實(shí)驗(yàn)五培養(yǎng)基的制備與滅菌

1、實(shí)驗(yàn)五 培養(yǎng)基的制備與滅菌一、目的要求1. 掌握微生物實(shí)驗(yàn)室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法。2. 掌握培養(yǎng)基的配置方法。3. 掌握干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌的操作方法。二、基本原理 正確掌握培養(yǎng)基的配制方法是從事微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)工作的重要基礎(chǔ)。由于微生物種類及代謝類型的多樣性因而用于培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基的種類也很多，它們的配方及配制方法雖各有差異。但一般培養(yǎng)基的配制程序卻大致相同例如器皿的準(zhǔn)備，培養(yǎng)基的配制與分裝，棉塞的制作，培養(yǎng)基的滅菌，斜面與平板的制作以及培養(yǎng)基的無菌檢查等基本環(huán)節(jié)大致相同。本實(shí)驗(yàn)配置牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、配方如下：牛肉膏 3.0g蛋白胨 10.0 gNaCl 5.0 g水 1000ml

2、pH 7.47.6三、實(shí)驗(yàn)材料1. 藥品：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂、1mol/LHCL、NaOH。2. 儀器及玻璃器皿：天平、高壓蒸汽滅菌鍋、移液管、試管、燒杯、量筒、三角瓶、培養(yǎng)皿等。3. 其他物品：藥匙、稱量紙、pH試紙、記號(hào)筆、棉花等。（一）玻璃器皿的洗滌和包裝1玻璃器皿的洗滌玻璃器皿在使用前必須洗刷干凈。將三角瓶、試管、培養(yǎng)皿、量筒等浸入含有洗滌劑的水中用毛刷刷洗，然后用自來水及蒸餾水沖凈。移液管先用含有洗滌劑的水浸泡，再用自來水及蒸餾水沖洗。洗刷干凈的玻璃器皿置于烘箱中烘干后備用。2滅菌前玻璃器皿的包裝（1） 培養(yǎng)皿的包扎：培養(yǎng)皿由一蓋一底組成一套，可用報(bào)紙將幾套培養(yǎng)皿包成一包

3、，或者將幾套培養(yǎng)皿直接置于特制的鐵皮圓筒內(nèi)，加蓋滅菌。包裝后的培養(yǎng)皿須經(jīng)滅菌之后才能使用。圖8-1 移液管的包扎（2） 移液管的包扎：在移液管的上端塞入一小段棉花(勿用脫脂棉)，它的作用是避免外界及口中雜菌進(jìn)入管內(nèi)，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花應(yīng)距管口約0.5cm左右，棉花自身長(zhǎng)度約11.5cm。塞棉花時(shí)可用一外圍拉直的曲別針、將少許棉花塞入管口內(nèi)。棉花要塞得松緊適宜，吹時(shí)以能通氣而又不使棉花滑下為準(zhǔn)。先將報(bào)紙裁成寬約5cm左右的長(zhǎng)紙條，然后將已塞好棉花的移液管尖端放在長(zhǎng)條報(bào)紙的一端，約成45角，折疊紙條包住尖端，用左手握住移液管身，有手將移液管壓緊在桌面上向前搓轉(zhuǎn)，以螺旋式包扎起來。

4、上端剩余紙條，折疊打結(jié)，準(zhǔn)備滅菌。（二）培養(yǎng)基的配置1) 稱量：一般可用0.01g天平稱量配制培養(yǎng)基所需的各種藥品，先按培養(yǎng)基配方計(jì)算出各成分的用量然后進(jìn)行準(zhǔn)確稱量。2) 溶解：將稱好的藥品置于一燒杯中，先加入少量水(根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要可用自來水或蒸餾水)，用玻璃棒攪動(dòng)，加熱溶解。3) 定容：待全部藥品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需體積。如某種藥品用量太少時(shí)，可預(yù)先配成較濃溶液，然后按比例吸取一定體積溶液，加入至培養(yǎng)基中。4) 調(diào)pH：一般用pH試紙測(cè)定培養(yǎng)基的pH。用剪刀剪出一小段pH試紙，然后用鑷子夾取此段pH試紙，在培養(yǎng)基中蘸一下，觀看其pH范圍，如培養(yǎng)基偏酸或偏堿時(shí)，可用1mol/L Na

5、oH或1mol/L HCl溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)pH時(shí)，應(yīng)逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部過酸或過堿，破壞培養(yǎng)基中成分。邊加邊攪拌，并不時(shí)用pH試紙測(cè)試，直至達(dá)到所需pH為止。5) 過濾：用濾紙或多層紗布過濾培養(yǎng)基。一般無特殊要求時(shí)，此步可省去。注意事項(xiàng)：（1）蛋白胨很容易吸濕、在稱取時(shí)動(dòng)作要迅速。稱藥品是嚴(yán)防藥品混雜。（2）在瓊脂熔化過程中，應(yīng)控制火力，一目培養(yǎng)基因沸騰而溢出容器。同時(shí)，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底燒焦。配置 培養(yǎng)基時(shí)，不可用銅或鐵鍋加熱溶化，以免金屬離子進(jìn)入培養(yǎng)基，影響細(xì)菌生長(zhǎng)。（三）培養(yǎng)基的分裝 根據(jù)不同需要，可將已配好培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶?jī)?nèi)，分裝時(shí)注意不要使培養(yǎng)基沾污

