chap原核生物分子克隆的宿主和載體系統(tǒng)

1、本章節(jié)主要內(nèi)容 用于DNA復(fù)制的特殊大腸桿菌品系 DNA克隆載體 細(xì)菌DNA轉(zhuǎn)化方法 基因克隆的噬菌體系統(tǒng)第一節(jié) 應(yīng)用廣泛的細(xì)菌宿主一、E. coli K12 的生物學(xué) 革蘭氏陰性細(xì)菌 沒有核膜和染色體 一個(gè)環(huán)狀雙鏈DNA分子，有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn) 細(xì)胞中能維持質(zhì)粒DNA的復(fù)制 生活周期較短，20min分裂一次 能在發(fā)酵罐中高密度生長(zhǎng) 能在平板上培養(yǎng)出單克隆A) lac operon結(jié)構(gòu)以及表達(dá)特性二、乳糖操縱子lac Z: -gallactosidase (-半乳糖苷酶，水解乳糖形成半乳糖和葡萄糖）lac Y: lactose permease（半乳糖苷透性酶，運(yùn)送乳糖透過細(xì)菌的細(xì)胞壁)lac A

2、: transacetylase（半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶，去除由半乳糖苷透性酶吸收的有毒的硫代半乳糖苷thiogalactoside)lac I: 乳糖阻遏蛋白基因Plac :乳糖代謝結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子PI : 阻遏蛋白基因的啟動(dòng)子CAP：代謝激活蛋白結(jié)合位點(diǎn) 阻遏蛋白四聚體不僅能被別乳糖結(jié)合，也能被與別乳糖結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)如IPTG(異丙基-D-硫代半乳糖）結(jié)合，這種能高效誘導(dǎo)酶的合成，但又不被所誘導(dǎo)的酶分解的分子，稱為安慰性誘導(dǎo)物二、乳糖操縱子 利用-半乳糖苷酶及其基因 -半乳糖苷酶能分解乳糖的類似物X-gal形成藍(lán)色物質(zhì)，可用此反應(yīng)來檢測(cè)細(xì)胞中-半乳糖苷酶的活性。a-互補(bǔ)顯色反應(yīng)（藍(lán)白斑篩選）l

3、acZ -半乳糖苷酶-分解半乳糖iPO調(diào)控蛋白-肽段分解X-gal產(chǎn)物呈現(xiàn)藍(lán)色誘導(dǎo)劑IPTG-半乳糖苷酶基因lacZ突變體M15a-互補(bǔ)顯色反應(yīng)（藍(lán)白斑篩選）總結(jié)細(xì)菌菌株野生型突變體（Lac Z-基因）突變體+無外源片段插入質(zhì)粒（ Lac Z-+ Lac Z）突變體+有外源片段插入質(zhì)粒（ Lac Z-） Lac Z 蛋白有無（僅有片段）有（+片段）無（僅有片段）底物X-gal分解情況藍(lán)色菌落白色菌落藍(lán)色菌落白色菌落抗生素抗性無無有有第二節(jié) 質(zhì)粒載體一、質(zhì)粒的基本生物學(xué)特征 質(zhì)粒是染色體外穩(wěn)定遺傳的復(fù)制體，其特點(diǎn)共價(jià)閉環(huán)，雙鏈DNA分子。 大都數(shù)質(zhì)粒具有復(fù)制原點(diǎn)，能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制，不依賴寄主的細(xì)胞

