東華大學(xué)研一基因工程課件

1、緒論：基因工程研究意義基因工程是獲取、整理、破譯、編輯和表達(dá)生物體遺傳信息的一種操作平臺(tái)與技術(shù)，它以細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的基本理論為指導(dǎo)，在基因的分離克隆、基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制的詮釋、基因編碼產(chǎn)物的產(chǎn)業(yè)化、生物遺傳性狀的改良和基因治療等方面顯示出愈來(lái)愈高的實(shí)用價(jià)值。重組DNA技術(shù)重組DNA技術(shù)是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳病表達(dá)出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序，也成為分子克隆技術(shù)。供體、受體、載體是重組DNA技術(shù)的三大基本元件。重組DNA技術(shù)和基因工程的基本用途（1）分離、擴(kuò)增、鑒定、研究、整理

2、生物信息資源（2）大規(guī)模生產(chǎn)生物活性物質(zhì)（3）設(shè)計(jì)、構(gòu)建生的新性狀甚至新物種基因工程的基本形式第一代：蛋白多肽基因的高效表達(dá)經(jīng)典基因工程第二代：蛋白編碼序列的定向誘變蛋白質(zhì)工程第三代：代謝信息途徑的修飾重構(gòu)途徑工程第四代：基因組或染色體的轉(zhuǎn)移基因組工程生物技術(shù)生物技術(shù)包括基因工程、細(xì)胞工程、酶工程和發(fā)酵工程等，又稱生物工藝學(xué), 生物工程學(xué)。是根據(jù)生物學(xué)、化學(xué)和工程學(xué)的原理進(jìn)行工業(yè)規(guī)模的經(jīng)營(yíng)和開發(fā)微生物、動(dòng)植物細(xì)胞及其亞細(xì)胞組分, 進(jìn)而利用生物體所具有的功能元件(如基因、蛋白質(zhì))等來(lái)提供商品或社會(huì)服務(wù)的一門綜合性科學(xué)技術(shù)。（1）遺傳工程(genetic engineering)遺傳工程是遺傳學(xué)和

3、工程學(xué)相結(jié)合的一門技術(shù)科學(xué)。借用工程技術(shù)上的設(shè)計(jì)思想, 在離體條件下,對(duì)生物細(xì)胞、細(xì)胞器、染色體或DNA分子進(jìn)行按圖施工的遺傳操作,以求定向地改造生物的遺傳性。遺傳工程的概念有廣義和狹義之分。 廣義的遺傳工程包括傳統(tǒng)遺傳操作中的雜交技術(shù)和現(xiàn)代遺傳操作中的基因工程和細(xì)胞工程, 狹義的遺傳工程僅指基因工程。（2）基因工程的基本定義 基因工程指重組DNA技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計(jì)與應(yīng)用，包括上游技術(shù)與下游技術(shù)兩部分。上游技術(shù)指基因重組、克隆和表達(dá)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建（即重組DNA技術(shù)），下游技術(shù)則涉及基因工程菌或細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因產(chǎn)物的分離純化過(guò)程。又稱基因操作(gene manipulation),重組DNA

4、(recombinant DNA)?；蚬こ淌且苑肿舆z傳學(xué)為理論基礎(chǔ),以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段,將不同來(lái)源的基因(DNA分子), 按預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，在體外構(gòu)建雜種DNA分子,然后導(dǎo)入活細(xì)胞, 以改變生物原有的遺傳特性,獲得新品種, 生產(chǎn)新產(chǎn)品, 或是研究基因的結(jié)構(gòu)和功能。（3）細(xì)胞工程(cell engineering)應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)的原理和方法,結(jié)合工程學(xué)的技術(shù)手段,按照人們預(yù)先的設(shè)計(jì),有計(jì)劃地改變或創(chuàng)造細(xì)胞遺傳性的技術(shù),以及在體外大量培養(yǎng)和繁殖細(xì)胞,或獲得細(xì)胞產(chǎn)品,或利用細(xì)胞體本身的技術(shù)領(lǐng)域。主要內(nèi)容包括細(xì)胞融合、細(xì)胞拆合、染色體轉(zhuǎn)移、基因轉(zhuǎn)移、細(xì)胞或組織培養(yǎng)等。由于所用細(xì)胞

5、的來(lái)源不同，細(xì)胞工程又分為微生物細(xì)胞工程、植物細(xì)胞工程、動(dòng)物細(xì)胞工程等。（4）細(xì)胞分泌工程 根據(jù)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成和運(yùn)輸理論而發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的細(xì)胞工程技術(shù)，主要是通過(guò)對(duì)基因改造，如基因缺失、多效分泌突變、周質(zhì)泄漏突變或加接信號(hào)肽等措施，促進(jìn)基因產(chǎn)物分泌的技術(shù)。（5）酶工程(enzyme engineering) 又稱酶技術(shù)圍繞著酶所特有的生化催化特性,結(jié)合現(xiàn)代的技術(shù)手段,在體外模擬或在常溫常壓下生成酶反應(yīng)的產(chǎn)品以及利用重組DNA技術(shù)定向改變酶,進(jìn)行酶的修飾,或酶的全人工合成。其主要內(nèi)容包括酶的化學(xué)修飾、酶的固定化、酶反應(yīng)器等。（6）蛋白質(zhì)工程(protein engineering)是更廣義上

6、的包括酶工程在內(nèi)的蛋白質(zhì)修飾操作,通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)及酶的化學(xué)修飾及基因改造獲得具有特殊功能的非天然蛋白質(zhì)的技術(shù)。主要是根據(jù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能間的相互關(guān)系,利用基因工程技術(shù),或用化學(xué)方法,合成基因,改造基因,以便合成新的蛋白質(zhì),或改變蛋白質(zhì)的活性、功能以及溶解性等。（7）發(fā)酵工程(fermentation engineering) 又稱微生物工程,微生物發(fā)酵工程。利用生物,主要是微生物的某種特定功能,通過(guò)現(xiàn)代化工程技術(shù)手段,生產(chǎn)有用物質(zhì), 或把微生物直接用于某種工業(yè)化生產(chǎn)的一種技術(shù)體系。主要內(nèi)容包括菌種選育, 發(fā)酵生產(chǎn)微生物,或植物細(xì)胞的代謝產(chǎn)物, 生產(chǎn)微生物菌體,最佳培養(yǎng)條件的優(yōu)化組合等。 （9）

