”代替： rav=( r minrmax) / 2r的測(cè)量如下圖所示： 340rmin rmaxrav 科技文獻(xiàn)中離心力的數(shù)據(jù)通常是指其平均值（RCF av），即離心管中點(diǎn)的離心力。 為便于進(jìn)行轉(zhuǎn)速和相對(duì)離心力之間的換算，Dole 和Cotzias 利用RCF的計(jì)算公式，制作了轉(zhuǎn)速“rpm”、相對(duì)離心力“RCF”和旋轉(zhuǎn)半徑“r”三者關(guān)系的列線圖，圖式法比公式計(jì)算法方便。 換算時(shí)，先在r標(biāo)尺上取已知

5、的半徑和在rpm標(biāo)尺上取已知的離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)，然后將這兩點(diǎn)間劃一條直線，與圖中RCF標(biāo)尺上的交叉點(diǎn)即為相應(yīng)的相對(duì)離心力數(shù)值。注意，若已知的轉(zhuǎn)數(shù)值處于rpm標(biāo)尺的右邊，則應(yīng)讀取RCF標(biāo)尺右邊的數(shù)值，轉(zhuǎn)數(shù)值處于rpm標(biāo)尺左邊，則應(yīng)讀取RCF標(biāo)尺左邊的數(shù)值。 左對(duì)左右對(duì)右、沉降系數(shù)（sedimentation coefficient，s ） 1924年Svedberg對(duì)沉降系數(shù)下的定義：顆粒在單位離心力場(chǎng)中粒子移動(dòng)的速度。 若用2n/60表示，則：S=2.303Log(r2/r1)2 (t2-t1)積分得：S=dr/dt2 r=12dtdrr 式中r1為離心前粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離；r2為離心后粒子離旋轉(zhuǎn)軸

6、的距離，n離心機(jī)轉(zhuǎn)速。S實(shí)際上時(shí)常在10-13秒左右，故把沉降系數(shù)10-13秒稱為一個(gè)Svedberg單位，簡(jiǎn)寫S，量綱為秒。 S=2.1102Log(r2/r1)n2 (t2-t1) 如蛋白質(zhì)，沉降速度與向心加速度之比值即為蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)S。校正溶劑為水，溫度20時(shí)的沉降系數(shù)S20w可按下式計(jì)算： 式中r為沉降界面至轉(zhuǎn)軸中心的距離，為轉(zhuǎn)子角速度， 2 r為向心加速度，dr/dt為沉降速度。分子愈大，沉降系數(shù)愈高，故可根據(jù)沉降系數(shù)來(lái)分離和檢定蛋白質(zhì)。 S20W=dr/dt2 r 、沉降系數(shù)為生物大分子物質(zhì)的特征常數(shù)，它與顆粒的密度、大小、形狀、介質(zhì)的密度和黏度有關(guān)； 、規(guī)定溫度為20，以水為

7、介質(zhì)的條件下，測(cè)得的S值為標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)的沉降系數(shù)，非標(biāo)態(tài)的沉降系數(shù)則應(yīng)加以校正；蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)一般為1-200S之間； 、分析型超速離心機(jī)測(cè)定沉降系數(shù)，再通過S和Mr之間的轉(zhuǎn)換求出分之質(zhì)量；Mr=RTS20,wD20,W(1-V)R-氣體常數(shù)，等于1.987卡/度.摩爾；S20，W-標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下粒子的沉降系數(shù)；D20，W-理想狀態(tài)時(shí)粒子的擴(kuò)散系數(shù)；V-微分比容，等于溶質(zhì)粒子密度的倒數(shù)；-溶劑密度； T-熱力學(xué)溫度；、沉降速度（sedimentation velocity） 沉降速度是指在強(qiáng)大離心力作用下，單位時(shí)間內(nèi)物質(zhì)運(yùn)動(dòng)的距離。 式中r為球形粒子半徑；為流體介質(zhì)的粘度；P為粒子的密度；m為介質(zhì)的