4、復(fù)制周期。質(zhì)粒 質(zhì)粒通常賦予寄主一些表型特征，如抗生素抗性等。 選擇性標(biāo)記(selectable marker):由于質(zhì)粒攜帶的基因，可供實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行選擇的一些標(biāo)記。如抗性，營(yíng)養(yǎng)元素的利用等。顯性質(zhì)粒與隱性質(zhì)粒.第二節(jié) 質(zhì)粒載體二、質(zhì)粒的大小和拷貝數(shù) 相對(duì)分子量從 1kb到250kb不等。分子量較小的適合實(shí)驗(yàn)室利用 拷貝數(shù) 嚴(yán)謹(jǐn)型: :少數(shù)拷貝存在于細(xì)胞中（1幾個(gè)） 松弛型: :多個(gè)拷貝存在于細(xì)胞中（1010） 嚴(yán)謹(jǐn)型與松弛型是相對(duì)的。第二節(jié) 質(zhì)粒載體（1）、反義RNA進(jìn)行調(diào)控的機(jī)制（plasmid Col E1 ）RopdimerPRNAIIRNA IIA、在復(fù)制起點(diǎn)處， RNA II（

5、長(zhǎng)555個(gè)堿基）與質(zhì)粒DNA形成RNA-DNA復(fù)合物，RNA酶H的降解RNA II ，露出3自由羥基，質(zhì)粒復(fù)制起始。三、調(diào)節(jié)拷貝數(shù)的機(jī)理(質(zhì)粒的復(fù)制，補(bǔ)充知識(shí))B、 如果RNA I和RNA II形成雙鏈RNA螺旋，RNA酶H不能降解RNA II，復(fù)制不能進(jìn)行。RopdimerPRNAIIRNA IIC、 當(dāng)質(zhì)粒的濃度比較高的時(shí)，RNA I和RNA II形成雙鏈RNA螺旋，使質(zhì)粒的復(fù)制不能起始。D 、 當(dāng)質(zhì)粒的比較低時(shí)，RNA II與質(zhì)粒DNA形成RNA-DNA復(fù)合物，RNA酶H降解RNA II 質(zhì)粒復(fù)制起始。E、突變RNA I或去除Rop基因?qū)е沦|(zhì)粒的拷貝數(shù)增加。(2 )關(guān)鍵蛋白與重復(fù)區(qū)域結(jié)合

6、進(jìn)行調(diào)控的機(jī)理（ pS101質(zhì)粒） A 復(fù)制原點(diǎn)區(qū)域含有37拷貝的長(zhǎng)度為1722bp的重復(fù)區(qū)域，R1、R2、R3等。(2 )關(guān)鍵蛋白與重復(fù)區(qū)域結(jié)合進(jìn)行調(diào)控的機(jī)理 B、復(fù)制原點(diǎn)附近有一個(gè)編碼基因repA,編碼RepA蛋白。 RepA是雙功能的蛋白： 與復(fù)制原點(diǎn)區(qū)域的重復(fù)序列結(jié)合，起始DNA的合成；與自身基因的啟動(dòng)子結(jié)合，抑制自身的轉(zhuǎn)錄。質(zhì)?？截悢?shù)由RepA蛋白濃度和質(zhì)粒自身的濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)。 如果質(zhì)?？截悢?shù)高， RepA蛋白與自身的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄，RepA蛋白合成受阻，DNA的復(fù)制受到抑制。RepA蛋白通過結(jié)合到兩個(gè)質(zhì)粒的重復(fù)序列把它們連接起來，避免復(fù)制起始。 細(xì)胞分裂后，拷貝數(shù)和Rep

7、A蛋白的濃度降低， RepA蛋白自身合成增加，結(jié)合到重復(fù)區(qū)域起始DNA的合成 。(2 )關(guān)鍵蛋白與重復(fù)區(qū)域結(jié)合進(jìn)行調(diào)控的機(jī)理問題：在寄主復(fù)制后，質(zhì)粒是如何分配到子細(xì)胞中？ Par原件會(huì)附著在細(xì)胞膜上，隨著細(xì)胞的分裂，質(zhì)粒正確 分配到子細(xì)胞中，維持相對(duì)穩(wěn)定的質(zhì)?？截悢?shù)。第二節(jié) 質(zhì)粒載體四、相容性 在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能夠在同一寄主細(xì)胞系中穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象，稱為質(zhì)粒的不相容性，或稱為不親和性（Plasmid incom- patibility)。這樣的兩種質(zhì)粒稱為不親和質(zhì)粒第二節(jié) 質(zhì)粒載體 引起質(zhì)粒的不相容的機(jī)理 A 具有相同的復(fù)制調(diào)控機(jī)制 B 控制質(zhì)粒分配的pa

