健康測定教學

1、第十七章第十七章轉基因種子特定特性測定轉基因種子特定特性測定 隨著生物技術產品隨著生物技術產品( (轉基因品種轉基因品種) )的問世，植的問世，植物轉基因品種鑒定問題日益突出。物轉基因品種鑒定問題日益突出。植物轉基因品植物轉基因品種的不斷育成和商業(yè)化應用，在種子質量檢測中種的不斷育成和商業(yè)化應用，在種子質量檢測中出現(xiàn)了新的挑戰(zhàn)。這就是植物轉基因品種種子的出現(xiàn)了新的挑戰(zhàn)。這就是植物轉基因品種種子的鑒定問題。鑒定問題。一、植物轉基因品種鑒定的重要性一、植物轉基因品種鑒定的重要性二、轉基因種子特定特性測定的目的二、轉基因種子特定特性測定的目的一是檢測一是檢測（DetectionDetection），

2、確定種子批中是否含），確定種子批中是否含有有GMOs GMOs ；二是鑒定二是鑒定（IdentificationIdentification），如果檢測的結果是），如果檢測的結果是陽性的，需要通過鑒定知道陽性的，需要通過鑒定知道GMOsGMOs是否是經授是否是經授權的，如果未經授權，種子批將被拒絕。如果權的，如果未經授權，種子批將被拒絕。如果是經授權，則進一步定量分析；是經授權，則進一步定量分析；三是定量三是定量（QuantificationQuantification），即通過定量分析，），即通過定量分析，確定種子批中的確定種子批中的GMOGMO是否超過是否超過極限值極限值。二、轉基因種子特

3、定特性測定的目的二、轉基因種子特定特性測定的目的 關于關于極限值極限值，歐盟，歐盟20032003年規(guī)定常規(guī)種子年規(guī)定常規(guī)種子批中含有外來批中含有外來GMOGMO的最大界限值的最大界限值是：甜油菜是：甜油菜（sweet rapesweet rape）0.3%0.3%，番茄、甜菜、棉花、菊，番茄、甜菜、棉花、菊苣、玉米和馬鈴薯苣、玉米和馬鈴薯0.5%0.5%，大豆，大豆0.7%0.7%，其它未，其它未經權威機構批準的基因為經權威機構批準的基因為0.0%0.0%。當超過極限當超過極限值時，種子批應標注出含有值時，種子批應標注出含有“ “ %GMO”%GMO”。二、轉基因種子特定特性測定的目的二、轉

4、基因種子特定特性測定的目的什么是什么是GMOsGMOs 是指是指憑借現(xiàn)代生物技術獲得的遺傳材料憑借現(xiàn)代生物技術獲得的遺傳材料新異組成的活生物體新異組成的活生物體。實際上就是將外源。實際上就是將外源DNADNA導入生物體基因組，引起了遺傳改變，導入生物體基因組，引起了遺傳改變，改變了遺傳組成的生物，就是轉基因生物。改變了遺傳組成的生物，就是轉基因生物。三、檢測方法三、檢測方法（一）國際規(guī)程對轉基因種子檢驗方法采用一一）國際規(guī)程對轉基因種子檢驗方法采用一種全新的規(guī)定種全新的規(guī)定 國際種子檢驗協(xié)會（國際種子檢驗協(xié)會（ISTAISTA）對于轉基因檢）對于轉基因檢測方法的規(guī)定采用了一種全新的方法，這種方

5、測方法的規(guī)定采用了一種全新的方法，這種方法稱為法稱為“以性能為基礎檢測方法以性能為基礎檢測方法”。以性能為以性能為基礎的檢測方法意味著檢驗室可以研發(fā)和（或）基礎的檢測方法意味著檢驗室可以研發(fā)和（或）使用一種在國際種子檢驗規(guī)程中還未公布的方使用一種在國際種子檢驗規(guī)程中還未公布的方法。法。 并且一旦當檢驗室通過性能數(shù)據正式認可并且一旦當檢驗室通過性能數(shù)據正式認可該方法后，就可以申請國際種子檢驗協(xié)會授權該方法后，就可以申請國際種子檢驗協(xié)會授權使用該檢測方法。使用該檢測方法。三、檢測方法三、檢測方法（二）主要檢測方法（二）主要檢測方法生物表現(xiàn)型檢測方法生物表現(xiàn)型檢測方法 特異蛋白質檢測方法：特異蛋白質

