食品生物技術(shù)導(dǎo)論結(jié)課論文

1、食品生物技術(shù)導(dǎo)論結(jié)課論文題作者姓名：田童童專(zhuān)業(yè)：班級(jí)：學(xué)號(hào)：2009113248【摘要】建立在DNA 雜交基礎(chǔ)上的基因探針技術(shù)是現(xiàn)分子生物學(xué)中的一種常規(guī)技術(shù)。用基西探針技術(shù)檢測(cè)食品中的有害鏇生物具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和操作簡(jiǎn)便、省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，有關(guān)非放射性基園探針、DNA生物侍感器探針及分子信標(biāo)探針等技術(shù)研究取褥的重要進(jìn)展，必將加速基因探針技術(shù)在食品擻生物檢測(cè)中的應(yīng)用。奉文對(duì)多種基哥探針的技術(shù)原理與研究應(yīng)鬲概況及最新進(jìn)展進(jìn)行了綜述討論?！娟P(guān)鍵詞】基因探針技術(shù)應(yīng)用發(fā)展近幾十年來(lái)，隨著分子遺傳學(xué)的不斷發(fā)展和基因工程技術(shù)的廣泛應(yīng)用，人們清楚地認(rèn)識(shí)到，核苷酸序列含有生命有機(jī)體構(gòu)成、維持生命必須的遺

2、傳信息。不同種生物含有不同的DNA 序列，同種生物含有相同的DNA 序列，并且這種核苷酸順序是相對(duì)穩(wěn)定的，可以用來(lái)檢測(cè)遺傳病和鑒定樣本中的微生物。所謂基因探針，是能識(shí)別特異堿基序列(基因的有標(biāo)記的一段單鏈DNA(或RNA分子，也可以說(shuō)一段與被測(cè)定的核苷酸序列(靶序列互補(bǔ)的帶標(biāo)記的單股核苷酸?；蛱结樇夹g(shù)的發(fā)展和應(yīng)用為傳染病診斷、流行病學(xué)調(diào)查、食品衛(wèi)生檢驗(yàn)、腫瘤和人類(lèi)遺傳病早期檢測(cè)等工作打開(kāi)了一個(gè)新的局面，達(dá)到了特異性強(qiáng)、敏感度高、簡(jiǎn)便和快速的目的。一、DNA探針技術(shù)研究進(jìn)展自1975年Southe1"11首次提出DNA 探針雜交技術(shù)以來(lái)，DNA探針技術(shù)在許多方面都已獲得了改進(jìn)和發(fā)展，

3、并已成為現(xiàn)代分子生物學(xué)中一種基本技術(shù)。目前所使用的DNA 探針雜交方法總體上可以分為2類(lèi)：一是異相雜交(heterogeneousassay即固相雜交技術(shù)；二是同相雜交(homogeneousassay即液相雜交技術(shù)。另外根據(jù)DNA 探針的標(biāo)記方法可分為放射性標(biāo)記探針和非放射性標(biāo)記探針。異相雜交技術(shù)1. Southern 印跡法Southern 印跡法(Southernblotting是最早的DNA 探針雜交技術(shù)，由英國(guó)分子生物學(xué)家Southern 所發(fā)明。Southern印跡法的全過(guò)程見(jiàn)圖1。首先將從待檢測(cè)樣品中提取的DNA 經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶降解后，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離。將帶有DNA 片段

4、的瓊脂糖凝膠浸泡在堿中使DNA 變性然后將變性的DNA 轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，在80下烘烤46h，使DNA 牢固地 吸附在膜上，然后與放射性標(biāo)記的DNA 探針進(jìn)行雜交數(shù)小時(shí)后，通過(guò)洗滌除去未雜交的DNA 撩針。將硝酸纖維素膜烘干后進(jìn)行放射白顯影，雜交結(jié)果即可在x 光片上顯示出來(lái)。圖1Southern 印跡法原理示意圖2.非放射性DNA 探針最早使用的DNA 探針都是用同位素標(biāo)記的。目前，放射性標(biāo)記探針仍然是許多實(shí)驗(yàn)中常用的DNA 探針，其中使用最多的是放射性標(biāo)記元素P。用來(lái)標(biāo)記的同位素的放射性強(qiáng)度越高。信噪比也就越高，結(jié)果越好。但是P 有一些其自身難以克服的缺點(diǎn)，一是壽命短，其半衰期只有13d