8、密度。 dxdt=2r2(p-m)2x9 從上式可知，粒子的沉降速度與粒子半徑的平方、粒子的密度和介質(zhì)密度之差成正比；離心力場(chǎng)增大，粒子的沉降速度也增加，將此式代入上項(xiàng)沉降系數(shù)公式中，則S的表示式也可表示為： S=dx/dt2 r=d218(p-m) 從該式中可看出：當(dāng)Pm，則S0，粒子順著離心方向沉降。當(dāng)Pm，則S0，粒子到達(dá)某一位置后達(dá)到 平衡。當(dāng)Pm，則S0，粒子逆著離心方向上浮。 、沉降時(shí)間（sedimentation time，Ts） 如果轉(zhuǎn)速已知，則需解決沉降時(shí)間來(lái)確定分離某粒子所需的時(shí)間。 根據(jù)沉降系數(shù)（S）式可得：t2-t1=ln(X2/X1)S2 式中X2為離心轉(zhuǎn)軸中心至離心

9、管底內(nèi)壁的距離；X1為離心轉(zhuǎn)軸至樣品溶液彎月面之間的距離。、K系數(shù)（k factor） K系數(shù)是用來(lái)描述在一個(gè)轉(zhuǎn)子中，將粒子沉降下來(lái)的效率。也就是溶液恢復(fù)成澄清程度的一個(gè)指數(shù)，所以也叫“cleaning factor”。原則上，K系數(shù)愈小的，愈容易，也愈快將粒子沉降。 K=2.531011 ln (rmax/rmin)(rpm)2 其中Rmax為轉(zhuǎn)子最大半徑；Rmin為轉(zhuǎn)子最小半徑。 由其公式可知，K系數(shù)與離心轉(zhuǎn)速及粒子沉降的路徑有關(guān)。所以K系數(shù)是一個(gè)變數(shù)。 通常，離心機(jī)的轉(zhuǎn)子說(shuō)明書中提供的K系數(shù)，都是根據(jù)最大路徑及在最大轉(zhuǎn)速下所計(jì)算出來(lái)的數(shù)值。 如果已知粒子的沉降系數(shù)為80S的Polysom

10、e，采用的轉(zhuǎn)子的K系數(shù)是323，那么預(yù)計(jì)沉降到管底所需的離心時(shí)間是Tk/S4h，利用此公式預(yù)估的離心時(shí)間，對(duì)水平式轉(zhuǎn)子最適合；對(duì)固定角式轉(zhuǎn)子而言，實(shí)際時(shí)間將比預(yù)估的時(shí)間來(lái)得快些。2、應(yīng)用： 、這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用很廣，諸如分離出化學(xué)反應(yīng)后的沉淀物，天然的生物大分子、無(wú)機(jī)物、有機(jī)物； 、測(cè)定生物大分子的分子量； 、大分子純度的評(píng)價(jià)； 、檢測(cè)大分子構(gòu)象的變化；第二節(jié) 離心機(jī)的結(jié)構(gòu)及主要的部件、性能Section 2 Configuration, Primary Parts and Performance一、離心機(jī)的結(jié)構(gòu) 1、驅(qū)動(dòng)系統(tǒng) A、油輪驅(qū)動(dòng)系統(tǒng) 高壓槍噴油作動(dòng)力，高達(dá)75000rpm； B、空氣渦輪

11、驅(qū)動(dòng)系統(tǒng) C、磁懸浮驅(qū)動(dòng)系統(tǒng) D、電動(dòng)驅(qū)動(dòng)系統(tǒng) 2、制冷系統(tǒng)3、真空系統(tǒng)4、光學(xué)系統(tǒng)5、控制系統(tǒng)6、潤(rùn)滑系統(tǒng)7、防護(hù)系統(tǒng) A、轉(zhuǎn)動(dòng)器減震裝置，自動(dòng)平衡，甲鋼外套； B、自動(dòng)限速、自動(dòng)限溫、自動(dòng)鎖定，運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)不易打開；二、轉(zhuǎn)頭及其類型1、角式轉(zhuǎn)頭（fixed angle rotor） 離心管腔與轉(zhuǎn)軸成一定傾角的轉(zhuǎn)頭?？籽ǖ闹行妮S與旋轉(zhuǎn)軸之間的角度在2040度之間，角度越大沉降越結(jié)實(shí)，分離效果越好。 特點(diǎn)：具有較大的容量，且重心低，運(yùn)轉(zhuǎn)平衡，壽命較長(zhǎng)，顆粒在沉降時(shí)先沿離心力方向撞向離心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一側(cè)就會(huì)出現(xiàn)顆粒沉積，此現(xiàn)象稱為“壁效應(yīng)”，壁效應(yīng)容易使沉降顆粒受突然變速所產(chǎn)生的