6、檢測方法：包括酶聯(lián)免疫檢測包括酶聯(lián)免疫檢測和橫向側流條測定；和橫向側流條測定； DNADNA檢測方法：檢測方法：包括包括PCRPCR定性和定量分定性和定量分析析第十八章第十八章種子健康測定種子健康測定第十八章第十八章 種子健康測定種子健康測定第一節(jié)第一節(jié) 概述概述一、種子健康測定的目的一、種子健康測定的目的1 1、有關定義、有關定義種子健康測定種子健康測定：測定種子是否攜帶有病原菌：測定種子是否攜帶有病原菌( (如真菌、如真菌、細菌及病毒細菌及病毒) )、有害的動物、有害的動物( (如線蟲及害蟲如線蟲及害蟲) )等健康狀等健康狀況。即對種子況。即對種子所攜帶病蟲害種類所攜帶病蟲害種類及及數(shù)量數(shù)

7、量進行檢測進行檢測。種傳病害種傳病害：在病毒侵染循環(huán)中的某一階段和種子聯(lián)：在病毒侵染循環(huán)中的某一階段和種子聯(lián)系在一起，其病原物附著、寄生或存在于種子表面系在一起，其病原物附著、寄生或存在于種子表面和內部，或混雜于種子中間，和內部，或混雜于種子中間，主要通過種子攜帶而主要通過種子攜帶而傳播的傳播的一類植物病害。一類植物病害。種子害蟲種子害蟲：在種子田間生長和貯藏期間，感染和危：在種子田間生長和貯藏期間，感染和危害種子的害蟲。害種子的害蟲。一、種子健康測定的目的一、種子健康測定的目的2 2、種子健康測定的目的、種子健康測定的目的 檢測檢疫性傳染病害。檢測檢疫性傳染病害。 確定種子批的使用價值。確定

8、種子批的使用價值。 評定種子批是否需要經過種子處理，以評定種子批是否需要經過種子處理，以及處理后的效果。及處理后的效果。 為調查或研究目的而評估某種傳染病的為調查或研究目的而評估某種傳染病的流行情況。流行情況。 探明發(fā)芽率低的原因，彌補發(fā)芽試驗的探明發(fā)芽率低的原因，彌補發(fā)芽試驗的不足。不足。二、種子健康檢驗的內容二、種子健康檢驗的內容 種子健康檢驗包括種子健康檢驗包括田間檢驗田間檢驗和和室內檢驗室內檢驗兩兩部分。部分。 田間檢驗田間檢驗是是根據病蟲害的發(fā)生規(guī)率根據病蟲害的發(fā)生規(guī)率，在一，在一定生長時期進行檢驗。作物在田間生長時期，定生長時期進行檢驗。作物在田間生長時期，病蟲害表現(xiàn)明顯，容易進行

9、檢查，檢查主要依病蟲害表現(xiàn)明顯，容易進行檢查，檢查主要依靠肉眼檢驗。盡管比較粗放，但非常重要，因靠肉眼檢驗。盡管比較粗放，但非常重要，因為有些帶病種子在室內很難加以鑒定。為有些帶病種子在室內很難加以鑒定。 室內檢驗室內檢驗是是貯藏、調種和引種貯藏、調種和引種過程中進行過程中進行病蟲害檢驗的主要手段。病蟲害檢驗的主要手段。三、種子健康測定方法的特點三、種子健康測定方法的特點1 1、種子健康測定方法主要有：、種子健康測定方法主要有：未經培養(yǎng)檢查未經培養(yǎng)檢查包括：直接檢查、吸脹種子檢直接檢查、吸脹種子檢查、洗滌檢查、剖粒檢查、染色檢查、比查、洗滌檢查、剖粒檢查、染色檢查、比重檢查和重檢查和X-X-射