5、；二是操作起來(lái)比較危險(xiǎn)；三是要求有特殊的實(shí)驗(yàn)操作設(shè)備；四是放射性廢棄物的處理十分繁瑣。為此人們研究開(kāi)發(fā)了非放射性DNA 探針檢測(cè)方法。目前比較常見(jiàn)的非放射性DNA 探針檢測(cè)系統(tǒng)是通過(guò)酶促反應(yīng)將特定的底物轉(zhuǎn)變?yōu)樯镔|(zhì)或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)而達(dá)到放大信號(hào)的目的。具體操作時(shí)大多采用將生物素(bjotin標(biāo)記的核苷酸摻入到DNA 的方法制備探針操作過(guò)程(見(jiàn)圖2大致如下：(1將生物素標(biāo)記的探針雜交到目標(biāo)DNA 上去；(2加入抗生物素蛋白(avidin或鏈霉抗生物素蛋白(streptavldin；(3加入一種經(jīng)生物素標(biāo)記的酶，如過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶；(4根據(jù)不同的酶，加入不同的生色或化學(xué)發(fā)光的底物，根據(jù)顏色變

6、化或化學(xué)發(fā)光來(lái)檢測(cè)雜交結(jié)果。圖2非放射性DNA 探針檢測(cè)原理示意圖3.DNA 生物傳感器探針DNA 生物傳感器探針技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)。目前研究使用的大部分DNA 生物傳感器探針的技術(shù)原理是將DNA 探針固定在支持體的表面，通過(guò)檢測(cè)DNA 探針與特定的目標(biāo)DNA 的專(zhuān)一性雜交而產(chǎn)生的光、電等信號(hào)的變化考查DNA 探針的雜交情況。與一般的異相雜交技術(shù)相比DNA生物傳感器探針技術(shù)中省去了對(duì)DNA 探針進(jìn)行放射性同位素標(biāo)記或酶標(biāo)記的處理。而且很多DNA 生物傳感器裝置可以實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA 探針雜交過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。目前，人們已用石英晶體微天平、表面等離子體子共振等技術(shù)構(gòu)造DNA 生物傳感器lj

7、J，獲得了較好的結(jié)果。下面以金欽漢等最近報(bào)道的干擾素表面等離子體子共振(surfaceplasmon resolance，SPRDNA 生物傳感器為例說(shuō)明其工作原理及大致過(guò)程ljJ。該裝置以碘鎢燈作光源，同時(shí)檢測(cè)400800m波長(zhǎng)范圍內(nèi)反射光強(qiáng)度與入射波長(zhǎng)的關(guān)系。利用生物素親和素系統(tǒng)的相互作用將DNA 探針固定于金膜表面(見(jiàn)圖3，通過(guò)測(cè)定雜交過(guò)程中體系的共振波長(zhǎng)的變化值，考查DNA 探針的雜交情況。 圖3利用生物素一親和素系統(tǒng)固定DNA 探針的原理示意圖同相雜交1.雙探針常規(guī)技術(shù)固相雜交中探針?lè)翘禺惤Y(jié)合于支持物表面，降低了靈敏度。同相雜交技術(shù)最早由HeHer 和Mirrison 提出，該項(xiàng)技術(shù)

8、的特點(diǎn)是不髂要支持物減少了固定DNA 以及去除未雜交DNA 等操作。常規(guī)的同相雜交技術(shù)中使用了2個(gè)探針，這2個(gè)探針?lè)謩e與目標(biāo)DNA 的2個(gè)相鄰區(qū)域互補(bǔ)。第1個(gè)探針在3末端標(biāo)記第2個(gè)探針在5末端標(biāo)記，利用標(biāo)記物的光譜特性。使第一標(biāo)記物為第二標(biāo)記物的能量供體。當(dāng)探針與目標(biāo)DNA 雜交時(shí)，2個(gè)探針彼此靠近，通過(guò)光吸收或化學(xué)反應(yīng)激發(fā)供體標(biāo)記物并通過(guò)能量轉(zhuǎn)移I 起受體標(biāo)記物的激發(fā)，因此通過(guò)測(cè)定第一標(biāo)記物發(fā)射光的減少或第二標(biāo)記物發(fā)射光的增加即可定量考查DNA 探針的雜交情況。另外一種雙探針同相雜交技術(shù)所采用的2個(gè)探針的堿基互補(bǔ)，且與目標(biāo)DNA 上的同序列相對(duì)應(yīng)。將一個(gè)探針的5末端標(biāo)記熒光素，另一互補(bǔ)探針的