12、對(duì)流擾亂，影響分離效果。 2、蕩平式轉(zhuǎn)頭 （swinging bucket rotor） 由吊著的4或6個(gè)自由活動(dòng)的吊桶（離心套管）構(gòu)成，最適合做密度梯度區(qū)帶離心 ； 優(yōu)點(diǎn)：是梯度物質(zhì)可放在保持垂直的離心管中，離心時(shí)被分離的樣品帶垂直于離心管縱軸，因而利于離心結(jié)束后由管內(nèi)分層取出已分離的各樣品帶。 缺點(diǎn)：是顆粒沉降距離長(zhǎng)，離心所需時(shí)間也長(zhǎng)。 3、 區(qū)帶轉(zhuǎn)頭 （zonal rotor） 區(qū)帶轉(zhuǎn)頭無(wú)離心管，主要由一個(gè)轉(zhuǎn)子桶和可旋開的頂蓋組成，轉(zhuǎn)子桶中裝有十字型隔板裝置，把桶內(nèi)分隔成四個(gè)或多個(gè)扇形小室，隔板內(nèi)有導(dǎo)管，梯度液或樣品液從轉(zhuǎn)頭中央的進(jìn)液管泵入，通過這些導(dǎo)管分布到轉(zhuǎn)子四周，轉(zhuǎn)頭內(nèi)的隔板可保持

13、樣品帶和梯度介質(zhì)的穩(wěn)定。 優(yōu)點(diǎn)： 因此區(qū)帶轉(zhuǎn)頭的“壁效應(yīng)”極小，可以避免區(qū)帶和沉降顆粒的紊亂，分離效果好，而且還有轉(zhuǎn)速高，容量大，回收梯度容易和不影響分辨率；缺點(diǎn)： 樣品和介質(zhì)直接接觸轉(zhuǎn)頭，耐腐蝕要求高，操作復(fù)雜。4、垂直轉(zhuǎn)頭（vertical tube rotor） 樣品顆粒的沉降距離最短，離心所需時(shí)間也短，適合用于密度梯度區(qū)帶離心，離心結(jié)束后液面和樣品區(qū)帶要作九十度轉(zhuǎn)向，因而降速要慢。 5、連續(xù)流動(dòng)轉(zhuǎn)頭 （continuous flow rotor） 用于大量培養(yǎng)液或提取液的濃縮與分離，轉(zhuǎn)頭與區(qū)帶轉(zhuǎn)頭類似，由轉(zhuǎn)子桶和有入口和出口的轉(zhuǎn)頭蓋及附屬裝置組成，離心時(shí)樣品液由入口連續(xù)流入轉(zhuǎn)頭，在離心

14、力作用下，懸浮顆粒沉降于轉(zhuǎn)子桶壁，上清液由出口流出。 三、離心機(jī)轉(zhuǎn)頭的性能及主要參數(shù) （一）轉(zhuǎn)頭的性能 材料：一方面堅(jiān)固耐用，另一方面質(zhì)量輕容易提速； 1、鋁合金轉(zhuǎn)頭 特點(diǎn)： A、鋁為兩性金屬，適用于近中性溶液離心，洗滌也考慮酸堿度； B、強(qiáng)度不高，但易加工； C、高濃度鹽影響轉(zhuǎn)頭強(qiáng)度； D、高溫使強(qiáng)度降低，不能滅菌； E、價(jià)格便宜，使用壽命短；2、不銹鋼轉(zhuǎn)頭 特點(diǎn)： A、耐腐蝕； B、強(qiáng)度高，加工難； C、質(zhì)量大，離心速度不高； D、壽命長(zhǎng)，價(jià)格便宜；3、鈦合金轉(zhuǎn)頭 特點(diǎn)： A、耐腐蝕； B、強(qiáng)度高，加工難； C、質(zhì)量不很大，離心速度高； D、壽命長(zhǎng)，價(jià)格較貴；4、碳素轉(zhuǎn)頭 特點(diǎn)： A、質(zhì)量