8、r元件相同,也會(huì)引起質(zhì)粒的不相容 不相容群：指那些具有不相容性的質(zhì)粒組成的一個(gè)群體，一般具有相同的復(fù)制子ColE1/pMB1五、基于大腸桿菌的克隆載體克隆載體：是一種能攜帶外源DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞中得到維持或表達(dá)的DNA分子。通常由天然的質(zhì)粒、噬菌體或動(dòng)植物的病毒改造而成。1 質(zhì)?？寺≥d體的命名法pBR322“p” 代表質(zhì)粒“BR”代表構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)室“322”區(qū)別于其他的質(zhì)粒五、基于大腸桿菌的克隆載體2、質(zhì)粒載體的一般特性（1）具有復(fù)制起點(diǎn)，在宿主細(xì)胞中能自主復(fù)制。（2）具有選擇標(biāo)記基因（3）具有若干限制酶單一位點(diǎn)（4）具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)R7268ApRR1 drd

9、19ApR CmR SmRSuR KmRpMB3ApRpSF2124ApRpBR312ApR TcRpSC101TcR12pM88pMB9TcR34ColE1566pBR313ApRTcRpBR322ApR TcR78pMB1(b)五、基于大腸桿菌的克隆載體3、第一個(gè)人工構(gòu)建的遺傳載體4、改進(jìn)了的載體（pUC載體乳糖選擇質(zhì)粒） 具有更高的拷貝數(shù) 重組體的識(shí)別只需要一步 擁有更多的多克隆單酶切位點(diǎn)五、基于大腸桿菌的克隆載體pUC載體乳糖選擇質(zhì)粒p(1)來自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)(ori)；p(2)氨卞青霉素抗性基因(AmpR)，但它的DNA核苷酸序列已經(jīng)發(fā)生了變化，不再含有原來的限制酶的單識(shí)

10、別位點(diǎn)；p(3)大腸桿菌-半乳糖苷酶(lacZ)的啟動(dòng)子及其編碼該基因氨基端-肽鏈的DNA序列,此結(jié)構(gòu)特稱為lacZ基因；p(4)多克隆位點(diǎn)(MCS)區(qū)段：位于lacZ 基因中的靠近5端，內(nèi)含十幾個(gè)單一的限制性內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn)，使含有不同粘端的目的DNA片段可方便地定向插入載體中。但它并不破壞lacZ 基因的功能。BamHIpUC182686 bpAprlacZoriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnI SmaIXbaISalIPstISphIHindIIIpGEM載體克隆DN

11、A的體轉(zhuǎn)錄p 加入了兩個(gè)短片段，這兩個(gè)片段在限制性酶切位點(diǎn)的兩側(cè)，可被T7噬菌體的RNA聚合酶或SP6 T7噬菌體的RNA聚合酶的識(shí)別p 方便了克隆DNA的體外轉(zhuǎn)錄，便于研究RNA加工，合成蛋白質(zhì)等的研究等五、基于大腸桿菌的克隆載體多拷貝裝有多克隆位點(diǎn)（MCS）正選擇顏色標(biāo)記 lacZ裝有兩個(gè)噬菌體的強(qiáng)啟動(dòng)子用于外源基因的高效表達(dá) 注意：T7和SP6啟動(dòng)子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合酶所識(shí)別，因此相應(yīng)的受體菌必須表達(dá)噬菌體RNA聚合酶，如E.coli BL21（DE3） 等2743 bpMCSlacZPT7oriAprpGEM-3ZPSP6pGEM-3Z：第三節(jié) 噬菌體克隆載體 1