9、3未端標(biāo)記熒光素淬滅劑。當(dāng)無(wú)目標(biāo)DNA 時(shí)，兩探針結(jié)合，熒光素的能量轉(zhuǎn)移至淬滅劑，不產(chǎn)生熒光。存在目標(biāo)DNA 時(shí)，探針與目標(biāo)DNA 之間競(jìng)爭(zhēng)雜交，并在494496D_lll光照下產(chǎn)生熒光。熒光信號(hào)的強(qiáng)度與目標(biāo)DNA 的濃度成正比。2.分子信標(biāo)探針同相雜交一般同時(shí)采用2個(gè)標(biāo)記探針最近Tyagi 等首次建立了分子信標(biāo)探針(molecularheaconprobe，即在同一探針的5末端標(biāo)記熒光紊，3末端標(biāo)記熒光紊淬滅劑。分子信標(biāo)探針的工作原理如下：當(dāng)無(wú)目標(biāo) DNA 時(shí)，DNA 探針由于兩端堿基的互補(bǔ)配對(duì)而形成發(fā)夾 結(jié)構(gòu)，使熒光紊靠近淬滅劑，熒光紊接受的能量通過(guò)共振轉(zhuǎn)移至淬滅劑，淬滅劑吸收能量后以 熱

10、量形式散失，結(jié)果不產(chǎn)生熒光。當(dāng)有目標(biāo) DNA 存在時(shí)，由于分子標(biāo)探針的嚕撲環(huán)與目標(biāo) DNA 的堿基互補(bǔ)，因此通過(guò)與目標(biāo) DNA 的分子雜交，形成了比發(fā)夾結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定的雜交雙鏈 DNA 分 子，探針的構(gòu)型同時(shí)發(fā)生改變，使兩臂分開(kāi)，熒光紊和淬滅劑也隨之分開(kāi)，此時(shí)在紫外光下， 熒光紊產(chǎn)生熒光。Sanjay 用與嚕撲環(huán)完全互補(bǔ)且等長(zhǎng)的 DNA 與分子信標(biāo)探針雜交，發(fā)現(xiàn)當(dāng)目 標(biāo) DNA 中有一個(gè)堿基錯(cuò)配或缺失時(shí)，均不產(chǎn)生熒光，因此認(rèn)為只有完全互補(bǔ)的 DNA 才能與分子 信標(biāo)探針雜交，可見(jiàn)分子懵標(biāo)探針具有高度特異性。 二、基因探針的基礎(chǔ)理論 DNA 探針是一個(gè)含有特異核苷酸序列的帶標(biāo)記的單鏈 DNARNA

11、 片段。利用這個(gè)片段可以 檢測(cè)在臨床標(biāo)本中存在的與其互補(bǔ)的序列。DNA 雜交技術(shù)因能夠檢查與探針互補(bǔ)的特異序列而 具有高度的特異性。微生物種屬的鑒定，完全取決于事先能夠獲得一個(gè)與被鑒定微生物特異序 列互補(bǔ)的 DNA 或 RNA 片段。通常 DNA 是雙鏈，然而在適當(dāng)?shù)臈l件下(離子強(qiáng)度、DH 和溫度， 雙鏈能夠變性(分離，當(dāng)條件改變，這兩條分離的鏈又可發(fā)生復(fù)性，即互補(bǔ)序列重新結(jié)合，因 此，可采用標(biāo)記的特異 DNA 序列(DNA 探針，與臨床標(biāo)本培養(yǎng)物或臨床標(biāo)本中的 DNA 互補(bǔ)序列 (靶序列直接進(jìn)行雜交(形成雙鏈。在合適的條件下，RNA 也能與互補(bǔ) DNA 鏈雜交。 1.基因探針技術(shù)原理 基因探

