維生素E檢測(cè)方法研究

1、液相色譜法檢測(cè)的生育酚方法報(bào)告一、 生育酚簡(jiǎn)介又稱(chēng)維生素E，是一種脂溶性維生素，是最主要的抗氧化劑之一。溶于脂肪和乙醇等有機(jī)溶劑中，不溶于水，對(duì)熱、酸穩(wěn)定，對(duì)堿不穩(wěn)定，對(duì)氧敏感，對(duì)熱不敏感。維生素E為微帶粘性的淡黃色油狀物，在無(wú)氧條件下較為穩(wěn)定，甚至加熱至200以上也不被破壞。但在空氣中維生素E極易被氧化，顏色變深。維生素E易于氧化，故能保護(hù)其他易被氧化的物質(zhì)（如維生素A及不飽和脂肪酸等）不被破壞。維生素E的化學(xué)名稱(chēng)為(1)-2、5、7、8-四甲基 2-(-4、8、12-三甲基十三烷基)-6-苯并二氫吡喃醇醋酸酯，分子式為C31H52O3，結(jié)構(gòu)式為：根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為生育酚及生育三烯酚兩類(lèi)。

2、生育酚主要有四種衍生物，按甲基位置分為、和四種。其中，-生育酚：R1，R2=CH3；-生育酚：R1=H，R2=CH3；-生育酚：R1=CH3，R2=H；-生育酚：R1，R2=H。維生素E以-生育酚生理活性最高，-及-生育酚僅為-生育酚的40%和8%。二、 色譜方法的選擇現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中維生素E的檢測(cè)僅有兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)食品中維生素A和維生素E的測(cè)定（GB/T 5009.82-2003）和食用植物油中維生素E組分和含量的測(cè)定 高效液相色譜法（NY/T 1598-2008），其中前者介紹了液相色譜法和比色法兩種方法。目前有的文獻(xiàn)1中指出，氣相色譜法雖能正確定量維生素E，但是對(duì)不同型分離困難，為了使-維生素E與-

3、維生素E及-維生素E分離，預(yù)先要將試樣進(jìn)行三甲基硅烷化或酯化，同時(shí)膽同醇等硬脂類(lèi)對(duì)測(cè)定有干擾。另外，如果前期樣品處理不好，很容易對(duì)毛細(xì)管柱造成污染。故建議使用液相色譜法。三、 內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法的選擇1、 兩種方法的區(qū)別：內(nèi)標(biāo)法外標(biāo)法內(nèi)標(biāo)物與待測(cè)物相似，且均出峰不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)需要，可兩點(diǎn)需要，需多點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)定量準(zhǔn)確操作簡(jiǎn)便缺點(diǎn)不容易選擇內(nèi)標(biāo)物；操作精度高與標(biāo)準(zhǔn)品嚴(yán)格相同的操作條件2、 在食品中維生素A和維生素E的測(cè)定中采用了內(nèi)標(biāo)法，內(nèi)標(biāo)物為苯并a芘，另外文獻(xiàn)中也有使用正三十二烷及十六酸十六醇酯等。食用植物油中維生素E組分和含量的測(cè)定 高效液相色譜法中使用的外標(biāo)法，國(guó)內(nèi)大多數(shù)檢測(cè)維生素E的文獻(xiàn)中都用的是

4、外標(biāo)法。根據(jù)我部門(mén)的實(shí)際情況，維生素E的檢測(cè)一般用于豆油脂肪酸的日常檢測(cè)和協(xié)助營(yíng)銷(xiāo)部門(mén)的發(fā)貨定價(jià)，故精度要求不是非常高，而內(nèi)標(biāo)法每次檢測(cè)需用到內(nèi)標(biāo)物，而內(nèi)標(biāo)物的成本通常偏高，因此，外標(biāo)法可以滿(mǎn)足我部門(mén)日常檢測(cè)的需求。3、 外標(biāo)曲線(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道2，隨著甲醇濃度的升高，-維生素E峰形越尖銳，100甲醇和98：2流動(dòng)相得到譜圖相似，并能與其它雜質(zhì)峰很好地分離。這是因?yàn)閷?duì)反相柱來(lái)說(shuō)，甲醇是強(qiáng)洗脫劑，其含量越高，流動(dòng)相的極性越小，洗脫能力越強(qiáng)，-維生素E越易被洗脫，而其它雜質(zhì)卻被保留；隨著水含量的增加，流動(dòng)相極性增強(qiáng)，對(duì)-維生素E洗脫能力減弱。綜合考慮，最終選擇98：2的甲醇為流動(dòng)相。柱溫對(duì)保留時(shí)間是有影

