光學顯微鏡基礎知識

1、基礎知識基礎知識顯微鏡成像顯微鏡成像FF物鏡顯微鏡成像顯微鏡成像FF物鏡顯微鏡成像顯微鏡成像物鏡250mm明視距離FF目鏡基礎知識基礎知識點 標本投影圖像點 平面平面圖形準確 相似 圖形像差像差點 標本投影圖像虛的圓 平面彎曲的面圖形變形的圖形像差像差基礎知識基礎知識基礎知識基礎知識基礎知識基礎知識基礎知識基礎知識ACHPLAN ACH基礎知識基礎知識色差校正色差校正對照對照無校對 校對 基礎知識基礎知識基礎知識基礎知識基礎知識基礎知識基礎知識基礎知識R = k /NA：波長：波長NA：數(shù)值孔徑：數(shù)值孔徑K常數(shù)常數(shù): K光鏡光鏡 = 0.61；KFV = 0.51基礎知識基礎知識基礎知識基礎知

2、識基礎知識基礎知識基礎知識基礎知識基礎知識基礎知識比如10倍物鏡下的中心轉(zhuǎn)換到40倍是仍然幾乎是中心基礎知識基礎知識基礎知識基礎知識基礎知識基礎知識基礎知識基礎知識基礎知識基礎知識基礎知識基礎知識基礎知識基礎知識uVIS NIR范圍內(nèi)優(yōu)異的色差校正范圍內(nèi)優(yōu)異的色差校正信信噪噪UPLSAPO物鏡物鏡消色差消色差 Ach 藍藍 (486nm) 和紅和紅 (657nm)半復消色差半復消色差Fluorite 蘭和紅蘭和紅 + (綠綠, 紫色紫色(437nm)復消色差復消色差Apo 437-657nm 超級復消色差超級復消色差Super Apo 430-1000nm物鏡的色差校正物鏡的色差校正軸向色差軸

3、向色差側向色差側向色差ACH消色差消色差 Ach 藍藍 (486nm) 和紅和紅 (657nm)半復消色差半復消色差Fluorite 蘭和紅蘭和紅 + (綠綠, 紫色紫色(437nm)復消色差復消色差Apo 437-657nm 超級復消色差超級復消色差Super Apo 430-1000nm物鏡的色差校正物鏡的色差校正軸向色差軸向色差側向色差側向色差ACHFLIRIR消色差消色差 Ach 藍藍 (486nm) 和紅和紅 (657nm)半復消色差半復消色差Fluorite 蘭和紅蘭和紅 + (綠綠, 紫色紫色(437nm)復消色差復消色差Apo 437-657nm 超級復消色差超級復消色差Sup

4、er Apo 430-1000nm物鏡的色差校正物鏡的色差校正軸向色差軸向色差側向色差側向色差ACHFLApo消色差消色差 Ach 藍藍 (486nm) 和紅和紅 (657nm)；綠球差；綠球差半復消色差半復消色差Fluorite 蘭和紅蘭和紅 + (綠綠, 紫色紫色(437nm)；綠、蘭球差；綠、蘭球差復消色差復消色差Apo 437-657nm ，綠、蘭、深蘭球差，綠、蘭、深蘭球差超級復消色差超級復消色差 430-1000nmSuper Apo物鏡的色差校正物鏡的色差校正軸向色差軸向色差側向色差側向色差ACHFLS ApoIRIRApo基礎知識基礎知識基礎知識基礎知識基礎知識基礎知識基礎知識

5、基礎知識浮雕相稱物鏡浮雕相稱物鏡無應力偏光物鏡無應力偏光物鏡相稱物鏡相稱物鏡超低倍物鏡超低倍物鏡基礎知識基礎知識基礎知識基礎知識基礎知識基礎知識光闌全開啟光闌全開啟光闌適當關小光闌適當關小熒光觀察中應用熒光觀察中應用基礎知識基礎知識基礎知識基礎知識聚光鏡聚光鏡瞳距調(diào)節(jié)瞳距調(diào)節(jié)屈光度調(diào)節(jié)屈光度調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)光光路路轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換換孔徑光欄調(diào)節(jié)孔徑光欄調(diào)節(jié)N.A聚= =(0 0.6-06-0.8 8)N.A物孔孔徑徑光光欄欄開開度度與與圖圖象象100%70%30%HRLCHCLRMRMC孔徑光欄的運用孔徑光欄的運用孔徑光欄的運用孔徑光欄的運用對比度調(diào)節(jié)對比度調(diào)節(jié)顯微鏡無限遠光學系統(tǒng)顯微鏡無限遠光學系統(tǒng)UIS