7、代謝途徑工程（metabolic engineering/pathway engineering)是一門利用重組DNA技術(shù)對(duì)細(xì)胞物質(zhì)代謝，能量代謝及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行修飾和改造，進(jìn)而優(yōu)化細(xì)胞生理代謝，提高或修飾目標(biāo)代謝產(chǎn)物以及合成全新的目標(biāo)產(chǎn)物的新學(xué)科。代謝途徑工程包括以下四個(gè)關(guān)鍵因素：1.從初級(jí)代謝途徑到目標(biāo)產(chǎn)物的實(shí)現(xiàn)和優(yōu)化，包括限速步驟的去除，轉(zhuǎn)錄和變構(gòu)調(diào)節(jié)等2.競(jìng)爭(zhēng)途徑遺傳障礙的消除3.提高碳從中心代謝到初級(jí)代謝途徑的轉(zhuǎn)化4.調(diào)節(jié)次級(jí)代謝途徑，以提高能量代謝和必需輔酶因子的有效性。（10）基因組工程（genomic engineering）以基因組為基礎(chǔ)對(duì)物種進(jìn)行大范圍修飾和改造的工程，其目的

8、是可以同時(shí)對(duì)大量的基因群體進(jìn)行操作，模擬某一生理過(guò)程，產(chǎn)生新的生命活力，改造物種，實(shí)現(xiàn)生物體能做什么，人類在實(shí)驗(yàn)室或工廠也能做什么的夢(mèng)想?；蚬こ碳夹g(shù)的應(yīng)用（1）基因診斷和基因治療基因治療指向靶細(xì)胞或組織中引入外源基因DNA或RNA片斷，以糾正或補(bǔ)償基因的缺陷，關(guān)閉或抑制異常表達(dá)的基因，從而達(dá)到治療疾病目的的生物醫(yī)學(xué)新技術(shù)。（2）生產(chǎn)多肽藥物、疫苗和抗體（3）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（畜牧業(yè)、漁業(yè)生物反應(yīng)器）和轉(zhuǎn)基因植物（農(nóng)業(yè)、林業(yè)生物反應(yīng)器）（4）冶金、輕工、食品、環(huán)保體細(xì)胞核移植體細(xì)胞克隆（1）定義：體細(xì)胞克隆又稱細(xì)胞核移植(somatic cell nuclear transplantation)技術(shù)

9、、無(wú)性繁殖技術(shù)。它是把分化程度較高的體細(xì)胞移入去核卵母細(xì)胞中，構(gòu)建成重組胚胎，通過(guò)體內(nèi)或體外培養(yǎng)、胚胎移植，產(chǎn)生與供體細(xì)胞基因型相同的后代的技術(shù)過(guò)程。動(dòng)物體細(xì)胞克隆是用動(dòng)物特定發(fā)育階段的核供體（體細(xì)胞核）及相應(yīng)的核受體（去核的原核胚或成熟的卵母細(xì)胞、卵細(xì)胞）不經(jīng)過(guò)有性繁殖過(guò)程，進(jìn)行體外重構(gòu)，并通過(guò)重構(gòu)胚的胚胎移植，從而達(dá)到擴(kuò)繁同基因型動(dòng)物種群的目的。體細(xì)胞克隆的類型 a.同種體細(xì)胞核移植：多莉羊 b.異種體細(xì)胞核移植：陳大元等將大熊貓的子宮上皮細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞核移入去核的兔卵母細(xì)胞，異種重構(gòu)胚的核遺傳物質(zhì)來(lái)自大熊貓供體細(xì)胞。這是首次大熊貓?bào)w細(xì)胞核的異種移核，對(duì)大熊貓的快繁及

10、保護(hù)提供了希望。（2）體細(xì)胞克隆的一般方法從成年動(dòng)物身體上取一點(diǎn)組織，分離出一個(gè)個(gè)含有遺傳物質(zhì)的供體細(xì)胞，將細(xì)胞核移植到去核的卵細(xì)胞中，利用微電流刺激等使兩者融合為一體。然后促使這一新細(xì)胞分裂繁殖發(fā)育成胚胎，當(dāng)胚胎發(fā)育到一定程度后，再被植入動(dòng)物子宮中使動(dòng)物懷孕，便可產(chǎn)下與提供細(xì)胞者基因相同的動(dòng)物。 這一過(guò)程中如果對(duì)供體細(xì)胞進(jìn)行基因改造，那么無(wú)性繁殖的動(dòng)物后代基因就會(huì)發(fā)生相同的變化。（3）過(guò)程供體細(xì)胞核去核的受體卵細(xì)胞核移植植入待孕動(dòng)物的子宮發(fā)育成個(gè)體生物技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域（1）醫(yī)藥： 生物制藥；基因治療；人工器官（2）農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)： 轉(zhuǎn)基因植物：抗病蟲害新品種、抗逆新品種、 高品質(zhì)新品種 轉(zhuǎn)基因動(dòng)

11、物：生產(chǎn)有用蛋白質(zhì)和高品質(zhì)的畜產(chǎn)品 生物反應(yīng)器：利用動(dòng)植物細(xì)胞或組織作為生物反應(yīng)器，直接生產(chǎn)有用蛋白質(zhì)（3）輕工與食品：新型食品；營(yíng)養(yǎng)食品；保健食品；輕工用酶 （4）環(huán)境：污染治理；廢物利用；污染物生物降解生物制藥產(chǎn)業(yè)化特點(diǎn)（1）高技術(shù)：高層次人才，高新技術(shù)手段，多學(xué)科滲透（2）高投入：在國(guó)外，一個(gè)生物藥品平均要投入13億美元，并隨著開發(fā)難度的增大,有逐步增高的趨勢(shì)（3）長(zhǎng)周期：國(guó)際上，一個(gè)新的生物藥品需要68年時(shí)間（4）高風(fēng)險(xiǎn): 一個(gè)新藥品的開發(fā)，經(jīng)過(guò)一系列的程序-研發(fā)、中試、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、IIII期臨床實(shí)驗(yàn)，上市和嚴(yán)格的藥政監(jiān)督管理。每一步都可能失敗，而前功盡棄（5）高回報(bào): 開發(fā)成功一個(gè)新的

12、生物藥品, 回報(bào)很高。如美國(guó)Amgen公司，首次開發(fā)上市的EPO、G-SCF到1997年的銷售額分別接近和達(dá)到20億美元生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化農(nóng)業(yè)領(lǐng)域1.已有35個(gè)科120多種植物獲得轉(zhuǎn)基因植物，一些重要的農(nóng)作物獲得商品化的轉(zhuǎn)基因品種。2.種植面積迅猛發(fā)展。3.采用的基因正在從抗除草劑、抗菌素、抗病蟲害基因到抗逆境、高品質(zhì)方向發(fā)展。4.由單個(gè)質(zhì)量性狀基因向多基因數(shù)量性狀轉(zhuǎn)變。5.植物反應(yīng)器生產(chǎn)稀有蛋白。生物技術(shù)與傳統(tǒng)中藥1.中藥現(xiàn)代化核心是建立與現(xiàn)代基因?qū)W說(shuō)相應(yīng)的現(xiàn)代中藥理論2.現(xiàn)代中藥理論的建立確立中藥與基因表達(dá)的關(guān)系 中藥藥靶（基因）或作用位點(diǎn)基因的尋找 中藥化學(xué)組：中藥有效成分包括較單一的成分和