5、響的，柱溫升高，保留時(shí)間會(huì)減小，對(duì)定性造成影響，因此必須設(shè)定柱溫。紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)一般在290-296nm之間選擇。有文獻(xiàn)3稱(chēng)，-維生素E的峰被-維生素E峰掩蓋，而通過(guò)檢測(cè)，也證實(shí)是這樣的。因此，利用現(xiàn)有的-、-、-維生素E標(biāo)準(zhǔn)品配制成六個(gè)濃度點(diǎn)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，各曲線(xiàn)擬合度均在0.9999以上。（1） 色譜條件流動(dòng)相：甲醇+水（V/V）=98+2，混勻，臨用前脫氣。柱溫：30。色譜柱：Eclipse XDB-C18反相柱，4.6150mm。檢測(cè)波長(zhǎng)：294nm。進(jìn)樣量：10L（2） -維生素E濃度/ug/mL峰面積/mAu*S4.212.231052161.48065105309.7051121

6、0630.572334201249.7966310503149.92212r=0.99999（3） -維生素E濃度/ug/mL峰面積/mAu*S314.157481569.0066030141.2231175333.88959150718.1474015007465.86084r=0.99998（4） -維生素E濃度/ug/mL峰面積/mAu*S4.15216.0931510.3841.4339641.52157.91699103.8405.65256207.6819.8408210384165.38525r=0.99999四、 樣品前期處理的選擇目前，國(guó)內(nèi)和AOCS方法中對(duì)維生素E檢測(cè)的前期

7、處理均用到皂化法，上述兩標(biāo)準(zhǔn)中的方法也均為皂化法。但已有一些文獻(xiàn)2中出現(xiàn)了超聲波法，該方法簡(jiǎn)單易行，節(jié)省溶劑，減少損失。我們對(duì)兩種方法進(jìn)行幾組對(duì)比實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，超聲波提取法幾乎對(duì)維生素E沒(méi)有損失，而皂化法由于步驟繁多，且維生素E活性高，出現(xiàn)了一定量的損失。本實(shí)驗(yàn)中，超聲波法：取1g樣品于50mL容量瓶中，加30mL左右無(wú)水乙醇，超聲震蕩15min后，稀釋至刻度，注入10L于液相色譜分析。計(jì)算公式為：皂化法：取1g樣品于皂化瓶中，加入30mL無(wú)水乙醇溶解，加入5mL抗壞血酸（100g/L），加入20mLKOH溶液（1g/L），加熱回流30min后，冷卻，倒入分液漏斗，先后用50mL蒸餾水50m

8、L乙醚洗皂化瓶，并入分液漏斗，洗三次，收集乙醚相過(guò)無(wú)水硫酸鈉于100mL容量瓶中，稀釋至刻度，取10mL與燒瓶中，于烘箱中蒸干乙醚，用1mL無(wú)水乙醇溶解，注入10L于液相色譜。計(jì)算公式為：其中，C為色譜圖中直接讀出的含量。五、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論表1 植物油脂肪酸中維生素E檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比樣品方法豆油脂肪酸豆油脂肪酸1#2#-VE-VE-VE-VE-VE-VE超聲波法保留時(shí)間/min9.4477.9346.6719.4797.9566.687含量/ug/mL176.21766.19531.30186.94854.59603.45VE總含量/%7.37%8.22%皂化法保留時(shí)間/min9.4547.8

