離子色譜方法及應用講義

1、“離子色譜方法及應用”講義張筑元2007年11月1 方法原理1.1 離子色譜的創(chuàng)立離子色譜（以下簡稱IC）是高效液相色譜的一種，是分析離子的一種液相色譜方法。液相色譜法（1906年，俄國植物學家Tswett ）：1906年色譜的發(fā)明者，俄國植物學家M.S.Tswett，在研究植物色素的過程中，將植物葉子的萃取物倒入填有碳酸鈣的直立玻璃管內(nèi)，然后加入石油醚使其自由流下，結(jié)果色素中各組分互相分離并形成各種不同顏色的譜帶。這種方法因此得名為色譜法。紙色譜法：20世紀40年代至50年代初，先后出現(xiàn)了紙色譜（paper chromatography,PC）和薄膜色譜法(thin-layer chroma

2、tography,TLC)。特點：較經(jīng)典色譜法簡單、分離時間短，樣品量要求小。氣相色譜法（1952年）：1952年，James和Martin提出了氣相色譜法（gas chromatography,GC)。特點：以氣體作為流動相。應用范圍廣泛受到人們重視。但對不易氣化和熱不穩(wěn)定性差的化合物難以分離。高效液相色譜法：20世紀60年代后期由于新型色譜柱填料、高壓輸液泵和高靈敏度的檢測器的出現(xiàn)，發(fā)展出了高效液相色譜（High performance liquid chromatograghy,HPLC）。高效液相色譜法的廣泛應用始于70年代，經(jīng)過三十幾年的發(fā)展，在基礎(chǔ)理論、儀器裝置和色譜柱等方面的研究

3、已趨于成熟。其應用范圍十分廣泛，幾乎能夠分析所有的有機、高分子、生物樣品。據(jù)估計，目前已知的化合物中，有80%的化合物需要用高效液相色譜進行分離分析。離子色譜法（1975年， Small H ）：現(xiàn)代離子色譜開始于Small H及其合作者的工作，他們于1975年發(fā)表了第一篇IC論文，同年商品儀器問世。1.2 色譜法實質(zhì)與目的實質(zhì)：分離。目的：定性分析或定量分析。1.3 色譜法分類1.3.1 按兩相分子的聚集狀態(tài)分：類別流動相固定相類型液相色譜液體固體液-固色譜液體液體液-液色譜氣相色譜氣體固體氣-固色譜氣體液體氣-液色譜1.3.2 按固定相的固定方式分：柱色譜：包括填充柱色譜、毛細管柱色譜；平

4、面色譜：包括紙色譜、薄層色譜、高分子薄膜色譜；1.3.3 按分離機制分：分配色譜，利用分配系數(shù)的不同；吸附色譜，利用物理吸附性能的差異；離子交換色譜，利用離子交換原理；空間排阻色譜，利用排阻作用力的不同。1.3.4 色譜法簡單分類（按流動相）色譜法氣相色譜法填充柱色譜法毛細管色譜法液相色譜法柱色譜法經(jīng)典液相柱色譜法高效液相色譜法（包括離子色譜）平板色譜法紙色譜法薄層色譜法超臨界流體色譜法電色譜法1.4 液相色譜分類按分離機理分為：類 型 分離機理 分析對象或應用領(lǐng)域吸附色譜 吸附能，氫鍵 異構(gòu)體分離、族分離，制備 分配色譜 疏水作用 各種有機物分析與制備凝膠色譜 溶質(zhì)分子大小 高分子分子量及其

5、分布測定離子色譜 離子性物質(zhì)的分析手性色譜 立體效應 手性異構(gòu)體分離，藥物純化親和色譜 生化特異親和力 蛋白、酶、抗體鹽析色譜 溶劑化作用 蛋白質(zhì)、非電解質(zhì)分析1.5 離子色譜分類分離模式 分離機理 分析對象或應用領(lǐng)域離子交換 庫侖力 無機和有機離子分析離子排斥 Donnan平衡 有機酸、氨基酸、醇、醛離子對 疏水作用 離子性物質(zhì)分析離子抑制 疏水作用 有機弱酸弱堿分析離子分配 疏水作用 生物大分子金屬配合物 疏水、螯合 金屬離子1.6 不同分離模式所利用的溶質(zhì)性質(zhì)分離模式 所利用的物質(zhì)的性質(zhì)差異離子交換 電荷與離子體積離子排斥 解離常數(shù)與疏水性離子對 (RP) 與離子對試劑之間的親和力，離子