13、多種成分 中藥臨床藥效的科學(xué)評(píng)價(jià)與分析方法3.生物技術(shù)的應(yīng)用中藥基因組利用現(xiàn)代生物技術(shù)研究分析中藥對(duì)人體（細(xì)胞）基因表達(dá)（蛋白質(zhì)）的影響。技術(shù)平臺(tái)：大規(guī)模基因表達(dá)分析（基因芯片、SAGE、蛋白質(zhì)組等技術(shù)）以及相關(guān)信息數(shù)據(jù)庫(kù)的建立中藥化學(xué)組利用現(xiàn)代儀器分析技術(shù)分析有效成分及其藥物代謝、動(dòng)力學(xué)。 技術(shù)平臺(tái)：色譜及色譜-質(zhì)譜，色譜-波譜，波譜-波譜聯(lián)用等分析技術(shù)與層析、臨界萃取等分離技術(shù)中藥新劑型第一章：重組DNA技術(shù)與基因工程的基本原理（1）提高外源基因的劑量分子遺傳學(xué)原理（2）篩選修飾重組基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件（啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、操作子、終止子、上游調(diào)控序列等）分子生物學(xué)原理（3）修飾構(gòu)建蛋白質(zhì)生

14、物合成的翻譯調(diào)控元件（SD序列、mRNA非編碼區(qū)、密碼子）分子生物學(xué)原理（4）基因工程菌（微型生物反應(yīng)器）的增殖及穩(wěn)定生產(chǎn)生化工程學(xué)原理分子生物學(xué)中的幾個(gè)概念：（1）啟動(dòng)子：一段供RNA聚合酶定位用的DNA序列，通常位于基因的上游，長(zhǎng)度一般不超過(guò)200bp.具有序列特異性、方向特異性、位置特異性、種屬特異性等特點(diǎn)（2）增強(qiáng)子：由一組與啟動(dòng)子關(guān)系密切的DNA瞬時(shí)調(diào)控與案件組成。具有位置不固定、無(wú)方向性等特點(diǎn)。（3）操作子：由一個(gè)或多個(gè)DNA順式調(diào)控元件組成，其功能是基因表達(dá)反式調(diào)控因子的結(jié)合區(qū)，對(duì)操縱子的開放和關(guān)閉進(jìn)行調(diào)控。（4）操縱子：原核細(xì)胞生物功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因成簇排列的轉(zhuǎn)錄單位。包括啟動(dòng)

15、子、結(jié)構(gòu)基因、操作子和終止子。（5）終止子：為轉(zhuǎn)錄提供終止信號(hào)的RNA序列稱為終止子，其相應(yīng)的DNA編碼序列稱為終止子。一般位于操縱子的末端，或分散在一些結(jié)構(gòu)基因的下游。分為本征終止子和r因子依賴型終止子。（6）SD序列：在細(xì)菌mRNA 起始密碼子AUG上游10個(gè)堿基左右處，有一段富含嘌呤的堿基序列，能與細(xì)菌16SrRNA3端識(shí)別，幫助從起始AUG處開始翻譯，該序列稱為SD序列(SD sequence),它是1974年由J.Shine 和 L.Dalgarno發(fā)現(xiàn)的,故此而命名?；蚬こ讨械膸讉€(gè)技術(shù)：（1）核酸分子雜交技術(shù)：利用堿基互補(bǔ)原理，定性或定量檢測(cè)DNA或RNA序列片段的有力工具。通常

16、用一種已知的RNA或DNA序列片斷檢測(cè)未知的樣品核酸。已知的RNA或DNA片段為雜交探針，一般需要標(biāo)記。包括Southern blot, Northern blot（2）轉(zhuǎn)化(transformation)：外源遺傳物質(zhì)(如質(zhì)粒DNA等)進(jìn)入細(xì)菌，引起細(xì)菌遺傳變化的現(xiàn)象。但外源DNA并不整合到宿主染色體DNA上。（3）轉(zhuǎn)染(transfection)：采用與質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞相似的方法，即宿主菌先經(jīng)過(guò)CaCl2，電穿孔等處理成感受態(tài)細(xì)菌，再將重組噬菌體DNA直接導(dǎo)入受體細(xì)胞，進(jìn)入感受態(tài)細(xì)菌的噬菌體DNA可以同樣復(fù)制和繁殖，這種方式稱為轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染是轉(zhuǎn)化的一種特殊形式。（4）轉(zhuǎn)導(dǎo) (trans

17、duction) ：由噬菌體將一個(gè)細(xì)胞的基因傳遞給另一細(xì)胞的過(guò)程。它是細(xì)菌之間傳遞遺傳物質(zhì)的方式之一。其具體含義是指一個(gè)細(xì)胞的DNA或RNA通過(guò)病毒載體的感染轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞中。（5）基因定點(diǎn)突變技術(shù)：設(shè)計(jì)一對(duì)互補(bǔ)的、帶有目標(biāo)突變的引物Pfu Turbo，DNA聚合酶在非鏈置換反應(yīng)條件下使引物線性延伸，產(chǎn)生環(huán)狀帶缺刻的突變產(chǎn)物在持續(xù)不斷的循環(huán)擴(kuò)增過(guò)程中，突變引物始終只與原初模板退火延伸。Dpnl（識(shí)別GATC序列）消化不帶目標(biāo)的甲基化的原始模板，但目標(biāo)突變的子鏈退火形成具有缺刻的雙鏈DNA，繼而轉(zhuǎn)化入XL-2 Blue超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞中，突變率接近100%。（6）PCR：利用DNA聚合酶對(duì)特定基

18、因做體外或試管內(nèi)(In Vitro)的大量合成?；旧纤抢肈NA聚合酶進(jìn)行專一性的連鎖復(fù)制。目前常用的技術(shù),可以將一段基因復(fù)制為原來(lái)的一百億至一千億倍。PCR反應(yīng)要素：.要被復(fù)制的DNA模板(Template).界定復(fù)制范圍兩端的引物(Primers).DNA聚合酶(Taq.Polymearse)4.合成的原料及水PCR反應(yīng)步驟：1).變性（Denaturation）2).退火（Annealing of primers）3).延伸（Extension of primers）幾種PCR技術(shù)：（1）原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（In Still PCR, IsPCR）：由Haase等于1990年首創(chuàng)。它