9、996.6679.5077.9376.692含量/ug/mL714.253053.312023.03837.303468.482507.60VE總含量/%5.79%6.81%棕櫚油脂肪酸棕櫚油脂肪酸1#2#-VE-VE-VE-VE-VE-VE超聲波法保留時(shí)間/min9.503-6.7599.599-6.817含量/ug/mL84.98-102.98121.34-174.53VE總含量/%0.940%1.48%皂化法保留時(shí)間/min9.7638.0066.9059.6197.9026.836含量/ug/mL200.5220.60213.89474.7915.97548.71VE總含量/%0.43

10、5%1.04%保留時(shí)間的差別：同一色譜條件下，皂化法的保留時(shí)間基本上比超聲波法的保留時(shí)間稍長(zhǎng)，但差別不大，可以看做基本相同。維生素E含量的差別：兩方法檢測(cè)所得VE含量差別較大。對(duì)豆油脂肪酸來(lái)說(shuō)，這是我們需要日常檢測(cè)的樣品，也涉及到我公司銷(xiāo)售定價(jià)的檢測(cè)項(xiàng)目，由于皂化法前處理經(jīng)過(guò)加熱、洗滌、蒸干等多個(gè)步驟，其損失量在15-25%范圍內(nèi)，而客戶(hù)與國(guó)標(biāo)均采用了此方法，故在日常維生素E的檢測(cè)中，為了保持一致，建議使用皂化法處理樣品，進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于棕櫚油脂肪酸，其出峰多而雜，保留時(shí)間普遍增大，超聲波法檢測(cè)出的結(jié)果也偏低，可以初步判定其本身維生素E含量較低。值得注意的是，超聲波法可檢測(cè)出棕櫚油脂肪酸中-VE

11、的含量，而皂化法并未檢測(cè)出，這也證明了超聲波法比皂化法損失小的優(yōu)點(diǎn)。對(duì)于低維生素E含量的樣品，影響波動(dòng)增大，皂化法檢測(cè)含量損失在30-50%。見(jiàn)表1。對(duì)于大豆油和棕櫚油，保留時(shí)間比脂肪酸大，峰形多而雜。其維生素E含量很低，皂化法比超聲波法損失均超過(guò)50%。見(jiàn)表2。另外，處理棕櫚油樣品時(shí)，由于棕櫚油不易溶于無(wú)水乙醇，因此處理上極為困難，這也是需要改進(jìn)溶劑的一個(gè)方面。表2 植物油中維生素E檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比樣品方法大豆原油一級(jí)豆油-VE-VE-VE-VE-VE-VE超聲波法保留時(shí)間/min9.8248.2466.8959.7358.1706.833含量/ug/mL4.6919.477.354.6317

12、.656.53VE總含量/%0.158%0.144%皂化法保留時(shí)間/min9.8848.2956.9369.7208.1656.832含量/ug/mL11.4146.0319.418.0434.6614.60VE總含量/%0.0769%0.0573%24度棕櫚油-VE-VE-VE超聲波法保留時(shí)間/min9.8278.041-含量/ug/mL5.733.15-VE總含量/%0.0444%皂化法保留時(shí)間/min9.8588.063-含量/ug/mL11.024.02-VE總含量/%0.0150%六、 關(guān)于回收率實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)對(duì)-、-、-維生素E分別進(jìn)行了回收率的空白實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證皂化法的回收率。即取已知含量的三種維生素E分別進(jìn)行皂化法處理，得到回收率分別為：71.3%、11.8%、58.7%。這也說(shuō)明了皂化法存在著一定的損失。-維生素E有待再次驗(yàn)證。七、 結(jié)論對(duì)于維生素E檢測(cè)方法來(lái)說(shuō)，超聲波法處理方便，檢測(cè)快速，損失小，是一種理想的檢測(cè)維生素E含量的方法。但對(duì)于日常檢測(cè)及銷(xiāo)售上，為了與客戶(hù)及第三方檢測(cè)一致，避免糾紛，我們建議采用國(guó)標(biāo)中的皂化法來(lái)進(jìn)行檢