6、管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培養(yǎng)基沾污管口或瓶口時(shí)，可用鑷子夾一小塊脫脂棉，擦去管口或瓶口的培養(yǎng)基，并將脫脂棉棄去。1試管的分裝取一個(gè)玻璃漏斗，裝在鐵架上，漏斗下連一根橡皮管，橡皮管下端再與另一玻璃管相接，橡皮管的中部加一彈簧夾。分裝時(shí)，用左手拿住空試管中部，并將漏斗下的玻璃管嘴插入試管內(nèi)，以右手拇指及食指開放彈簧夾，中指及無名指夾佐玻璃管嘴，使培養(yǎng)基直接流入試管內(nèi)。裝入試管培養(yǎng)基的量視試管大小及需要而定，若所用試管大小為15×150 mm時(shí)，液體培養(yǎng)基可分裝至試管高度14左有為宜；如分裝固體或半固體培養(yǎng)基時(shí)，在瓊脂完全融化后，應(yīng)趁熱分裝于試管中。用于制作斜面的固體培養(yǎng)基的分

7、裝量為管高15(約34mI)，半固體培養(yǎng)基分裝量為管高的13為宜。2三角瓶的分裝圖8-2培養(yǎng)基的分裝 用于振蕩培養(yǎng)微生物時(shí)，可在250 m1三角瓶中加入50 m1的液體培養(yǎng)基；若用于制作平板培養(yǎng)基用時(shí)，可在250 m1三角瓶中加入150ml培養(yǎng)基，然后再加入3g瓊脂粉(按2計(jì)算)，滅菌時(shí)瓶中瓊脂粉同時(shí)被融化。（四）棉塞的制作及試管、三角瓶的包扎 為了培養(yǎng)好氣性微生物，需提供優(yōu)良通氣條件，同時(shí)為防止雜菌污染，則必須對(duì)通入試管或三角瓶?jī)?nèi)空氣預(yù)先進(jìn)行過濾除菌。通常方法是在試管及三角瓶口加上棉花塞等。1試管棉塞的制作制棉塞時(shí)，應(yīng)選用大小、厚薄適中的普通棉花一塊，鋪展于左手拇指和食指扣成的團(tuán)孔上，用右手

8、食指將棉花從中央壓入團(tuán)孔中制成棉塞然后直接壓入試管或三角瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折疊卷塞法制作棉塞。制作的棉塞應(yīng)緊貼管壁，不留縫隙，以防外界微生物沿縫隙侵入，棉塞不宜過緊或過松，塞好后以手提棉塞，試管不下落為準(zhǔn)。棉塞的23在試管內(nèi)，13在試管外。目前也有采用硅膠塞代替棉塞直接蓋在試管口上。將裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或硅膠塞的試管捆成一捆，外面包上一層牛皮紙。用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱及配制日期，滅菌待用。圖8-3 棉塞的制作圖8-4 正確與不正確的棉塞1.金屬塞 2正確 3、4不正確2三角瓶棉塞制作通常在棉塞外包上一層紗布，再塞在瓶口上。有時(shí)為了進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)加大通氣量，則可用8層紗布代替棉

9、塞包在瓶口上，目前也有采用硅膠塞直接蓋在瓶口上。在裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或包扎八層紗布或蓋好硅膠塞的三角瓶口上，再包上一層牛皮紙并用線繩捆好，滅菌待用。（五）培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基經(jīng)分裝包扎后，應(yīng)立即按配制方法規(guī)定的滅菌條件進(jìn)行進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。（六）斜面和平板的制作1斜面的制作將已滅菌裝有瓊脂培養(yǎng)基的試管，趁熱置于木棒或玻棒上，使成適當(dāng)斜度，凝固后即成斜面。斜面長(zhǎng)度不超過試管長(zhǎng)度l2為宜。如制作半團(tuán)體或固體深層培養(yǎng)基時(shí)，滅菌后則應(yīng)垂直放置至凝固。2平板的制作將裝在三角瓶或試管中已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基融化后，待冷至50左右傾入無菌培養(yǎng)皿中。溫度過高時(shí)，皿蓋上的冷凝水太多；溫度低于50，培養(yǎng)基易于凝固而無法制作平板。平板的制作應(yīng)在火旁進(jìn)行，左手拿培養(yǎng)皿，右手拿三角瓶的底部或試管，左手同時(shí)用小指和手掌將棉塞打開，灼燒瓶口，用左手大拇指將培養(yǎng)皿蓋打開一縫，至瓶口正好伸入，傾入1015mL培養(yǎng)基，迅速蓋好皿蓋，置于桌上，輕輕旋轉(zhuǎn)平皿，使培養(yǎng)基均勻分布于整個(gè)平皿中，冷凝后即成平板。（七）培養(yǎng)基的滅菌檢查滅菌后的培養(yǎng)基，一般需進(jìn)行無菌檢查。最好取出12管(瓶)，置于37溫箱中培養(yǎng)12天，確定無菌后方可使用。（八）無菌