10、線檢查等。射線檢查等。培養(yǎng)后檢查培養(yǎng)后檢查包括：吸水紙法、砂床法、瓊脂吸水紙法、砂床法、瓊脂皿法，以及噬菌體法和血清學酶聯(lián)免疫吸附皿法，以及噬菌體法和血清學酶聯(lián)免疫吸附試驗法等。試驗法等。2 2、種子健康檢測方法應達到的要求、種子健康檢測方法應達到的要求 使病原體容易識別；使病原體容易識別； 結果有重演性；結果有重演性； 樣品間結果有可比性；樣品間結果有可比性； 方法簡單快捷且費用低；方法簡單快捷且費用低； 能適合于國際貿易檢測的要求。能適合于國際貿易檢測的要求。三、種子健康測定方法的特點三、種子健康測定方法的特點三、種子健康測定方法的特點三、種子健康測定方法的特點3 3、檢測結果的影響因素、

11、檢測結果的影響因素 其他病原菌存在可能與被檢測病原菌產其他病原菌存在可能與被檢測病原菌產生干擾；生干擾； 檢驗室檢測結果通常高于田間或溫室的檢驗室檢測結果通常高于田間或溫室的檢測結果；檢測結果； 有些病原菌對培養(yǎng)條件敏感；有些病原菌對培養(yǎng)條件敏感； 種子已經處理；種子已經處理； 種傳病菌生活力隨著長時間貯藏而衰退種傳病菌生活力隨著長時間貯藏而衰退。四、種傳病害的控制方法四、種傳病害的控制方法1 1、確定檢疫種類和劃定檢疫區(qū)域、確定檢疫種類和劃定檢疫區(qū)域 通過法規(guī)，頒布檢疫的種類，明確劃定檢疫區(qū)域和保護區(qū)域，通過法規(guī)，頒布檢疫的種類，明確劃定檢疫區(qū)域和保護區(qū)域，是防止檢疫對象擴展蔓延、保護農業(yè)生

12、產安全的重要措施。是防止檢疫對象擴展蔓延、保護農業(yè)生產安全的重要措施。2 2、制定種子健康標準、制定種子健康標準 制定種傳病害健康標準，是控制病害發(fā)生的一項重要措施。制定種傳病害健康標準，是控制病害發(fā)生的一項重要措施。各國根據各自的國情，在種子認證中制定了種子健康的田間標準各國根據各自的國情，在種子認證中制定了種子健康的田間標準和室內標準。種子健康測定中，有些病害在田間觀察很清楚，而和室內標準。種子健康測定中，有些病害在田間觀察很清楚，而有些則需要室內檢驗。（如大麥小麥的散黑穗病在田間鑒定很容有些則需要室內檢驗。（如大麥小麥的散黑穗病在田間鑒定很容易，而檢疫室檢驗則很困難或花費較大。）易，而檢

13、疫室檢驗則很困難或花費較大。）3 3、種子處理、種子處理 通過種子處理，可大大減輕種傳病害的發(fā)生。如果通過種子通過種子處理，可大大減輕種傳病害的發(fā)生。如果通過種子健康測定，了解病原菌的感染情況和程度，則可有針對性采取措健康測定，了解病原菌的感染情況和程度，則可有針對性采取措施對種子進行處理，效果更為顯著。施對種子進行處理，效果更為顯著。五、種子健康檢驗應注意的問題五、種子健康檢驗應注意的問題1 1、測定方法、測定方法 種子健康測定的不同方法的敏感性、重演性以及所需培訓和設備要求各不相同。 選擇種子健康測定方法主要取決于種子種選擇種子健康測定方法主要取決于種子種類、病害的種類以及檢測的目的。類、

14、病害的種類以及檢測的目的。 對于調查、作出種子處理決定或進行田間評定等目的，只需評定種傳病菌感染率即可； 對于檢疫目的或田間發(fā)病率高的種傳病菌，對種子樣品的檢測精度要求很高。 由于病害感染水平與田間發(fā)病程度之間沒由于病害感染水平與田間發(fā)病程度之間沒有直接聯(lián)系，在許多檢測方法中，一般不記錄有直接聯(lián)系，在許多檢測方法中，一般不記錄每粒種子的病原數(shù)量。每粒種子的病原數(shù)量。五、種子健康檢驗應注意的問題五、種子健康檢驗應注意的問題2 2、試驗樣品的量、試驗樣品的量 根據測定方法，可把整個送驗樣品或其中一部分作為試驗樣品。通常試驗樣品不得少于400粒凈種子，或從送驗樣品取得相當重量的種子。如有必要，需設定