19、是利用完整的細(xì)胞作為一個(gè)微小的反應(yīng)體系來(lái)擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的目的片段,在不破壞細(xì)胞的前提下,利用一些特定的檢測(cè)手段來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物。該法可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)病毒感染、細(xì)胞內(nèi)基因重排、以及分析細(xì)胞內(nèi)RNA表達(dá)產(chǎn)物。直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增。可進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。適用于檢測(cè)病理切片中含量較少的靶序列作用：既往鑒定細(xì)胞內(nèi)特異序列一般采用原位雜交（ISH）,但在每個(gè)細(xì)胞中目的片段的拷貝數(shù)少于10的情況下,該方法的敏感度就明顯下降。而標(biāo)準(zhǔn)的PCR則可擴(kuò)增出細(xì)胞內(nèi)單拷貝的序列,敏感度很高,但卻未能與細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究相結(jié)合。ISPCR則可把這兩者結(jié)合起來(lái),成為細(xì)胞學(xué)診斷中一種嶄新的檢測(cè)技術(shù)。利用

20、該法可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)病毒感染、細(xì)胞內(nèi)基因重排、以及分析細(xì)胞內(nèi)RNA表達(dá)產(chǎn)物等方面發(fā)揮一定作用。在檢測(cè)細(xì)胞的潛在感染方面也具有重要意義。（2）反向PCR（reverse PCR）是用反向的互補(bǔ)引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段對(duì)某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。 可對(duì)未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長(zhǎng)cDNA的克隆,擴(kuò)增基因文庫(kù)的插入DNA；建立基因組步移文庫(kù)。（3）不對(duì)稱PCR:目的：擴(kuò)增產(chǎn)生特異長(zhǎng)度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,關(guān)鍵是限制性引物的絕對(duì)量。 用途：制備

21、核酸序列測(cè)定的模板、制備雜交探針、基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究（4）多重PCR：運(yùn)用多個(gè)引物進(jìn)行PCR，用于檢測(cè)特定基因序列的存在或缺失。（5）RT-PCR：以mRNA為模板，運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄酶擴(kuò)增出mRNA-DNA雜化雙鏈，酶解mRNA后用DNA聚合酶擴(kuò)增出cDNA。（6）實(shí)時(shí)熒光定量PCR：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析的方法。普通PCR技術(shù)只是在PCR結(jié)束后對(duì)終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。而實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)可實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增，可在擴(kuò)增的指數(shù)期對(duì)起始模板進(jìn)行定量。Ct=Alog(拷貝量)a.SYBR Green法工作原理：SYBR

22、Green只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光。因此，DNA變性時(shí)（雙鏈分開時(shí)）無(wú)熒光。在延伸結(jié)束階段采集熒光信號(hào)。當(dāng)然SYBR Green也能和非特異性的雙鏈DNA結(jié)合發(fā)光，因此，必須在反應(yīng)結(jié)束時(shí)做熔解曲線分析優(yōu)點(diǎn)：1.對(duì)DNA模板沒(méi)有選擇性適用于任何DNA2.使用方便不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針3.非常靈敏且簡(jiǎn)便缺點(diǎn)：1.容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽(yáng)性，但可通過(guò)熔解曲線分析優(yōu)化反應(yīng)條件。2.對(duì)引物特異性要求高b.TaqMan法（水解性雜交探針）5端標(biāo)記有報(bào)告基因（Report，R）如FAM，VIC等3端標(biāo)記有熒光淬滅基因（Quencher，Q）探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q所吸收時(shí)，無(wú)熒光。R與

23、Q分開時(shí)，發(fā)熒光Taq酶有53核酸外切酶活性，可水解探針優(yōu)點(diǎn)：1.對(duì)目的序列的高特異性陰性結(jié)果確定2.引物設(shè)計(jì)相對(duì)簡(jiǎn)單3.重復(fù)性比較好缺點(diǎn)：1.只適合一個(gè)特定的目標(biāo)2.委托公司標(biāo)記，價(jià)格較高PCR產(chǎn)物的兩種定量方法：（1）絕對(duì)定量法：檢測(cè)起始模板的精確拷貝數(shù)，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法。需已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒，做標(biāo)準(zhǔn)稀釋。標(biāo)準(zhǔn)樣品種類包括含有核待測(cè)樣品相同片段的質(zhì)?；蚝泻舜郎y(cè)樣品相同片段的cDNA的PCR產(chǎn)物（2）相對(duì)定量法：確定經(jīng)不同方式處理的樣本之間的相對(duì)差異2-C(t)，用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法?？赏ㄟ^(guò)包括-actin、GAPDH基因在內(nèi)的內(nèi)標(biāo)定量，而內(nèi)標(biāo)結(jié)果代表了樣品中所含細(xì)胞或基因組的數(shù)量用于核酸操作的工具酶

24、：限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶、DNA聚合酶、核酸酶、核酸修飾酶（1）限制性核酸內(nèi)切酶：識(shí)別雙鏈DNA分子中的特定序列，并切割DNA雙鏈。主要存在于原核細(xì)菌中，幫助細(xì)菌限制外來(lái)DNA的侵入命名：屬名+種名+株名=Haemophilus influenzae d=Hind III酶活定義：1U核酸內(nèi)切酶的活性=在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng)1小時(shí)，完全水解1L標(biāo)準(zhǔn)DNA所需的酶量hsd R:編碼限制性核酸內(nèi)切酶hsd M:編碼限制性甲基化酶hsd S:編碼限制性核酸內(nèi)切酶和甲基化酶的協(xié)同表達(dá)類型：主要特征I型II型III型限制修飾多功能單功能雙功能蛋白結(jié)構(gòu)異源三聚體同源二聚體異源二聚體輔助因子ATP M

25、g2+ SAMMg2+ATP Mg2+ SAM識(shí)別序列TGAN8TGCTAACN8GTGC識(shí)別雙鏈DNA分子中4-8個(gè)堿基對(duì)的特定序列旋轉(zhuǎn)對(duì)稱序列（回文結(jié)構(gòu)，如GAATTC）GAGCCCAGCAG切割位點(diǎn)距識(shí)別序列1Kb處隨機(jī)性切割識(shí)別序列內(nèi)或附近特異性切割距識(shí)別序列下游24-26bp處操作條件Tris-HCl :50mM,pH=7.5MgCl2:10mMNaCl:0-150mM(低鹽酶：0-50mM高鹽酶：150mM中鹽酶：100mM)DTT：1mM體系體積：20-100L溫度：37時(shí)間：1-1.5hII型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解注意事項(xiàng)：對(duì)鹽濃度要求不同的多種酶進(jìn)行酶切，使用較貴的酶的鹽濃

26、度，加大便宜酶的用量，同時(shí)酶解?；蚴堑望}酶先切，然后補(bǔ)加鹽，高鹽酶再切?；蚴且环N酶先切，然后更換緩沖液，換酶再切影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素：DNA樣品的純度和甲基化程度、樣品中包含蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等，緩沖液的性質(zhì)（高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端pH值等都會(huì)是一些核酸內(nèi)切酶的識(shí)別和切割序列發(fā)生低特異性，即Star activity現(xiàn)象）增加酶切效率的措施：加大酶用量、1gDNA用10U的內(nèi)切酶加大反應(yīng)體積延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間（2）DNA連接酶:功能：修復(fù)雙鏈DNA上缺口處得磷酸二酯鍵修復(fù)與RNA鏈結(jié)合的DNA鏈上缺口處得磷酸二酯鍵連接多個(gè)平頭雙鏈DNA

