實(shí)驗(yàn)八核酸的定量測定——定磷法ExpDeterminationof

1、 一、實(shí)驗(yàn)原理一、實(shí)驗(yàn)原理 核酸分子中含有一定比例的磷，一般為9.5%左右，若測得某一核酸樣品中磷的含量，即可推算其核酸的含量。 用強(qiáng)酸使核酸分子中的有機(jī)磷消化成無機(jī)磷，無機(jī)磷再與鉬酸銨結(jié)合成磷鉬酸銨。PO43- + 3NH4 + + 12MoO4 2- + 24H+ (NH4)3PO412MoO36H2O(黃色黃色)+6H2O 當(dāng)有還原劑存在時(shí)，Mo6+被還原成Mo4+，此4價(jià)鉬再與試劑中的其它MoO42結(jié)合成Mo(MoO4)2或Mo3O8呈蘭色，稱為鉬蘭。(NH4)3PO412MoO36H2O 還原劑（抗壞血酸） 鉬蘭鉬蘭Mo(MoO4)2或或Mo2O8 在一定濃度范圍內(nèi)，蘭色的深淺和磷酸

2、的含量成正比，可用比色法測定其光吸收值。 樣品中若有無機(jī)磷，應(yīng)將無機(jī)磷扣除，否則，測定結(jié)果偏高。 二、實(shí)驗(yàn)用品二、實(shí)驗(yàn)用品 1、材料、材料 粗核酸（酵母核糖核酸，含磷量大于7%） 2、試劑、試劑 (1) 6 mol/L H2SO4溶液 （2）10 mol/L H2SO4溶液 （3）2.5%鉬酸銨溶液 （4）10%抗壞血酸溶液 (5) 定磷試劑 在使用前將上述試劑按以下比例混合,蒸餾水：6N H2SO4：2.5%鉬酸銨：10%抗壞血酸=2：1：1：1（V/V）。 （6）標(biāo)準(zhǔn)無機(jī)磷儲備液（含磷量1mg/1ml） 將磷酸二氫鉀（AR）于110烘至恒重（一般需4小時(shí)以上），然后置于干燥器內(nèi)冷卻。用分析

3、天平精確稱取1.0967克，定溶至250ml。此液為儲備液，放入冰箱內(nèi)保存，用時(shí)再稀釋。 3、儀器設(shè)備、儀器設(shè)備 恒溫水箱 分光光度計(jì) 三、方法和步驟三、方法和步驟 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精確吸取0.5 ml標(biāo)準(zhǔn)無機(jī)磷儲備液， 于50 ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，配制成含磷量為10 ug/1ml的標(biāo)準(zhǔn)無機(jī)磷溶液。 取6支試管，按下表編號，分別按表內(nèi)要求，加入標(biāo)準(zhǔn)磷溶液蒸餾水及定磷試劑。加畢，搖勻，于45水浴保溫10分鐘，冷卻，用721型分光光度計(jì)分別測定其光吸收值（A660nm）。 管管 號號試試 劑劑012345標(biāo)準(zhǔn)磷溶液標(biāo)準(zhǔn)磷溶液/ml00.20.40.60.81.0蒸餾水蒸餾水/ml

4、3.02.82.62.42.22定磷試劑定磷試劑/ /ml 333333A660nm 0- 2、總磷的測定、總磷的測定 準(zhǔn)確稱取樣品（如粗核酸）0.1克，用少量水溶解，（如不溶，可滴加5%氨水調(diào)至pH7.0），轉(zhuǎn)移至50ml凱氏燒瓶中,加水至刻度。吸取上面的樣品液1.0mL，置于50ml凱氏燒瓶中，加入2.5毫升10mol/L H2SO4，將凱氏燒瓶接在凱氏消化架上（或在通風(fēng)櫥內(nèi)），在電爐上加熱，至溶液透明，表示消化完成。冷卻，將消化液移入100ml容量瓶中，用少量蒸餾水洗滌凱氏燒瓶兩次，洗滌液一并倒入容量瓶，再加水至刻度。 混勻后，吸取3.0ml置于試管中，加定磷試劑3.0 ml，搖勻，45

5、保溫10分鐘，冷卻。測其A660nm。 3、無機(jī)磷的測定、無機(jī)磷的測定 吸取樣品液（2mg/1ml）1.0 ml，置于100 ml容量瓶中，加水至刻度，搖勻后，吸取3.0 ml置于試管中，加定試劑3.0 ml，45水浴保溫10分鐘，冷卻，測其光吸收值。 管管 號號試試 劑劑0總磷總磷無機(jī)磷無機(jī)磷總磷樣品液總磷樣品液/ml3(蒸餾水蒸餾水)3無機(jī)磷樣品液無機(jī)磷樣品液/ml3定磷試劑定磷試劑/ml333A660nm0- 四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 總磷A660nm無機(jī)磷A660nm= 有機(jī)磷A660nm 由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得有機(jī)磷微克數(shù)（X）。按下試計(jì)算樣品中核酸百分含量。 ( X / 測定時(shí)取樣的ml數(shù) ) 稀釋倍數(shù) 11核酸% = 100% 樣品重量(g) 六、參考文獻(xiàn) 1.現(xiàn)代生物學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)現(xiàn)代生物學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo),林宏輝等林宏輝等,四川大學(xué)出版四川大學(xué)出版社社,2003 2.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法,李建武等編李建武等編,北京大學(xué)出北京大學(xué)出版社版社 1994年年 3.The tools o