6、對化合物的疏水性 離子抑制(RP) 在一定pH值下的疏水性反相分配(RP) 有機離子本身的疏水性1.7 離子色譜分析的對象物質(zhì)離子類別 主要離子種類無機陰離子 鹵素及簡單陰離子、酸根陰離子、陽離子的配陰離子無機陽離子 堿金屬、銨離子、堿土金屬、過渡金屬、稀土元素有機陰離子 有機酸、烷基硫酸、烷基磺酸、磷酸、多聚磷酸有機陽離子 胺、醇胺、銨鹽、吡啶、生物堿、锍鹽天然有機物 糖、醇、酚、醛、維生素生物物質(zhì) 有機磷化合物、氨基酸、肽、核酸、核甙酸、蛋白質(zhì)、 堿基、抗生素1.8 離子色譜法的優(yōu)點無機陰離子分析的絕對優(yōu)勢。同時測定多種陰離子的快速、靈敏而準確的分析手段當首推離子色譜法。分析速度快。通常幾

7、分鐘至十幾分鐘。對7種常見陰離子（F-、Cl-、Br-、NO2-、SO42-、PO43-）和6種陽離子（Li+、Na+、K+、Mg2+、Ca2+）的平均分析時間分別小于10分鐘。用高效快速分離柱對上述7種最重要的常見陰離子的分離只需3分鐘。檢測靈敏度高。離子色譜分析的濃度范圍為g/Lmg/L。直接進樣50L，對常見陰離子的檢出限小于1050L。選擇性好。非離子性物質(zhì)無保留。 多離子同時分析。離子色譜柱的穩(wěn)定性高，使用壽命長。1.9 離子交換色譜基本原理離子交換色譜分離機理主要是離子交換,是基于離子交換樹脂上可離解的離子與流動相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子之間進行的可逆交換,依據(jù)這些離子對交換劑有不

8、同的親和力而被分離。對樹脂親和力弱的離子較親和力強的離子通過柱子快。常見陰離子F-、Cl-、 NO3-、SO42-對樹脂的親和力依次增強。2 儀器構(gòu)成2.1 常用儀器2.2 儀器構(gòu)成：流動相輸送系統(tǒng)、分離系統(tǒng)（分離柱）、檢測系統(tǒng)（檢測器）、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)4個部分。2.3 流動相輸送系統(tǒng)離子色譜流動相要求耐酸耐堿系統(tǒng)，凡是流動相通過的管道、閥門、泵、柱子及接頭等不僅要求耐壓，而且要求耐酸堿腐蝕。流動相儲存容器（玻璃或聚四氟乙烯，碳酸體系需密封）。在線脫氣裝置（惰性氣體鼓泡吹掃、真空脫氣 ）。高壓泵。對泵的基本要求：高穩(wěn)定性，直接關(guān)系到分析結(jié)果的重復性和準確性；流量控制準確，精度通常要求小于

9、7;0.5%；一般要求能夠耐2540MPa的高壓；泵的死體積要小，通常要求小于0.5mL；能精確地調(diào)節(jié)流動相流量，流量測定精度約0.1%。2.4 分離柱離子色譜儀的核心部件是分離柱。分離柱由分析柱和保護柱組成。常用分析柱內(nèi)徑：3.0, 4.0, 4.6, 8.0mm，長：50, 100, 150, 250mm。柱管材料是惰性的，一般均在室溫下使用。固定相是分離柱（離子色譜）的核心。固定相種類：離子交換劑、兩性離子交換劑、螯合樹酯、氧化還原樹酯。最常用的固定相是離子交換劑。離子交換劑是一類帶有離子交換功能基的固體微粒。其結(jié)構(gòu)為在交聯(lián)的高分子骨架上結(jié)合可解離的無機基團。在離子交換反應中，離子交換劑

10、的本體結(jié)構(gòu)不發(fā)生明顯的變化，僅由其帶有的離子與外界同電性離子發(fā)生等量的離子交換。離子交換劑種類：無機離子交換劑（如水合磷酸鋯、鎢酸鋯、鉬酸鋯等）、離子交換樹脂（包括強酸型陽離子交換樹脂、強堿型離子交換樹脂、弱酸型、弱堿型、螯合型等）。離子交換色譜的固定相具有固定電荷的功能基，陰離子交換色譜固定相的功能基一般是季胺基，陽離子交換色譜的固定相一般為磺酸基。2.5 檢測器離子色譜儀檢測器分為2大類，即電化學檢測器和光學檢測器。電化學檢測器包括電導、支流安培、脈沖安培和積分安培；光學檢測器包括紫外-可見和熒光。常用檢測器是電導檢測器，分為抑制型和非抑制型2種。離子交換色譜儀常用抑制型電導檢測器。抑制器