12、噬菌體的基本特征 裂解周期 溶源 2 溶源性噬菌體 原噬菌體 溶源菌 噬菌體，M13 噬菌體顆粒中的DNA是一線性雙鏈DNA分子，長(zhǎng)48 502bp。 基因簇集排列 線噬菌體上有些基因可被取代而不影響其生活周期 線性噬菌體兩端各有12個(gè)堿基的5凸出黏性末端是互補(bǔ)的,該互補(bǔ)序列相互作用形成cos位點(diǎn)。 作用：進(jìn)入細(xì)胞的DNA通過兩端的黏性末端環(huán)化。 作為內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)一、 噬菌體的生物學(xué)1、對(duì)野生噬菌體的改進(jìn) A、 刪除多余的限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)。 B 、切除一些非必需序列，增加載體的容量。 C、設(shè)計(jì)陽性選擇重組子的方法。 D、設(shè)計(jì)可方便地通過轉(zhuǎn)錄作用制備外源插入DNA的RNA探針的載體 E、發(fā)

13、展可以使插入的真核cDNA與半乳糖苷酶形成融合蛋白的載體。 二、基于噬菌體的克隆載體2 、噬菌體基因組可刪除的部分不影響生存能力 噬菌體基因組中可以刪除的序列與噬菌體進(jìn)入從裂解狀態(tài)進(jìn)入溶源狀態(tài)以及從溶源狀態(tài)進(jìn)入裂解狀態(tài)有關(guān)，即與噬菌體整合和脫離大腸桿菌的染色體相關(guān) 刪除了這部分序列的噬菌體只能進(jìn)行裂解循環(huán)二、基于噬菌體的克隆載體3、噬菌體載體可分為q 插入型載體：只具有一個(gè)可供外源DNA插入的克隆位點(diǎn)。失去了非必需區(qū)切點(diǎn)又位于報(bào)告基因上，故在切開DNA并插入外源基因后，報(bào)告基因失活，即可依此進(jìn)行重組體的篩選可插入長(zhǎng)度為10kb的外源DNA 二、基于噬菌體的克隆載體兩種報(bào)告基因的插入型載體 cI

14、基因內(nèi)保留HindIII和EcoRI單酶切位點(diǎn)，當(dāng)有外源DNA在這酶切位點(diǎn)插入時(shí)，使cI基因失活，感染hf-大腸桿菌后可形成空斑（ 如gt10） 。 在噬菌體DNA插入的lacZ基因末端設(shè)有單一的EcoR酶切位點(diǎn)。在此處插入外源基因，可表達(dá)-半乳糖苷酶的融合蛋白，利用特異性抗體或DNA測(cè)序方法可篩選重組DNA。這類載體適宜構(gòu)建cDNA文庫(如ZAPII)二、基于噬菌體的克隆載體q替換型載體：具有成對(duì)的克隆位點(diǎn)，在這兩個(gè)位點(diǎn)之間的 DNA區(qū)段可以被外源插入的DNA所取代。可克隆的片段大，最大可達(dá)23kb23kb，而質(zhì)粒最大僅10 kb10 kb左右；DNADNA的長(zhǎng)度大于野生型噬菌體DNADNA

15、長(zhǎng)度的7575而不超過其105105時(shí)，才能被包裝成噬菌體顆粒，當(dāng)DNADNA的長(zhǎng)度短于野生型的75%75%或超過105%105%時(shí)，噬菌體的活性就急劇下降，因此要求載體DNADNA和外源DNADNA長(zhǎng)度之和在393953kb53kb之間。二、基于噬菌體的克隆載體三 克隆載體的體外包裝體外包裝： 模擬噬菌體DNA分子在宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的包裝過程，將重組的噬菌體DNA分子包裝成成熟的具有感染能力的噬菌體顆粒必要性： 噬菌體重組分子直接感染大腸桿菌的效率較低，而在試驗(yàn)過程中，因內(nèi)切酶的處理，DNA的連接產(chǎn)生的有效分子等原因，使得轉(zhuǎn)染效率更低三 克隆載體的體外包裝三 克隆載體的體外包裝 單菌株體系 缺