27、分子酶活定義：1UDNA連接酶的酶活在最佳反應(yīng)條件下15反應(yīng)1，完全連接1gDNA（HindIII片段）所需的酶量DNA連接酶的反應(yīng)條件：Tris-HCl :50-100mM,pH=7.5MgCl2:10mMATP：0.5-1mMDTT：5mM體系體積：10-20L溫度：4-15時(shí)間：4-16h連接粘性末端和平頭末端的動(dòng)力學(xué)差異：由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接，而平頭末端的連接則屬于分子間的連接，因此后則反映速度要慢得多。提高平頭末端連接效率的方法：加大連接酶用量（是粘性末端的酶用量的10倍）加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機(jī)會(huì)加入10%PEG（分子量為8000

28、），促進(jìn)大分子之間的有效作用加入單價(jià)陽(yáng)離子（NaCl），是最終濃度為1500-200mM。（3）DNA聚合酶的種類1大腸桿菌DNA聚合酶I（DNA pol I）催化功能：53DNA聚合酶活性53核酸外切酶活性35核酸外切酶活性基本用途：缺口前移標(biāo)記法、Nick translation、制備32P標(biāo)記的探針2大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）來(lái)源：大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，獲得N端三分之二的大肽段即為Klenow酶催化功能：53DNA聚合酶活性35核酸外切酶活性基本功能：補(bǔ)平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5粘性末端DNA片段的同位素末端標(biāo)記cDNA第二鏈的合成雙脫氧末端終止法測(cè)定

29、DNA序列3T4連接酶催化功能：53DNA聚合酶活性和35核酸外切酶活性在無(wú)dNTP時(shí)，可以從任何3-OH端外切在只有一種dNTP時(shí)，外切至互補(bǔ)核苷酸暴露時(shí)停止在四中dNTP均存在時(shí)，聚合活性占主導(dǎo)地位切平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的3粘性末端DNA片段的同位素末端標(biāo)記4依賴于RNA的DNA聚合酶（反轉(zhuǎn)錄酶）來(lái)源：主要來(lái)自于AMV（禽成髓細(xì)胞瘤病毒）和MoMLV（Moloney鼠白血病病毒，MMuLV）功能：具有53合成DNA活性（以RNA為模板聚合cDNA鏈），但無(wú)DNA35外切活性，也有很強(qiáng)的RNA酶H活性（可從RNA鏈3端或5端對(duì)RNA鏈進(jìn)行外切）（M-MuLV酶RNase H活力較低）（4）核酸

30、酶：1.單鏈核酸外切酶：核酸外切酶（Exo），可在沒(méi)有Mg2+的情況下，從5端和3端外切核酸鏈2.雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII），可在有Mg2+的情況下，大腸桿菌的核酸外切酶III可特異性地從3端外切3.雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶（Exo），可在有Mg2+的情況下，核酸外切酶特異性地從5端外切4.單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶來(lái)源：來(lái)自稻谷曲霉菌特點(diǎn)：降解單鏈DNA的速度比降解雙鏈DNA快75000倍Zn2+必須最適pH范圍為需要NaCl 10-300mM降解單鏈DNA的速度比降解單鏈RNA快7倍催化功能：可內(nèi)切單鏈DNA或RNA內(nèi)切帶缺口（DNA鏈上丟失一個(gè)脫氧核苷酸）或缺刻（

31、相鄰兩個(gè)堿基間的磷酸二酯鍵斷裂）的雙鏈DNA或RNA主要用途：在DNA上定位RNA（DNA鏈和mRNA雜交，DNA中的內(nèi)含子會(huì)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，用S1核酸酶水解單鏈DNA）5.單鏈內(nèi)切雙鏈外切核酸酶：Bal31核酸酶來(lái)源：來(lái)自艾氏交替單胞菌基本用途：誘發(fā)DNA突變（對(duì)某一核酸鏈每次切出的片段不同，致使重新環(huán)化后的結(jié)果也不同）（5）核酸修飾酶：1.末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（TdT）來(lái)源：小牛胸腺功能：是一種不需要模板的DNA聚合酶，可隨機(jī)摻入dNTPs2.堿性磷酸單酯酶來(lái)自小牛胸腺的堿性磷酸單酯酶：CIP來(lái)自大腸桿菌的堿性磷酸單酯酶：BAP功能：可使核苷酸或脫氧核苷酸5端的三磷酸（ppp）脫去成為-OH

32、3.T4多核苷酸激酶（T4-PNP）基本特征：在DNA鏈和RNA鏈的5-OH端加磷，通常用于探針末端的同位素標(biāo)記用于基因克隆的載體載體功能：運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件載體應(yīng)具備的條件：具有針對(duì)受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)具有較高的外源DNA的裝載能力具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn)具有合適的篩選標(biāo)記（1）質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征：質(zhì)粒時(shí)生物細(xì)胞內(nèi)固有、能獨(dú)立于寄主染色體而自主復(fù)制、并被穩(wěn)定遺傳的核酸分子常見(jiàn)于原核細(xì)菌和真菌中絕大多數(shù)質(zhì)粒時(shí)DNA型的絕大多數(shù)的天然DNA質(zhì)粒具有

33、共價(jià)、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)（即cccDNA）質(zhì)粒DNA的分子量范圍：1-300kb質(zhì)粒的自主復(fù)制性質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制，且質(zhì)粒DNA上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對(duì)應(yīng)關(guān)系嚴(yán)禁型復(fù)制控制的質(zhì)粒：1-3個(gè)拷貝松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒：10-60拷貝質(zhì)粒拷貝數(shù)是由質(zhì)粒DNA復(fù)制啟動(dòng)控制質(zhì)粒的不相容性：任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒不能同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞中，不相容性的質(zhì)粒組成不相容性群。分子機(jī)制：兩種含有不同復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)各受自己的拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定，因此在經(jīng)過(guò)若干復(fù)制周期和細(xì)胞分裂周期后仍能共處于同一細(xì)胞內(nèi)兩種含有相似復(fù)制

34、子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細(xì)胞分裂周期中更具優(yōu)勢(shì)。質(zhì)?？赊D(zhuǎn)移性革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞譃椋航雍闲再|(zhì)粒：能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞（接合作用），如F、Col、R質(zhì)粒等非接合性質(zhì)粒：不能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞（結(jié)合作用）值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（ColE1）在接合性質(zhì)粒的存在和協(xié)助下。也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個(gè)過(guò)程由bom和mob基因決定質(zhì)粒所攜帶的特殊的遺傳標(biāo)記野生型質(zhì)粒的DNA上往往攜帶一個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常所非必須的附加形狀，對(duì)DNA重組