15、輕，利于提速； B、耐腐蝕； C、機(jī)械強(qiáng)度高，加工容易； D、使用壽命長(zhǎng)，價(jià)格昂貴；（二）轉(zhuǎn)頭的主要參數(shù) 1、最大轉(zhuǎn)速 過速保護(hù)裝置 2、最大離心力 3、最大容量 容量越大，轉(zhuǎn)頭越大，轉(zhuǎn)速越低；四、離心管的性能及選擇 （一）玻璃離心管絕對(duì)不能在高、超速離心機(jī)上使用。 （二）塑料 1、PE（聚乙烯）管：化學(xué)性能穩(wěn)定，半透明，能耐高溫消毒。 2、PP（聚丙烯）管：化學(xué)性能穩(wěn)定，半透明，能耐高溫消毒。 3、PC（聚碳酸酯）管：透明度好，硬度大，能耐高溫消毒。但不耐強(qiáng)酸強(qiáng)堿及某些有機(jī)溶劑。用于5萬(wàn)(轉(zhuǎn)/分)以上離心。 4、CN（硝酸纖維素）管：質(zhì)地較軟，透明，但不耐強(qiáng)酸強(qiáng)堿及某些有機(jī)溶劑，不能高壓消毒

16、。適合于蔗糖、甘油等密度梯度離心。應(yīng)透明，利于收集。 （三）不銹鋼 避免接觸強(qiáng)腐蝕化學(xué)試劑；注意事項(xiàng)： 1、對(duì)稱平衡 ； 2、防離心管內(nèi)液體外溢。 失去平衡 污染轉(zhuǎn)頭和離心腔 影響感應(yīng)器正常工作 3、超速離心一定要加滿離心管，需抽真空，避免離心管變形。 4、杜絕使用變形老化離心管；臺(tái)式高、超速離心機(jī)0.6-10萬(wàn)轉(zhuǎn)/分以上離心機(jī)制備性分析性分析性超速離心機(jī)普通離心機(jī)冰凍離心機(jī)臺(tái)式（或地面式）普通離心機(jī)0.3-0.6萬(wàn)大容量冰凍離心機(jī)小于0.6萬(wàn)轉(zhuǎn)/分高速冰凍離心機(jī)0.6-2.5萬(wàn)超速冰凍離心機(jī)2.5-8萬(wàn)或更高五、離心機(jī)的種類及特點(diǎn)（一）按離心速度分類 1、低速離心機(jī) 低于6000rpm； 2

17、、高速離心機(jī) 低于25000rpm； 3、超速離心機(jī) 低于100000rpm；（二）按離心機(jī)的用途分 1、普通離心機(jī) 簡(jiǎn)單、低轉(zhuǎn)速 2、制備型大容量低速離心機(jī) 3、高速冷凍離心機(jī) 4、超速離心機(jī) 5、分析型超速離心機(jī) 研究大分子的沉降特征和結(jié)構(gòu)； 6、連續(xù)流動(dòng)離心機(jī)第三節(jié) 常用的離心技術(shù)Section 3 Usual Centrifugation一、差速離心法 （differential velocity centrifugation ） 利用不同的粒子在離心力場(chǎng)中沉降的差別，在同一離心條件下，沉降速度不同，通過不斷增加相對(duì)離心力，使一個(gè)非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子分步沉淀。 操作過程

