大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化ppt課件

1、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化制備及轉(zhuǎn)化 掌握制備和保管大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的掌握制備和保管大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的方法方法 掌握轉(zhuǎn)化的方法技術(shù)掌握轉(zhuǎn)化的方法技術(shù) 了解轉(zhuǎn)化過程中各要素對轉(zhuǎn)化率的影響了解轉(zhuǎn)化過程中各要素對轉(zhuǎn)化率的影響定義感受態(tài)Competence)：細(xì)菌處于容易吸收外源DNA 的形狀轉(zhuǎn)化transformation)：異源DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程致敏過程: 用理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)的操作 在生長周期的任何時(shí)辰自動產(chǎn)生感受態(tài)；在生長周期的任何時(shí)辰自動產(chǎn)生感受態(tài)；e.g. 枯草桿菌枯草桿菌 在生長周期的特定時(shí)辰產(chǎn)生感受態(tài)；在生長周期的特定時(shí)辰產(chǎn)生感受態(tài)；e.g .

2、大腸桿菌大腸桿菌細(xì)菌產(chǎn)生感受態(tài)的類型細(xì)菌產(chǎn)生感受態(tài)的類型u受體菌：受體菌： u E.Coli DH5 E.Coli DH5：無：無ApAp抗性抗性u外源質(zhì)粒外源質(zhì)粒u Ampr Ampr抗性基因編碼一種周質(zhì)酶抗性基因編碼一種周質(zhì)酶-內(nèi)酰內(nèi)酰胺酶可特異地切割胺酶可特異地切割A(yù)mpAmp的的-內(nèi)酰胺環(huán)，從內(nèi)酰胺環(huán)，從而使其失去殺菌才干而使其失去殺菌才干 u選擇選擇: :u 如進(jìn)展藍(lán)白斑挑選時(shí)可選用如進(jìn)展藍(lán)白斑挑選時(shí)可選用DH5 DH5 、JM109 JM109 、 TG1 TG1 ；u 用用T7T7啟動子進(jìn)展原核表達(dá)時(shí)可選用啟動子進(jìn)展原核表達(dá)時(shí)可選用BL21(DE3)BL21(DE3)； 原生質(zhì)體

3、法 電擊法 特殊試劑誘導(dǎo)法：CaCl2誘導(dǎo)法u +質(zhì)粒DNA420C熱擊復(fù)蘇Amp+細(xì)菌處于00C,CaCl2低滲溶液中,菌細(xì)胞膨脹成球形,外源DNA構(gòu)成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸鹽混合物黏附于細(xì)胞外表,經(jīng)短時(shí)間420C熱擊處置,促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物。將細(xì)菌放在非選擇性培育基上保溫一段時(shí)間，使抗氨芐青霉素的表型表達(dá)后再轉(zhuǎn)到含氨芐青霉素的選擇性培育基上，長出來的菌即為轉(zhuǎn)入了外源基因的菌株。公式：公式：轉(zhuǎn)化子數(shù)轉(zhuǎn)化子數(shù)/ug DNA = 單菌落數(shù)單菌落數(shù) 質(zhì)粒濃度質(zhì)粒濃度(ng/ul) X 1uL2.5ng/uL X10 x1000p細(xì)菌的生長形狀：大腸桿菌在對數(shù)中期易產(chǎn)生感受態(tài)細(xì)菌的生長形狀：

4、大腸桿菌在對數(shù)中期易產(chǎn)生感受態(tài)p OD OD值：值：0.30.30.5 (5X1070.5 (5X107個(gè)個(gè)/ml)/ml)p試劑的質(zhì)量：試劑的質(zhì)量：p 化合物及無機(jī)離子：化合物及無機(jī)離子：Rb+Rb+、Mn+Mn+、二甲亞砜等、二甲亞砜等p質(zhì)粒：大小、構(gòu)型質(zhì)粒：大小、構(gòu)型p外源外源DNADNA質(zhì)粒與細(xì)胞的比例：質(zhì)粒與細(xì)胞的比例：p器皿的干凈度器皿的干凈度p污染污染盡量一切翻開器皿蓋的操作都在超凈臺中進(jìn)展盡量一切翻開器皿蓋的操作都在超凈臺中進(jìn)展感受態(tài)細(xì)胞的保管 制備好的感受態(tài)細(xì)胞每100uL分裝一支EP管 悄然混勻-可以用tip頭悄然攪勻. 4保管不加甘油，可保管一周； 加30%甘油，-20