12、針或 DNA 探針技術(shù)檢測(cè)微生物的依據(jù)是核酸雜交，其工作原理是 2 條堿基互補(bǔ)的 DNA 鏈在適當(dāng)條件下可以按堿基配對(duì)原則，形成雜交 DNA 分子。已知每個(gè)生物體的各種性質(zhì)和 特征都是由其所含的遺傳基因所決定的，倒如一種微生物的病原性就是由于這種微生物含有并 表達(dá)了某個(gè)或某些有害的基因而產(chǎn)生的。從理論上講，任何一個(gè)決定生物體特定生物學(xué)特性的 DNA 序列都應(yīng)該是獨(dú)特的。如果將某一種微生物的特征基因 DNA 雙鏈中的一條進(jìn)行標(biāo)記，例如 用 P 同位紊標(biāo)記，即可制成 DNA 探針。由于 DNA 分子雜交時(shí)嚴(yán)格遵守堿基配對(duì)的原則，通過(guò) 考查待測(cè)樣品與標(biāo)記性 DNA 探針能否形成雜交分子，即可判斷樣品

13、中是否含有此種微生物并 且還可以通過(guò)測(cè)定放射性強(qiáng)度考查樣品中微生物數(shù)量。 2. 基因探針的特性 構(gòu)建一個(gè) DNA 探針的設(shè)想是非常重要的，這包括要選擇一個(gè)適當(dāng)?shù)陌泻吞结樂(lè)肿?，使能獲 得最理想的結(jié)果，達(dá)到診斷的目的。敏感性高。敏感性是指探針能精確檢出 DNA 或 RNA 的最 小量，從臨床觀點(diǎn)講，是指探針能精確檢出微生物的最小數(shù)量。這可通過(guò)探針對(duì)不同濃度的微 生物的最小數(shù)量檢測(cè)出來(lái)確定。DNA 探針具有非常高的敏感性，如檢測(cè)一個(gè)單基因僅需要 104 拷貝，而且單克隆測(cè)定至少需要 1d 抗原分子；應(yīng)用腸毒素 LT(不耐熱毒素和 sT(耐熱毒 素DNA 探針，檢測(cè)腸毒素源性大腸桿菌引起的腹瀉，其敏感

14、性比 Y 一 1 腎上腺細(xì)胞和乳鼠實(shí) 驗(yàn)高 1 萬(wàn)倍；特異性強(qiáng)。在臨床上，特異性是指探針能夠從混合標(biāo)本中正確鑒定目的微生物 的能力。鑒定結(jié)果可直接由臨床標(biāo)本中獲得，或可對(duì)通過(guò)培養(yǎng)或選擇性培養(yǎng)已初步鑒定的微生 物做出確診。DNA 探針的檢測(cè)技術(shù)是建立在探針與待檢驗(yàn)核苷酸堿基序列同源性的基礎(chǔ)上，其 本身就決定了探針的特異性是很強(qiáng)的； 簡(jiǎn)便快速。為了對(duì)嚴(yán)重疾病的及時(shí)診斷和治療，在 大量臨床待檢驗(yàn)標(biāo)本集中的實(shí)驗(yàn)室，使用一種簡(jiǎn)便快速的檢驗(yàn)方法非常重要。近年不斷發(fā)展起 來(lái)的 DNA 探針診斷技術(shù)，可以很好地解決這個(gè)問(wèn)題，他如同在茅草堆里找一根針樣，可以幫助 人們迅速地查明目標(biāo)，故稱(chēng)之為“神奇”的 DNA