15、一定數(shù)量種子的重復。3 3、結果的計算和報告、結果的計算和報告 結果用供檢的樣品重量中被感染種子數(shù)的百分率或病原體數(shù)目表示。填報結果要填報病原菌的學名，同時說明所用的測定方法，并說明用于檢查的樣品或部分樣品的數(shù)量。第十八章第十八章 種子健康測定種子健康測定第二節(jié)第二節(jié) 種子健康測定的檢驗方法種子健康測定的檢驗方法（一）試驗樣品（一）試驗樣品 根據測定方法的要求，可把整個送驗樣根據測定方法的要求，可把整個送驗樣品或其一部分作為試驗樣品。品或其一部分作為試驗樣品。 通常試驗樣品不得少于通常試驗樣品不得少于400400粒凈種子，粒凈種子，或從送驗樣品分取相當重量的種子。或從送驗樣品分取相當重量的種子

16、。一、種子健康測定的檢驗方法一、種子健康測定的檢驗方法一、種子健康測定的檢驗方法一、種子健康測定的檢驗方法（二）儀器設備（二）儀器設備 種子健康測定所需的儀器設備因測定種子健康測定所需的儀器設備因測定方法不同而異。方法不同而異。 以測定真菌為例：最基本的儀器設備以測定真菌為例：最基本的儀器設備包括包括雙目顯微鏡雙目顯微鏡( (最好是相差顯微鏡最好是相差顯微鏡) )、立體立體顯微鏡顯微鏡( (放大放大6060倍，最好帶有燈倍，最好帶有燈) )、培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱( (最最好配置兩根近紫外燈管好配置兩根近紫外燈管) )、冰箱冰箱、冷凍冰箱、冷凍冰箱、高壓蒸汽滅菌鍋高壓蒸汽滅菌鍋、玻璃容器玻璃容器( (培

17、養(yǎng)皿、燒杯、培養(yǎng)皿、燒杯、燒瓶、載玻片、蓋玻片、漏斗等燒瓶、載玻片、蓋玻片、漏斗等) )、離心機離心機、搖床、搖床、pHpH值測定儀等。值測定儀等。一、種子健康測定的檢驗方法一、種子健康測定的檢驗方法（三）測定方法（三）測定方法1 1、種子健康測定的傳統(tǒng)方法、種子健康測定的傳統(tǒng)方法 未經培養(yǎng)的檢查未經培養(yǎng)的檢查 未經培養(yǎng)的檢查不能說明病原菌的生活力。主未經培養(yǎng)的檢查不能說明病原菌的生活力。主要方法有：要方法有：（1 1）直接檢查）直接檢查。直接檢查。直接檢查適用于較大的病原體適用于較大的病原體或雜質外表有明顯癥狀的病害或雜質外表有明顯癥狀的病害，如麥角、線蟲癭、，如麥角、線蟲癭、蟲癭、黑穗病孢

18、子、螨類等。必要時，可應用雙蟲癭、黑穗病孢子、螨類等。必要時，可應用雙目顯微鏡、剖粒和軟目顯微鏡、剖粒和軟X X射線儀等對試樣進行檢查，射線儀等對試樣進行檢查，取出病原體或病粒，稱其重量或計算其粒數(shù)。取出病原體或病粒，稱其重量或計算其粒數(shù)。（2 2）吸脹種子檢查）吸脹種子檢查。吸脹種子檢查為使子。吸脹種子檢查為使子實體、病癥或害蟲更容易觀察到或促進孢子實體、病癥或害蟲更容易觀察到或促進孢子釋放，把試驗樣品浸入水中或其他液體中，釋放，把試驗樣品浸入水中或其他液體中，種子吸脹后檢查其表面或內部，最好用雙目種子吸脹后檢查其表面或內部，最好用雙目顯微鏡進行觀察。顯微鏡進行觀察。（3 3）洗滌物檢查。）