16、陷型噬菌體在cos位點(diǎn)有突變， 噬菌體的DNA復(fù)制不能完成，但可形成外殼蛋白，可以制備包裝所必須的各種外殼蛋白。三 克隆載體的體外包裝3 雙菌株的體外包裝原理A 噬菌體的頭部和尾部的包裝是分開進(jìn)行B 頭部基因發(fā)生突變的噬菌體只能形成尾部C 尾部基因發(fā)生突變的噬菌體只能形成頭部D 兩種不同突變的噬菌體混合起來，能在體外裝備形成有活性的噬菌體顆粒Lyse, mixAdd ATP and concatemerized DNAMature phage particles重組噬菌體的鑒別 lacZ基因功能選擇方法類似于質(zhì)粒中的藍(lán)白斑篩選 cI基因功能選擇法cI 插入失活的噬菌斑是“清澈”的，而野生型正常

17、的噬菌斑是“渾濁”的5.4 重組噬菌體的鑒別Spi-（sensitive to P2 inhibition）正選擇 A 野生型噬菌體，不能在P2噬菌體溶源性細(xì)菌中生長(zhǎng)，為Spi+，即對(duì)在P2噬菌體的抑制成敏感反應(yīng)。B 噬菌體載體中的red和gam區(qū)段被外源片段取代后， 噬菌體就能在P2噬菌體溶源性細(xì)菌中生長(zhǎng)。5.4 重組噬菌體的鑒別基于基因組大小的篩選 包裝體系只能將大小3752Kb的DNA分子插入到噬菌體的頭部結(jié)構(gòu)中 插入型載體（第六章）通常刪除了噬菌體的中非必須的基因部分，因此中有重組后介于3752Kb的分子才能被包裝。二、M13 噬菌體克隆載體M13噬菌一般特點(diǎn) 僅6407 個(gè)核苷酸 有

18、雙鏈環(huán)狀，單鏈環(huán)狀存在形式 基因組采取滾環(huán)復(fù)制形式 適合做載體 具有比噬菌體更大的裝載能力 單鏈形式在某些實(shí)驗(yàn)過程很重要，如測(cè)序、體外突變等第四節(jié) 外源DNA和載體的連接1、互補(bǔ)黏性末端之間的鏈接同一限制酶切割位點(diǎn)連接： 由同一限制性核酸內(nèi)切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。只要酶切割DNA后產(chǎn)生單鏈突出（5突出及3突出）的粘性末端，同時(shí)酶切位點(diǎn)附近的DNA序列不影響連接，那么，當(dāng)這樣的兩個(gè)DNA片段一起退火時(shí)，粘性末端單鏈間進(jìn)行堿基配對(duì)，然后在DNA連接酶催化作用下形成共價(jià)結(jié)合的重組DNA分子。一、外源DNA和載體連接的方法一、外源 DNA 和載體的連接方法2、平末端之間的鏈接DNA

19、連接酶可催化相同和不同限制性核酸內(nèi)切酶切割的平端之間的連接。原則上講，限制酶切割DNA后產(chǎn)生的平端也屬配伍末端，可彼此相互連接；若產(chǎn)生的粘性末端經(jīng)特殊酶處理，使單鏈突出處被補(bǔ)齊或削平，變?yōu)槠蕉耍部蓪?shí)行平端連接。操作方法同黏性末端之間的鏈接，增加酶的用量。3 、將粘末端加到平末端分子上 DNA 接頭 同聚物加尾產(chǎn)生粘性末端 PCR產(chǎn)物的克隆連接（特例）一、外源 DNA 和載體的連接方法DNA 接頭 同聚物加尾連接是利用同聚物序列，如多聚A與多聚T之間的退火作用完成連接。在末端轉(zhuǎn)移酶(terminal transferase)作用下，在DNA片段端制造出粘性末端，而后進(jìn)行粘性末端連接。這是一種人