11、是電導檢測器的關(guān)鍵部件。其主要作用是：降低背景電導，增大溶質(zhì)電導；在線產(chǎn)生再生劑；顯著提高電導檢測器的靈敏度和選擇性。電導檢測器基本原理：離子的摩爾電導與濃度成正比關(guān)系。2.6 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)色譜工作站2.7 影響離子色譜分離的主要因素填料（功能基團種類、粒徑及其分布）柱溫（室溫800C）流動相組成與濃度流動相流速（通常使用0.5-2.0mL/min）流動相中的雜質(zhì)成分3 實驗技術(shù)3.1 樣品預處理樣品預處理的目的主要是將樣品轉(zhuǎn)變成水溶液或水與極性有機溶劑（甲醇、乙腈等）的混合溶液；減少和除去干擾物；減少基體濃度；濃縮和富集待測成分，使之符合IC進樣的要求，得到準確結(jié)果。IC法靈敏度較高，一般用

12、較稀的樣品溶液。對未知液體樣品，最好先稀釋100倍后進樣，再根據(jù)所得結(jié)果選擇適當稀釋倍數(shù)，可減少超柱容量和強保留組分對柱子的污染。進樣時須過濾除去顆粒物，用過濾器時必須事先洗凈，待得到滿意的空白后再用。若樣品中含有有機污染物，最方便而有效的方法是將樣品通過預處理柱。對有機物含量較高的工業(yè)污水，應先用有機溶劑萃取除去大量有機物，再通過預言處理柱。對固體樣品，常用的方法是用水或淋洗液提取，若溶解不完全或溶解速度很慢，可在超聲波或微波處理下用水或淋洗液提取。3.2 進樣技術(shù)手工進樣、自動進樣。3.3 固定相制備技術(shù)球形、均勻的基質(zhì)顆粒；分析填料：37um；制備填料：2040um功能修飾：鍵合與包覆（

13、附聚）柱填充技術(shù)：高壓、勻降柱尺寸：微柱(<1mm）、半微柱(1-3mm)新技術(shù)：整體柱,有序介孔材料3.4 淋洗技術(shù)淋洗液流速：流速和保留時間之間存在反比關(guān)系。增加流速，可縮短保留時間，提高分析速度；降低流速，可使保留時間延長，優(yōu)點是改善分離效果。淋洗液的選取：抑制型電導檢測陰離子交換色譜常用流動相陰離子交換色譜中，淋洗液類型和濃度主要由是否用抑制器來決定，而陽離子交換色譜中，此先決條件不是必須的。對堿金屬、銨、小分子脂肪族胺的分離，一般選用鹽酸或硝酸，常用濃度240mmol/L，若淋洗液濃度太大，會導致高的背景電導，降低用電導檢測堿土金屬離子的靈敏度。對堿金屬和堿土金屬的常規(guī)分析，推

14、薦的分離柱是CS12柱，一次進樣能同時分析堿金屬、堿土金屬和銨。3.5 抑制技術(shù)作用：降低淋洗液背景電導，增加被測離子電導值，從而提高靈敏度。效果：靈敏度提高12個數(shù)量級。抑制劑（再生液）的提供（外加、在線電解）。目前最先進的抑制器是美國Dionex公司生產(chǎn)的SRS型抑制器，它是微膜抑制器的改進和完善。3.6 無機陰離子分析淋洗液：一般情況下，只要弱酸在pH8時能以陰離子形式存在，其陰離子對固定相具有適當親和力，這種弱酸的鹽就可用作淋洗液。有機改進劑：有機溶劑可調(diào)節(jié)離子交換過程的選擇性，改變分離柱對分析物的保留特性，從而改變洗脫順序、峰效和分離度；可改善樣品的溶解性，擴大IC的應用范圍；使分離