18、中一般是在離心后用傾倒的辦法把上清液與沉淀分開，然后將上清液加高轉(zhuǎn)速離心，分離出第二部分沉淀，如此往復(fù)加高轉(zhuǎn)速，逐級(jí)分離出所需要的物質(zhì)。 差速離心的分辨率不高，沉淀系數(shù)在同一個(gè)數(shù)量級(jí)內(nèi)的各種粒子不容易分開，常用于其他分離手段之前的粗制品提取。 例如用差速離心法分離已破碎的細(xì)胞各組份二、區(qū)帶離心法 （ zonal centrifugation ） 將樣品加在惰性梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心沉降或沉降平衡，在一定的離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的分離方法。 優(yōu)點(diǎn)： 分離效果好，可一次獲得較純顆粒； 適應(yīng)范圍廣，能象差速離心法一樣分離具有沉降系數(shù)差的顆粒，又能分離有一定浮力密度差的顆粒

19、； 顆粒不會(huì)擠壓變形，能保持顆粒活性，并防止已形成的區(qū)帶由于對(duì)流而引起混合。 缺點(diǎn)： 離心時(shí)間較長(zhǎng)； 需要制備惰性梯度介質(zhì)溶液； 操作嚴(yán)格，不易掌握。（1）差速區(qū)帶離心法 不同顆粒間存在沉降速度差異（不需要像差速沉降離心法所要求的那樣大的沉降系數(shù)差）。在一定的離心力作用下，顆粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介質(zhì)的不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法稱為差速區(qū)帶離心法。 原理原理 差速區(qū)帶離心法差速區(qū)帶離心法是離心前在離心管內(nèi)先裝入密度梯度介質(zhì)是離心前在離心管內(nèi)先裝入密度梯度介質(zhì)( (如如蔗糖、甘油、蔗糖、甘油、KBrKBr、CsClCsCl等等) )，待分離的樣品鋪在梯度液的，待分離的樣品鋪在梯度液的頂

20、部頂部、離心管離心管底部底部或梯度層或梯度層中間中間，同梯度液一起離心。離心后在近旋轉(zhuǎn)，同梯度液一起離心。離心后在近旋轉(zhuǎn)軸處的介質(zhì)密度最小，離旋轉(zhuǎn)軸最遠(yuǎn)處介質(zhì)的密度最大，但最大軸處的介質(zhì)密度最小，離旋轉(zhuǎn)軸最遠(yuǎn)處介質(zhì)的密度最大，但最大介質(zhì)密度必須小于樣品中粒于的最小密度。這種方法是根據(jù)分離介質(zhì)密度必須小于樣品中粒于的最小密度。這種方法是根據(jù)分離的粒子其在梯度液中的粒子其在梯度液中沉降速度沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒的不同，使具有不同沉降速度的粒子處于不同的密度梯度層內(nèi)分成一系列區(qū)帶，達(dá)到彼此分離的目子處于不同的密度梯度層內(nèi)分成一系列區(qū)帶，達(dá)到彼此分離的目的。的。 沉降系數(shù)越大，往下沉降

21、越快，所呈現(xiàn)的區(qū)帶也越低，離心必須在沉降最快的大顆粒到達(dá)管底前結(jié)束；此離心法的關(guān)鍵是選擇合適的離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間。 該離心法的離心時(shí)間要嚴(yán)格控制，即有足夠的時(shí)間使各種粒子在介質(zhì)梯度中形成區(qū)帶，又要控制在任意一個(gè)粒子達(dá)到沉淀前。如果離心時(shí)間過長(zhǎng)，所有的樣品可全部到達(dá)離心管底部；離心時(shí)間不足，樣品還沒有分離。由于此法是一種不完全的沉降，沉降受物質(zhì)本身大小的影響較大，一般是應(yīng)用在物質(zhì)大小相異而密度相同的情況。 注意： 、離心后在近旋轉(zhuǎn)軸處（X1）的介質(zhì)密度最小，離旋轉(zhuǎn)軸最遠(yuǎn)處（X2）介質(zhì)的密度最大 ； 、最大介質(zhì)密度必須小于樣品中粒子的最小密度，即Pm ； 、梯度液在離心過程中以及離心完畢后，取樣時(shí)起著