19、洗滌物檢查。把試驗樣品浸在加過濕把試驗樣品浸在加過濕潤劑的水里或酒精里，用力振蕩，把混在種潤劑的水里或酒精里，用力振蕩，把混在種子里的或附在種子上的真菌孢子、菌絲和線子里的或附在種子上的真菌孢子、菌絲和線蟲等沖洗下來。然后把洗滌液進行過濾、濃蟲等沖洗下來。然后把洗滌液進行過濾、濃縮或者蒸發(fā)，除去過剩的液體，并用顯微鏡縮或者蒸發(fā)，除去過剩的液體，并用顯微鏡進行檢查提取物。進行檢查提取物。一、種子健康測定的檢驗方法一、種子健康測定的檢驗方法 生長植株的檢查生長植株的檢查 將種子培育成植株，然后檢查其病癥，將種子培育成植株，然后檢查其病癥，這是測定樣品中是否存在細菌、真菌或病毒這是測定樣品中是否存在

20、細菌、真菌或病毒等最切實可行的方法。可從供檢的樣品中等最切實可行的方法。可從供檢的樣品中取得接種體，以供對健康幼苗或植株一部取得接種體，以供對健康幼苗或植株一部分進行感染試驗。嚴格各種條件，必須防分進行感染試驗。嚴格各種條件，必須防止植株從別處來的次生感染。止植株從別處來的次生感染。一、種子健康測定的檢驗方法一、種子健康測定的檢驗方法2 2、真菌檢測方法、真菌檢測方法 吸水紙法吸水紙法 吸水紙法適用于許多類型種子的種傳真吸水紙法適用于許多類型種子的種傳真菌病害的檢驗，尤其是對于許多半知菌，有菌病害的檢驗，尤其是對于許多半知菌，有利于分生孢子的形成和致病真菌在幼苗上的利于分生孢子的形成和致病真菌

21、在幼苗上的癥狀的發(fā)展。為了促進孢子形成，建議在培癥狀的發(fā)展。為了促進孢子形成，建議在培養(yǎng)期間給以養(yǎng)期間給以1212小時黑暗與小時黑暗與1212小時近紫外光小時近紫外光（NUV)NUV)的交替處理。建議光源使用的交替處理。建議光源使用“黑光黑光”熒光燈熒光燈( (峰值為峰值為360nm)360nm)，不過日光熒光燈管效，不過日光熒光燈管效果也不錯。果也不錯。一、種子健康測定的檢驗方法一、種子健康測定的檢驗方法 瓊脂皿法瓊脂皿法 主要用于發(fā)育較慢的致病真菌潛伏在種主要用于發(fā)育較慢的致病真菌潛伏在種子內部的病原菌，也可用于檢驗種子外表的子內部的病原菌，也可用于檢驗種子外表的病原菌。病原菌。 發(fā)芽法發(fā)

22、芽法 可以通過發(fā)芽法比較未處理種子的病原可以通過發(fā)芽法比較未處理種子的病原體作用和影響。體作用和影響。一、種子健康測定的檢驗方法一、種子健康測定的檢驗方法二、細菌測定方法二、細菌測定方法1 1、生長植株鑒定、生長植株鑒定最簡單的方法是種植有種傳細菌的種子，鑒定幼苗的癥狀。最簡單的方法是種植有種傳細菌的種子，鑒定幼苗的癥狀。2 2、檢驗室方法、檢驗室方法檢驗室測定細菌的方法程序：檢驗室測定細菌的方法程序：病原體提取病原體提取。提取方法主要有通過浸泡種子，或通過磨。提取方法主要有通過浸泡種子，或通過磨碎或破碎種子并在液體中浸濕等兩種方法。種子數(shù)量和方碎或破碎種子并在液體中浸濕等兩種方法。種子數(shù)量和方法應根據試驗確定；法應根據試驗確定； 分離分離。通過瓊脂皿可以將病原細菌從提取后的溶液中。通過瓊脂皿可以將病原細菌從提取后的溶液中分離出來，將提取液原液或者稀釋液涂在瓊脂皿上，可分分離出來，將提取液原液或