15、柱被有機物污染后的清洗成為可能。若在較長的洗脫時間來改善分離度，則應選用含有甲醇的淋洗液；為了縮短保留時間，則應選用乙腈。無機陰離子的洗脫順序：決定離子對固定相的親和力有水合離子半徑和離子的價數(shù)。一般情況下，保留時間隨水合離子半徑的增加而增加；離子的價數(shù)越高，保留越強。3.7 無機陽離子分析淋洗液：對堿金屬、銨、小分子脂肪族胺的分離，一般選用鹽酸或硝酸，常用濃度240mmol/L。4 儀器維護4.1 分析泵常見故障與排除淋洗液脫氣與泵內(nèi)氣泡排除：儀器初次使用或更換淋洗液時，管路中的氣泡易進入泵內(nèi)，造成系統(tǒng)壓力和流量不穩(wěn)定，同時分析泵馬達為維持系統(tǒng)壓力平衡而加快運轉(zhuǎn)產(chǎn)生噪音。已經(jīng)進入泵內(nèi)的氣泡，

16、可通過啟動閥排除。具體做法：先停泵，用一個10mL注射器在啟動閥處向泵內(nèi)注射去離子水或淋洗液，可反復幾次直到氣泡排除為止，然后再將泵啟動。漏液：泵漏液時，儀器無法工作。泵密封圈屬易耗品，正常使用情況下每6至12個月更換一次。為延長密封圈壽命，在使用了濃度較高的堿以后，要用去離子水清洗泵頭部分，以防產(chǎn)生沉淀物。系統(tǒng)壓力升高：在系統(tǒng)壓力超過正常壓力30%以上時，可認為該系統(tǒng)壓力不正常。保護柱的濾片因有物質(zhì)沉積而使壓力升高，更換濾片；某段管子堵塞造成系統(tǒng)壓力突然升高，逐段檢查，更換；室溫較低時，系統(tǒng)壓力升高，設(shè)法使室溫保持在15以上；流量過高，壓力升高，應按要求設(shè)定流量。4.2 檢測器常見故障及排除

17、性能良好的檢測器其基線噪音在較高靈敏度時仍能保持很小。電導池內(nèi)產(chǎn)生氣泡會使基線噪音增大，可通過增加出口反壓和向池內(nèi)注射乙醇或異丙醇除去。電導池被玷污也會造成噪音增加，可用酸清洗電導池。4.3 色譜柱常見故障柱壓升高：色譜柱過濾網(wǎng)板被玷污，需更換，更換時注意不可損失柱填料。柱接頭不能擰的過緊，不漏液即可，擰得過緊會使輸液管斷口變形。分離度降低：改善分離度，要綜合考慮組分對交換樹脂的親和力、離子半徑、離子價態(tài)等因素。死體積增大：注意色譜柱的pH應用范圍；若分離柱入口處出現(xiàn)空隙，可填充一些惰性樹脂球以減小死體積的影響。保留時間縮短或延長：儀器某部分可能漏液，擰緊接頭；系統(tǒng)內(nèi)有氣泡使得泵不能按設(shè)定的流

18、速傳送淋洗液，排除氣泡；可能是抑制器的問題（見4.4節(jié)）；使用NaOH淋洗時空氣中CO2的影響，可采用50%NaOH儲備液，使用預先經(jīng)過脫氣的水配制，配好的淋洗液用氦氣或高純氮氣保護。4.4 抑制器常見故障抑制器常見故障是峰面積減小、背景電導升高和漏液。峰面積減?。何⒛こ浞炙?，做法是，用注射器向陰離子抑制器內(nèi)以淋洗液流路相反的方向注射0.2mol/L硫酸（陽離子抑制器用0.2mol/LNaOH溶液），同時向再生液進口注入少許去離子水，恢復離子交換功能。微膜充分水化之前，應避免用高壓泵直接泵溶液進入抑制器。抑制器內(nèi)玷污的金屬離子用草酸清洗。背景電導升高：若背景電導高，說明抑制器部分存在一定問題，絕大多數(shù)是操作不當造成，如流路堵塞或無溶液流動等；膜被污染，需更換新的抑制器。漏液：微膜須充分水化，保證再生液出口順暢。4.5 色譜柱的保存大多數(shù)陰離子分離柱在堿性條件下保存，陽離子分離柱在酸性條件下保存。長時間保存時，先按要求向柱內(nèi)泵入保存液，然后將柱子從儀器上取下，用無孔接頭將柱子兩端堵住后放在通風干燥處保存。短時間不使用，每周至少開機一次，讓儀器運行1至2小時。4.6 抑制器的保存微膜抑制器應使其內(nèi)部保持潮濕的環(huán)境。使