35、分子的篩選具有重要意義物質(zhì)抗性：抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機(jī)物物質(zhì)合成：抗生素、細(xì)菌毒素、有機(jī)堿質(zhì)粒的構(gòu)建天然的野生型質(zhì)粒有分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少、遺傳標(biāo)記不理想等缺點(diǎn)，不能滿足克隆載體的要求，因此應(yīng)以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工構(gòu)建。質(zhì)粒的分類（根據(jù)功能和用途）高拷貝質(zhì)粒：突變拷貝數(shù)控制基因、拷貝數(shù)1000-3000、擴(kuò)增基因低拷貝質(zhì)粒：來(lái)自pSC101、拷貝數(shù)10、表達(dá)某些毒性基因溫敏質(zhì)粒：在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì)測(cè)序質(zhì)粒：含有測(cè)序通用引物互補(bǔ)序列和多酶接頭polylinker整合質(zhì)粒：裝有整合促進(jìn)基因及位點(diǎn)，便于外源基因的整合穿梭質(zhì)粒：裝有針對(duì)兩種不同

36、受體的復(fù)制子，便于基因克隆表達(dá)質(zhì)粒：裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件探針質(zhì)粒：裝有報(bào)告基因，便于啟動(dòng)子等元件的克隆篩選重要質(zhì)粒：pBR322：松弛型復(fù)制、氯霉素可擴(kuò)增、拷貝數(shù)50-100/cell、用于基因克隆、氨芐青霉素抗性和四環(huán)素抗性pUC18/19：拷貝數(shù)2000-3000/cell、由多克隆微點(diǎn)（MCS）、正選擇顏色標(biāo)記lacZ（藍(lán)白斑篩選）、用于基因克隆和測(cè)序pGEM-3Z：多拷貝、由多克隆微點(diǎn)（MCS）、正選擇顏色標(biāo)記lacZ（藍(lán)白斑篩選）、裝有兩個(gè)噬菌體的強(qiáng)啟動(dòng)子（T7和SP6，這兩種啟動(dòng)子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合酶所識(shí)別，因此相應(yīng)的受體菌必須表達(dá)噬菌體

37、RNA聚合酶）用于外源基因的高效表達(dá)質(zhì)粒DNA的分離純化1. 氯化銫密度梯度離心法：分離的質(zhì)粒DNA純度高、周期長(zhǎng)、設(shè)備要求高、溴化乙錠污染2. 沸水浴法：分離的質(zhì)粒DNA純度高、周期介于氯化銫密度梯度離心法和堿溶法之間3. 堿溶法：分離的質(zhì)粒DNA純度低、快速、操作簡(jiǎn)便氯化銫密度梯度離心法步驟：1. 用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體2. 加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁3. 加CsCl和溴化乙錠4. 超速離心過(guò)夜5. 在紫外燈下吸取cccDNA6. 稀釋沉淀cccDNA7. 條帶由上至下分別為蛋白質(zhì)、ocDNA和L-DNA、cccDNA和RNAs堿溶法步驟：1. 用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體2. 加溶

38、菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁3. 加NaCl和SDS的混合溶液，去膜釋放內(nèi)含物4. 加高濃度的醋酸鉀溶液，沉淀染色體，取出染色體DNA及大部分蛋白質(zhì)5. 離心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，取出痕量蛋白質(zhì)6. 乙醇或異丙醇沉淀水相質(zhì)粒DNA7. 用無(wú)DNase的RNase取出殘余的沸水浴法步驟：. 用含有EDTA和Triton X-100的緩沖液懸浮菌體. 加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁. 沸水浴40秒. 離心，用無(wú)菌牙簽挑去沉淀物. 乙醇或異丙醇沉淀水相質(zhì)粒DNA（2）噬菌體或病毒DNA噬菌體或病毒是一類非細(xì)胞微生物，能高效高特異性地侵染宿主細(xì)胞，然后或自主復(fù)制繁殖，或整合入宿主基因組種潛伏起來(lái)，而且在一定的條件

39、下上述兩種狀態(tài)還會(huì)相互轉(zhuǎn)化，因此噬菌體和病毒的DNA能被開發(fā)成為基因工程有用載體。這主要是因?yàn)椋? 具有高效率的感染性能使外源基因高效導(dǎo)入受體細(xì)胞. 自主復(fù)制繁殖能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增大腸桿菌的噬菌體DNA的特征：1.噬菌體使大腸桿菌的溫和型噬菌體2.噬菌體由外殼包裝蛋白和-DNA組成3.-DNA全長(zhǎng)48502個(gè)核苷酸4.-DNA上至少有61個(gè)基因感染周期：吸附注入復(fù)制包裝裂解吸附噬菌體感染大腸桿菌后的兩種狀態(tài)（宿主細(xì)胞本身的性質(zhì)決定了cl和int兩個(gè)基因的開放與關(guān)閉，而這兩個(gè)基因則決定噬菌體的整合與否）溶原狀態(tài)：噬菌體感染大腸桿菌后，除能裂解細(xì)胞外，也可能將其DNA直接整合到宿主細(xì)

40、胞的染色體DNA上，并不產(chǎn)生自帶噬菌體顆粒溶菌狀態(tài)：噬菌體大量復(fù)制后裂解細(xì)胞，從而釋放。包裝容量：野生型噬菌體包裝的上限為51kb，本身長(zhǎng)度為48.5kb，只有當(dāng)插入的外源DNA片段大于2.5kb時(shí)，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型-DNA的長(zhǎng)度，可以提高裝載量，而野生型-DNA上約有40-50%的片段是復(fù)制和裂解所非必須的。根據(jù)切除的多少可將-DNA分成：插入型載體和取代型載體。酶切位點(diǎn)：野生型-DNA鏈上有5個(gè)EcoRI位點(diǎn)和7個(gè)HindIII位點(diǎn)，不利于重組操作，必須刪除至1-2個(gè)。同時(shí)為了便于各種來(lái)源的DNA片段的克隆，還需要增加一些單一的酶切位點(diǎn)，除了簡(jiǎn)單的切割外，還

41、需要采用定點(diǎn)突變技術(shù)去除或增添酶切位點(diǎn)。選擇性標(biāo)記-DNA上的選擇性標(biāo)記：免疫功能類標(biāo)記和顏色反應(yīng)類標(biāo)記1.imm434： imm434基因編碼一種阻止噬菌體進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標(biāo)記基因的載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，建立溶原狀態(tài)，細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，形成渾濁斑；當(dāng)外源DNA插入到標(biāo)記基因中，基因滅活，-重組子便進(jìn)入溶菌循環(huán)，形成透明斑。2.加裝選擇標(biāo)記 lacZlacZ基因編碼-半乳糖苷酶，能催化無(wú)色的X-gal生成藍(lán)色化合物。當(dāng)外源基因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能河涌藍(lán)色化合物；而空載體-DNA則產(chǎn)生藍(lán)色透明斑3.構(gòu)建琥珀密碼子的突變體琥珀型突變（sup）指CAG（Gln）向UAG（終止