22、支持介質(zhì)和穩(wěn)定劑的作用，避免因機(jī)械振動(dòng)而引起已分層的粒子再混合； 、此法是一種不完全的沉降，沉降受物質(zhì)本身大小的影響較大，一般是應(yīng)用在物質(zhì)大小相異而密度相同的情況； 、常用的梯度液有Ficoll、蔗糖、甘油、KBr、CsCl等 （2）等密度離心法 isopycnic centrifugation 又稱等比重離心法，依粒子密度差進(jìn)行分離，等密度離心法和上述速率區(qū)帶離心法合稱為密度梯度離心法。 等密度離心法的分離效率取決于樣品顆粒的浮力密度差，密度差越大，分離效果越好，與顆粒大小和形狀無(wú)關(guān)，但大小和形狀決定著達(dá)到平衡的速度、時(shí)間和區(qū)帶寬度。 原理原理 等密度離心法是在離心前預(yù)先配制介質(zhì)的密度梯度，

23、此種密度等密度離心法是在離心前預(yù)先配制介質(zhì)的密度梯度，此種密度梯度液梯度液包含了被分離樣品中所有粒子的密度，包含了被分離樣品中所有粒子的密度，待分離的樣品鋪在待分離的樣品鋪在梯度液面或和梯度液先混合，離心開始后，當(dāng)梯度液由于離心力梯度液面或和梯度液先混合，離心開始后，當(dāng)梯度液由于離心力的作用逐漸形成底濃而管頂稀的密度梯度，與此同時(shí)原來(lái)分布均的作用逐漸形成底濃而管頂稀的密度梯度，與此同時(shí)原來(lái)分布均勻粒子也發(fā)生重新分布。當(dāng)管底介質(zhì)的密度大于粒子的密度，粒勻粒子也發(fā)生重新分布。當(dāng)管底介質(zhì)的密度大于粒子的密度，粒子上浮；在彎頂處粒子密度大于介質(zhì)密度時(shí)，則粒子沉降，最后子上浮；在彎頂處粒子密度大于介質(zhì)密

24、度時(shí)，則粒子沉降，最后粒子進(jìn)入到一個(gè)它本身的密度位置即粒子密度等于介質(zhì)密變，此粒子進(jìn)入到一個(gè)它本身的密度位置即粒子密度等于介質(zhì)密變，此時(shí)速度為零粒子不再移動(dòng)，粒子形成純組分的區(qū)帶，與樣品粒子時(shí)速度為零粒子不再移動(dòng)，粒子形成純組分的區(qū)帶，與樣品粒子的密度有關(guān)，而與粒子的大小和其他參數(shù)無(wú)關(guān)，因此只要轉(zhuǎn)速、的密度有關(guān)，而與粒子的大小和其他參數(shù)無(wú)關(guān)，因此只要轉(zhuǎn)速、溫度不變，則延長(zhǎng)離心時(shí)間也不能改變這些粒子的成帶位置。溫度不變，則延長(zhǎng)離心時(shí)間也不能改變這些粒子的成帶位置。 mP時(shí)粒子上?。籔m時(shí)，則粒子沉降，最后粒子進(jìn)入到一個(gè)它本身的密度位置即Pm； 等密度區(qū)帶離心法所用的梯度介質(zhì)通常為氯化絕CSCl，

25、其密度可達(dá)1.7 g/cm3。此法可分離核酸、亞細(xì)胞器等，也可以分離復(fù)合蛋白質(zhì)，但簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)不適用。 體系到達(dá)平衡狀態(tài)后，再延長(zhǎng)離心時(shí)間和提高轉(zhuǎn)速已無(wú)意義，處于等密度點(diǎn)上的樣品顆粒的區(qū)帶形狀和位置均不再受離心時(shí)間所影響，提高轉(zhuǎn)速可以縮短達(dá)到平衡的時(shí)間，離心所需時(shí)間以最小顆粒到達(dá)等密度點(diǎn)（即平衡點(diǎn)）的時(shí)間為基準(zhǔn)，有時(shí)長(zhǎng)達(dá)數(shù)日。收集區(qū)帶的方法： （1）用注射器和滴管由離心管上部吸出。 （2）用針刺穿離心管底部滴出。 （3）用一根細(xì)管插入離心管底，泵入超過梯度介質(zhì)最大密度的取代液，將樣品和梯度介質(zhì)壓出，用自動(dòng)部分收集器收集。（4）用針刺穿離心管區(qū)帶部份的管壁，把樣品區(qū)帶抽出。以超高速離心大量制備質(zhì)粒