5、保管，可保管一月； 加30%甘油， 80 保管，可保管六月；實(shí)驗(yàn)器材 搖床 分光光度計(jì) 冷凍離心機(jī) 超凈任務(wù)臺 恒溫水浴 涂布棒 恒溫培育箱實(shí)驗(yàn)試劑 LB液體培育基 LB固體培育基 氨芐青霉素 0.1 M CaCl2 30% 甘油實(shí)驗(yàn)流程1、接單菌落到5ml LB液體培育基中，370C、190rpm振蕩培育過夜2、5%250 ul) 菌液接種到含5 ml LB的試管中， 370C振蕩培育1-2小時(shí)，至OD600 0.4-0.5 已完成3、將1.5mL菌液轉(zhuǎn)移到離心管中4、離心 5000rpm ，40C，5min5、倒出培育液6. 用冰預(yù)冷的用冰預(yù)冷的1mL0.1M的的CaCl2 處置、懸浮細(xì)處

6、置、懸浮細(xì) 胞，胞，7 . 冰上冰上20min8. (取取1.5mL)5000rpm離心離心5min，傾去上清，傾去上清9. 100uL CaCl2悄然懸浮，冰浴悄然懸浮，冰浴大腸桿菌大腸桿菌DH5感受態(tài)的制備感受態(tài)的制備實(shí)驗(yàn)流程大腸桿菌DH5受態(tài)的制備-1 ml-20 min實(shí)驗(yàn)流程 1.1.實(shí)驗(yàn)樣品實(shí)驗(yàn)樣品: : 汲取汲取50uL 50uL 感受態(tài)細(xì)胞到另一個(gè)感受態(tài)細(xì)胞到另一個(gè)1.5 ml EP1.5 ml EP管中，參與管中，參與1uL 1uL 質(zhì)粒槍頭悄然混質(zhì)粒槍頭悄然混勻，勿吹勻，勿吹 打打 2. 2.陰性對照：陰性對照： DH5 DH5 感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞50uL50uL 冰浴冰

7、浴20mins20mins 42 9042 90秒靜置，勿搖動秒靜置，勿搖動 迅速放到冰上迅速放到冰上, ,冰浴冰浴2mins2mins 參與參與950uL LB950uL LB培育基，標(biāo)明組號，培育基，標(biāo)明組號，37 37 200rpm 200rpm 搖床培育搖床培育 45 mins 45 mins 制備制備LB瓊脂平板瓊脂平板(已完成已完成) 含含Ap的的LB固體培育基倒平板固體培育基倒平板, 每組每組5個(gè)個(gè). 編號編號1,2,3,4,5 不含不含Ap的的LB固體培育基平板。編號固體培育基平板。編號6涂布涂布 樣品樣品(轉(zhuǎn)化培育后的菌液轉(zhuǎn)化培育后的菌液),涂布于涂布于1,2,3,4,5號平板，各號平板，各100uL。 陰性對照陰性對照(轉(zhuǎn)化培育后的菌液轉(zhuǎn)化培育后的菌液) 100uL ：涂布于：涂布于6號平板。號平板。 靜置靜置15mins, 倒置平板倒置平板37 培育過夜培育過夜 涂布棒的運(yùn)用 酒精燈的運(yùn)用 運(yùn)用前，浸入75%酒精中； 在酒精燈上引燃涂布棒上的酒精不要燒到手； 等酒精燒完后，讓涂布棒在空氣中冷卻； 涂布均勻； 將涂布棒重新除菌以備下一次運(yùn)用。察看結(jié)果明天上午察看結(jié)果明天上午 預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1-4號平板上出假設(shè)干單菌落，闡明？ 5號平板上沒有可見菌落，闡明？ 6號平板上出現(xiàn)大量菌落，闡明？ 計(jì)數(shù)單菌落,計(jì)算轉(zhuǎn)化率.p 如陰性對照中長出菌，能夠緣由