42、密碼子）的突變，但是大腸桿菌的某些含有特異性的校正基因，其編碼產(chǎn)物校正tRNA能專一地糾正這一突變。野生型-DNA上的D和E兩個(gè)頭部包裝蛋白的基因中的CAG密碼子突變?yōu)閁AG.當(dāng)這種-DNA進(jìn)入一般的大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細(xì)菌，這樣就可以阻止有害重組體的生物污染及擴(kuò)散，而基因工程實(shí)驗(yàn)中使用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌體。-DNA載體的主要類型：插入滅活型載體、取代型載體和正選擇型載體野生型噬菌體不能在P2噬菌體溶源性細(xì)菌中中繁殖（Spi+），這種生長(zhǎng)抑制表型受-DNA上的red和gam兩個(gè)基因控制。若將外源DNA取代red和gam，重組噬菌體便

43、擁有Spi-表型，能在P2噬菌體溶源性的大腸桿菌受體菌中繁殖，并形成透明斑點(diǎn)-DNA重組分子的體外包裝：-DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒方可高效導(dǎo)入受體細(xì)胞用于體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了噬菌體的大腸桿菌中提取。這些包裝蛋白分為相互互補(bǔ)的兩部分：一部分缺少E組份，另一部分缺少D組份。包裝時(shí)，當(dāng)且僅當(dāng)這兩部分包裝蛋白與重組-DNA分子混合后，包裝才能有效進(jìn)行，任何一種蛋白包裝液被重組-DNA污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這是基于安全設(shè)計(jì)的。-DNA重組分子的分離純化1.將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期2.加入噬菌體或重組噬菌體的懸浮液，3

44、7培養(yǎng)1小時(shí)3.用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4-12小時(shí)。此時(shí)噬菌體顆粒密度達(dá)到1013-1014cell/L，大腸桿菌完全裂解4.超速離心，沉淀噬菌體5.苯酚抽提，釋放-DNA6.乙醇或異丙醇沉淀-DNA（3）大腸桿菌M13單鏈?zhǔn)删wDNA生物結(jié)構(gòu)：M13單鏈?zhǔn)删w外型呈絲狀M13單鏈?zhǔn)删w有外殼包裝蛋白和正鏈DNA組成M13單鏈?zhǔn)删w不裂解宿主細(xì)胞，但抑制其生長(zhǎng)M13單鏈?zhǔn)删wDNA全場(chǎng)6407個(gè)核苷酸M13單鏈?zhǔn)删wDNA至少有10個(gè)基因感染周期感染(+)DNA（單鏈）RFDNA（雙鏈）酶切兩條DNA鏈并成環(huán)酶切成片段包裝M13單鏈?zhǔn)删wDNA載體的構(gòu)建：在IV區(qū)和II區(qū)間插入polyli

45、nker和lacZ特點(diǎn)：. 使克隆的DNA片段以特定單鏈的形式輸出受體細(xì)胞外，在DNA定向突變種非常有用. M13重組分子篩選簡(jiǎn)便，被M13噬菌體感染的受體細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，形成渾濁斑，易于辨認(rèn)挑選。而且重組分子越大，渾濁斑的渾濁度越大. M13-DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有1.5kb動(dòng)植物病毒分為四大類：?jiǎn)捂淒NA病毒雙鏈DNA病毒單鏈RNA病毒雙鏈RNA病毒構(gòu)建考斯質(zhì)粒與噬菌粒載體的思路：將噬菌體DNA與包裝有關(guān)的序列與質(zhì)粒組裝在一起，從而最大限度地縮短載體的長(zhǎng)度，并保證重組DNA分子在體外仍被包裝成有感染力的顆粒。但由于考斯質(zhì)粒和噬菌粒不再攜帶包裝蛋白基因，因此重組DNA分子在細(xì)胞內(nèi)

46、不能形成噬菌體顆粒。（4）考斯質(zhì)粒（cosmid）考斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建：含有-DNA cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子特點(diǎn)：能像-DNA那樣進(jìn)行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制重組操作簡(jiǎn)便，篩選容易裝載量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范圍不能體內(nèi)包裝，不裂解受體細(xì)胞（5）噬菌粒（phagemid or phasmid）特點(diǎn)：一類人工構(gòu)建的含有單鏈?zhǔn)删w包裝序列、復(fù)制子以及質(zhì)粒復(fù)制子、克隆位點(diǎn)、標(biāo)記基因的特殊類型的載體功能：能像M13-DNA那樣體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞并能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制裝載量比常規(guī)M13mp系列大的多（10kb）通過(guò)克隆雙鏈DNA能獲

47、得同等長(zhǎng)度的單一單鏈DNA重組操作簡(jiǎn)單，篩選容易分類：pUC118=pUC18+M13間隔區(qū)IGpUC119=pUC19+M13間隔區(qū)IGpBluescript=pUC+f1-ori+T3啟動(dòng)子+T7啟動(dòng)子（6）人造染色體載體將細(xì)菌結(jié)合因子或酵母染色體上的復(fù)制去、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，當(dāng)大片段的外源DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，并能像天然染色體那樣，在受體細(xì)胞中穩(wěn)定的復(fù)制并遺傳。種類：細(xì)菌人造染色體（BAC）和酵母人造染色體（YAC）a.細(xì)菌人造染色體（BAC）：在大腸桿菌性因子F質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建，裝載范圍在50-300kb，主要用于克隆大型基因簇機(jī)構(gòu)和構(gòu)建動(dòng)

48、植物基因文庫(kù)b.酵母人造染色體（YAC）：裝載范圍在350-400kb含有酵母染色體的端粒序列、酵母染色體的復(fù)制子、酵母染色體的中心粒序列、酵母系統(tǒng)的選擇標(biāo)記、大腸桿菌的復(fù)制子和大腸桿菌的選擇標(biāo)記受體細(xì)胞：受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件：限制性缺陷型：外切酶和內(nèi)切酶活性缺陷重組整合缺陷型：用于基因擴(kuò)增或高效表達(dá)的受體細(xì)胞既有較高的轉(zhuǎn)化效率具有與載體選擇標(biāo)記互補(bǔ)的表型感染寄生缺陷型：防止重組細(xì)菌的擴(kuò)散和污染（1）大腸桿菌：遺傳背景清楚，載體受體系統(tǒng)完備，生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，重組子穩(wěn)定會(huì)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類繁多的內(nèi)毒素適用于外源DNA的擴(kuò)增和克隆、原核生物基因的高效表達(dá)、基因文庫(kù)的構(gòu)建、是DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因