26、（3）梯度溶液的制備 A、梯度材料的特點(diǎn) 與被分離的生物材料不發(fā)生反應(yīng)即完全惰性，且易與所分離的生物粒子分開。 可達(dá)到要求的密度范圍，且在所要求的密度范圍內(nèi)，粘度低，滲透壓低，離子強(qiáng)度和pH變化較小。 不會(huì)對(duì)離心設(shè)備發(fā)生腐蝕作用。 容易純化，價(jià)格便宜或容易回收。 濃度便于測(cè)定，如具有折光率。 對(duì)于超速離心分析工作來(lái)說(shuō)，它的物理性質(zhì)、熱力學(xué)性質(zhì)應(yīng)該是已知的。 B、常用的梯度材料 糖類：蔗糖、甘油、聚蔗糖（Ficoll）、右旋糖酐、糖原。 無(wú)機(jī)鹽類：CsCl（氯化銫）、RbCl（氯化銣）、NaCl、KBr等。 有機(jī)碘化物：三碘苯甲酰葡萄糖胺等。 硅溶膠：如Percoll。 蛋白質(zhì)：如牛血清白蛋白。

27、 重水。 非水溶性有機(jī)物：如氟代碳等。C、梯度材料的應(yīng)用范圍 、蔗糖：水溶性大，性質(zhì)穩(wěn)定，滲透壓較高，其最高密度可達(dá)1.33g/ml，且由于價(jià)格低容易制備，是現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室里常用于細(xì)胞器、病毒、RNA分離的梯度材料，但由于有較大的滲透壓，不宜用于細(xì)胞的分離。 、聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll-400也就是相對(duì)分子重量為400000，F(xiàn)icoll滲透壓低，但它的粘度卻特別高，為此常與泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用于分離各種細(xì)胞包括血細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、鼠肝細(xì)胞等。 、氯化銫：是一種離子性介質(zhì)、水溶性大，最高密度可達(dá)1.91g/ml。由于它是重金屬鹽類，在離心時(shí)形成的梯度有

28、較好的分辨率，被廣泛地用于DNA、質(zhì)粒、病毒和脂蛋白的分離，但價(jià)格較貴。 、鹵化鹽類：KBr和NaCl可用于脂蛋白分離，KI和NaI可用于RNA分離，其分辨率高于銫鹽。NaCl梯度也可用于分離脂蛋白，NaI梯度可分離天然或變性的DNA。 、Percoll：是商品名，它是一種SiO2膠體外面包了一層聚乙烯吡咯烷酮（PVP），滲透壓低，它對(duì)生物材料的影響小，而且顆粒穩(wěn)定，在冷卻和凍融情況下還是穩(wěn)定的，其粘度高，且在酸性pH和高離子強(qiáng)度下不穩(wěn)定。它可用于細(xì)胞、細(xì)胞器和病毒的分離。 D、密度梯度的制備 、不連續(xù)密度梯度的制備 手工制作：先配不同密度的溶液，按從大到小依次加入到離心管，可借助注射器； 、連續(xù)密度梯度的制備 梯度混合儀： 線性密度梯度 指數(shù)連續(xù)密度梯度Isopycnic Equilibration(CsCl 梯度形成)Zone Centrifugation(預(yù)制梯度)高 速 離 心Gravity Centrifugation(無(wú)梯度) 高速離心與兩種超高速離心法的比較：樣本：多為蛋白質(zhì)密度相似、分子量不同者樣本：多為核酸密度不同、分子量相似者一般的重力離心僅把顆粒與