20、工提高連接效率的方法，也屬于粘性末端連接的一種特殊形式。同聚物加尾產(chǎn)生粘性末端dATPdTTPPCR產(chǎn)物的克隆連接 PCR反應(yīng)中所使用的聚合酶具有末端轉(zhuǎn)移酶的活性，通常在3末端加上A。 經(jīng)特使處理的載體具有3 突出T堿基，通過T/A互補(bǔ)，進(jìn)行克隆。屬于黏性末端的連接，該克隆方式特稱TA克隆。從生物秀網(wǎng)站下載二、定向克隆 將外源DNA按正確的方向插入載體。通常采用不同的內(nèi)切酶分別處理載體和片段，使線性載體和片段的兩段帶有不同的粘性末端，通過載體與片段之間的連接，實(shí)現(xiàn)定向克隆。第五節(jié) ：一個(gè)基因在E. coli 中的調(diào)節(jié)表達(dá)一、研究目的 研究擬南芥中鈣結(jié)合蛋白肌鈣網(wǎng)蛋白在花中的功能。 需制備該蛋白

21、的抗體二、研究基礎(chǔ) 獲得了基因的cDNA克隆 獲得了原核表達(dá)載體和細(xì)菌菌株 獲得了純化蛋白質(zhì)用的金屬螯合層析柱 具備免疫家兔的實(shí)驗(yàn)技術(shù)三、研究策略 1、構(gòu)建原核表達(dá)載體 2、純化蛋白 3、免疫家兔 4、檢測(cè)該蛋白質(zhì)在花中的表達(dá)MCS2、原核表達(dá)載體pET系統(tǒng)能夠表達(dá)外源基因的原理（a）分別利用 T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄目標(biāo)基因，用大腸桿菌自身的系統(tǒng)翻譯合成目標(biāo)蛋白質(zhì)。（b）需要大腸桿菌能表達(dá)T7 RNA聚合酶（c）加入誘導(dǎo)物（IPTG，異丙基-D-硫代半乳糖苷 ）同時(shí)開啟T7 RNA聚合酶和目標(biāo)基因的表達(dá)。（d）對(duì)SD序列與AUG之間的距離進(jìn)行了優(yōu)化lac OT7 gene 1lac promo

22、terE.Coli, RNA 聚合酶lac I genelac I repressorIPTG 誘導(dǎo)Host cellT7 RNA 聚合酶lac OT7 promotertarget genelac I genelac I repressorpETT7 RNA polimeraseIPTG induction克隆到pET載體中的基因表達(dá)調(diào)控策略lac OT7 gene 1lac promoterE.Coli, RNA polimeraselac I genelac I repressorIPTG inductionHost cellT7 RNA polimeraselac OT7 promot

23、ertarget genelac I genelac I repressorpETT7 RNA polimeraseIPTG inductionpLysS Or ET7 lysozme geneT7 lysozmeinactive克隆到pET載體中的基因表達(dá)調(diào)控策略-控制T7 RNA聚合酶本底表達(dá)lac OT7 gene 1lac promoterE.Coli, RNA polimeraselac I genelac I repressorIPTG inductionHost cellT7 RNA polimeraselac OT7 promotertarget genelac I genelac I repressorpETT7 RNA polimeraseIPTG inductionpLysS Or ET7 lysozme geneT7 lysozmeinactive克隆到pET載體中的基因表達(dá)調(diào)控策略-控制T7 RNA聚合酶本底表達(dá)(1)(2)(3)ABSampleWashingElutionXBLigand containing NiXBAAu誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)后，用裂解液將細(xì)菌裂解，釋放蛋白。u將裂解液過一個(gè)鎳柱u將污染的蛋白洗滌后，將目標(biāo)蛋白洗脫第二節(jié) 質(zhì)粒載體四、相容性 在沒有