49、工程的主要受體菌（2）枯草桿菌：遺傳背景清楚，蛋白質(zhì)分泌機(jī)制健全，生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，不產(chǎn)內(nèi)毒素遺傳欠穩(wěn)定，載體受體系統(tǒng)欠完備適用于原核生物基因的克隆、表達(dá)以及重組蛋白多肽的有效分泌（3）鏈霉菌：抗生素的主要生產(chǎn)菌，分子遺傳相對(duì)操作簡(jiǎn)單，不產(chǎn)內(nèi)毒素遺傳不穩(wěn)定，生長(zhǎng)相對(duì)緩慢主要用于抗生素生產(chǎn)菌株的改良（4）酵母菌：具有真核生物的特征，遺傳背景清楚，生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，外源基因表達(dá)系統(tǒng)完善，遺傳穩(wěn)定內(nèi)源性蛋白產(chǎn)物種類繁多且含量高適用于外源DNA的擴(kuò)增、克隆以及真核生物基因的高效表達(dá)、基因文庫(kù)的構(gòu)建、真核生物基因的表達(dá)調(diào)控的研究，是DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程的重要真核受體菌（5）昆蟲細(xì)胞（家蠶）具有真

50、核生物的特征，外源基因表達(dá)量高，繁殖相對(duì)較快，培養(yǎng)成本低廉，遺傳穩(wěn)定DNA重組操作系統(tǒng)欠完善適用于真核生物基因的高效表達(dá)（6）哺乳動(dòng)物細(xì)胞（中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞 CHO）與人的親緣關(guān)系近，分子重組表達(dá)系統(tǒng)系統(tǒng)健全，具有合適的糖基化修飾系統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)條件苛刻，生長(zhǎng)緩慢適用于哺乳動(dòng)物和人的基因表達(dá)調(diào)控研究、基因藥物的生產(chǎn)，使DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程的主要哺乳動(dòng)物受體（7）植物細(xì)胞（擬南芥菜、煙葉）農(nóng)作物的經(jīng)濟(jì)意義重大，轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞易于分化，細(xì)胞培養(yǎng)簡(jiǎn)單且成本低廉，具有光合作用遺傳操作繁瑣適用于高等植物基因表達(dá)調(diào)控的研究、基因藥物的生產(chǎn)，農(nóng)作物品質(zhì)的改良重組DNA技術(shù)的操作過(guò)程切開載體接入外源基因重組D

51、NA的擴(kuò)增轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞檢驗(yàn)DNA的體外重組（切接）：（1）同種內(nèi)切酶切出相同的粘性末端用T4-DNA連接酶連接（2）同尾酶切出相同的粘性末端用T4-DNA連接酶連接（3）不同粘性末端可經(jīng)T4-DNA pol切平或Klenow補(bǔ)平后用T4-DNA連接酶連接（4）人工粘性5突出末端可經(jīng)Klenow補(bǔ)平后用TdT加poly-G尾，再用T4-DNA連接酶連（5）人工粘性3突出末端可經(jīng)TdT加poly-C尾，再用T4-DNA連接酶或Klenow連接（6）人工粘性平頭末端可經(jīng)TdT加poly-C尾，再用T4-DNA連接酶連接，經(jīng)加熱后A-T處解鏈成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，用S1核酸酶切除（7）粘性末端的更換可經(jīng)Bam

52、HI切開后，經(jīng)Klenow補(bǔ)平，再用T4-DNA連接酶連接GGAATTCC序列（EcoR I linker）重組率=含有外源DNA的重組分子數(shù)/載體分子總數(shù)（一般為25-75%）提高重組率的方法：提高外源DNA片段與載體的分子比：5:1-10:1載體DNA分子在連接前先去除磷酸基團(tuán)（用堿性磷酸單酯酶）加裝同聚尾末端重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增（轉(zhuǎn)&增）轉(zhuǎn)化的原理與技術(shù)1.大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化;（1）Ca2+誘導(dǎo)的完整細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化： 原理：Ca2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，細(xì)菌細(xì)胞此時(shí)的狀態(tài)較感受態(tài)（適用于G-）制備：100ml菌體培

53、養(yǎng)至OD600=0.5，離心收集菌體用10ml冰冷的10mMCaCl2溶液懸浮菌體，離心收集菌體用1ml冰冷的75mMCaCl2溶液懸浮菌體冰浴放置12-24小時(shí)，備用取100L感受態(tài)細(xì)胞，加入相當(dāng)于50ng載體的重組DNA連接液，混勻冰浴放置半小時(shí)在42保溫2min快速將轉(zhuǎn)化細(xì)胞移到冰浴中放置1-2min加入1ml新鮮培養(yǎng)基，于37培養(yǎng)1小時(shí)涂在合適的固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選（2）細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化原理：運(yùn)用某些方式去除細(xì)胞壁（枯草桿菌、鏈霉菌、酵母菌、霉菌、植物細(xì)胞）制備：以鏈霉菌為例，在高滲培養(yǎng)基中（34%的蔗糖溶液，并加甘氨酸以增加細(xì)菌細(xì)胞壁對(duì)溶菌酶的敏感性）增殖細(xì)菌，并將菌體懸浮于1

54、0.3%的蔗糖等滲溶液中，與原生質(zhì)體接觸的器皿無(wú)水無(wú)去污劑。取0.2-1ml（108-109個(gè)原生質(zhì)體），加入10-20LDNA重組連接液，同時(shí)加入含有PEG1000和Ca2+的等滲溶液，混勻。原生質(zhì)體細(xì)胞壁的再生需在含有脯氨酸和微量元素的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行（3）噬菌體DNA的轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞的培養(yǎng)：將大腸桿菌在含有麥芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=0.5吸附：加入經(jīng)體外包裝好的重組噬菌體懸浮液，30保溫10min轉(zhuǎn)染裂解：加入20倍體積的新鮮培養(yǎng)基，30培養(yǎng)2小時(shí)，直至培養(yǎng)液中菌體裂解，培養(yǎng)液澄清度增加，然后涂板篩選（4）電穿孔轉(zhuǎn)化將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒或DNA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中，兩級(jí)加高壓電場(chǎng)。在強(qiáng)大電場(chǎng)的作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)?；駾NA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，該方法操作簡(jiǎn)單，對(duì)所有細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)有效，但轉(zhuǎn)化效率差別大，也可用于質(zhì)粒消除實(shí)驗(yàn)2.酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化：化學(xué)法：乙酸鋰，單鏈載體DNA和待轉(zhuǎn)化DNA，PEG原生質(zhì)體法：蝸牛酶，單鏈載體DNA和待轉(zhuǎn)化DNA，山梨醇電穿孔法：山梨醇，線性待轉(zhuǎn)化DNA，電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)化率：每微克載體DNA在最佳轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)入受體細(xì)胞的分子數(shù) 也可定義為每微克載體DNA轉(zhuǎn)化后，受體細(xì)胞接納DNA的個(gè)數(shù)即克隆數(shù) 可幫助設(shè)計(jì)DNA重組實(shí)驗(yàn)