15、探針。 三、展望 雖然目前傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法仍然是檢測(cè)食品微生物時(shí)常用的方法，但存在檢測(cè)成本高 費(fèi)時(shí)等缺點(diǎn)，對(duì)大部分微生物來(lái)說(shuō)，用傳統(tǒng)方法檢測(cè)至少需要45 d時(shí)間。有些致病微生物甚 至無(wú)法進(jìn)行人工培養(yǎng)。利用微生物生理生化特性鑒別微生物的傳統(tǒng)方法在實(shí)際應(yīng)用時(shí)也遇到越 來(lái)越多的同題。例如利用葡糖苷酸酶活性鑒別檢測(cè)大腸桿菌是目前美國(guó)和日本等國(guó)采用的標(biāo)準(zhǔn) 方法，但已發(fā)現(xiàn)幾種大腸桿菌菌株因uidA基因突變而產(chǎn)生假陰性檢測(cè)結(jié)果 ，而樣品中存在的 其它一些微生物則因含有該酶活性，而使檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性?？梢?jiàn)研究更加快速、準(zhǔn)確的微 生物檢測(cè)方法具有十分重要的意義。DNA探針雜交與PCR聯(lián)合使用檢測(cè)食品微生物具

16、有特異性 強(qiáng)、靈敏度高及操作簡(jiǎn)便快速等特點(diǎn)將是今后食品微生物檢測(cè)技術(shù)的一個(gè)重要研究方向。目前 利用DNA探針技術(shù)檢測(cè)食品中的微生物巳取得了不少重要成果。美國(guó)的Gene-Trak 公司(Gene Trak IncFraminham，Massachusetts，USA巳開(kāi)發(fā)出檢測(cè)大腸桿菌的商品化DNA探針系 統(tǒng)。以PCR擴(kuò)增大腸桿菌的目標(biāo)DNA，在用DNA探針雜交檢測(cè)，不需要進(jìn)行微生物分離培養(yǎng)，最 快可以在1h內(nèi)完成檢測(cè)操作，檢測(cè)靈敏度為100個(gè)大腸桿菌細(xì)胞每g或每mL食品樣品。如與免疫 等其它技術(shù)聯(lián)用，還可以使檢測(cè)靈敏度大大提高。美國(guó)環(huán)保署早在1990年就已正式使用DNA探 針雜交技術(shù)檢測(cè)飲用水

17、中大腸桿菌總數(shù)。近年來(lái)隨著DNA生物傳感器探針等新技術(shù)的研究不斷 取得進(jìn)展，可望在不遠(yuǎn)的將來(lái)開(kāi)發(fā)出一種DNA探針檢測(cè)儀，用于食品微生物的快速檢測(cè)，最終 實(shí)現(xiàn)對(duì)食品產(chǎn)品的現(xiàn)場(chǎng)及在線檢測(cè)。雖然我國(guó)目前利用DNA探針技術(shù)檢測(cè)食品中微生物的研究 報(bào)道尚不多見(jiàn)，但是隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，特別是基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，各種 新的DNA探針檢測(cè)技術(shù)的出現(xiàn)，將會(huì)使該項(xiàng)技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中得到更加廣泛的應(yīng)用，也 將吸收國(guó)內(nèi)更多的研究者加入到這一領(lǐng)域中來(lái)。 【參考文獻(xiàn)】 1王翔，錢(qián)微，楊澤田. 維甲酸對(duì)喉癌細(xì)胞株 Hep2 的生長(zhǎng)及癌基因的抑制作用J. 癌癥, 1995,(03 . 2錢(qián)止維,李玉英,楊

18、新科,毛淑娟,邵幸曙,周園,史連永,段淑敏,侯云德. 子宮頸糜爛病毒病 因的探討J. 病毒學(xué)報(bào), 1987,(01 . 3胡裕文,宇文鎬,楊新科,侯云德,胡鋼,段淑敏. 我國(guó)痘苗病毒天壇株基因組左端限制酶位點(diǎn) 的變異J. 病毒學(xué)報(bào), 1987,(01 . 4吳淑華,侯云德,金奇,張鵬,張麗蘭,張智清. 人干擾素 N 端序列的變異與其抗病毒活性的 關(guān)系J. 病毒學(xué)報(bào), 1988,(02 . 5金奇,陳悅,劉絳光,黎志良,金冬雁,侯云德. 我國(guó)痘苗病毒疫苗株(天壇25kb 核苷酸序列 及其與非疫苗株(WR差異的比較J. 病毒學(xué)報(bào), 1988,(04 . 6黎志良,金奇,宇文鎬,金冬雁,侯云德. 我國(guó)痘苗病毒天壇株血凝素基因全序列