6、 UIS 有限遠有限遠無限遠無限遠 UISUIS光學系統(tǒng)Merit of the Infinity system 物鏡 D/M 重影 平行光線平行光線 結像透鏡UIS 系統(tǒng) Universal Infinity System萬能無限遠萬能無限遠系統(tǒng)系統(tǒng)1. 完美結合分辨率和對比度 -明場高分辨率-高對比度、高亮度圖像-清晰的 DIC圖像-更敏感的偏光觀察-清晰、色彩明亮的相襯UIS 系統(tǒng)Universal Infinity System2. 系統(tǒng)靈活性- 無限遠校正光學系統(tǒng)- 物鏡和結像透鏡完全校正3. 物鏡萬能性更強-A single universal objective lens per

7、forms very well in Fluorescence, Nomarski DIC, Phase contrast, Polarized light and, of course, Brightfield-High UV transmission, Strain-free, Perfect correction of Chromatic aberration and other optical aberrationsCompetition comparison F : Fully Primary Correction in objective & tube lens Tc :

8、Tube-lens Compensation1增加附件，光路不變，倍率不變，增加附件，光路不變，倍率不變，F(xiàn).N.不變不變2中間附件設計更簡單，不需增加透鏡中間附件設計更簡單，不需增加透鏡3物鏡單獨完成象差校正，象差校正更高，不需目鏡補償物鏡單獨完成象差校正，象差校正更高，不需目鏡補償4更高鏡像亮度，熒光效果更好（結象透鏡校正）更高鏡像亮度，熒光效果更好（結象透鏡校正）5接視頻效果更好，不需增加照相目鏡接視頻效果更好，不需增加照相目鏡相差觀察方式相差觀察方式1 原理原理利用被檢物體的光程（折射率 x 厚度）差進行鏡檢，即利用干涉現(xiàn)象，將相位差變?yōu)槿搜劭梢苑直娴恼穹罟曹椕妫何展饩€，直射光通過

9、共軛面：吸收光線，直射光通過補償面：相位推遲，衍射光通過補償面：相位推遲，衍射光通過物鏡物鏡相板相板 聚光鏡環(huán)狀光闌聚光鏡環(huán)狀光闌相差觀察方式相差觀察方式2 特點特點鑒定活體細胞最實用、最經(jīng)濟的方法3 缺點缺點需要光強高切片不能太厚(210um)蓋片、載片需符合標準最好配用單色濾光鏡操作較麻煩熒光效果不如明場物鏡相差觀察方式相差觀察方式4 應用：應用：無色透明活體標本的細微結構，檢查,鑒定活體細胞(培養(yǎng)細胞,分離細胞)相差觀察方式相差觀察方式5 調(diào)節(jié)：調(diào)節(jié)：柯勒照明調(diào)節(jié)將相差物鏡及附件轉(zhuǎn)入光路（物鏡聚光鏡相襯環(huán)型號匹配）對樣品聚焦取下目鏡，裝上CT望遠鏡，調(diào)節(jié)CT焦距看到清晰的相差環(huán)調(diào)節(jié)聚光鏡

10、上定位螺絲，使環(huán)狀光闌象與相板共軛面重合熒熒光光觀觀察察方方法法什么是熒光什么是熒光 ? ? 物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槲镔|(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出的光，是非高能狀態(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出的光，是非溫度輻射光溫度輻射光冷光。即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)冷光。即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長波光。射出的長波光。 顯微鏡熒光利用光源激發(fā)顯微鏡熒光利用光源激發(fā)光化熒光光化熒光熒光顯微鏡的作用原理寬譜線發(fā)射光寬譜線發(fā)射光（汞燈）（汞燈）濾掉其他光，透過濾掉其他光，透過激發(fā)光激發(fā)光激發(fā)濾激發(fā)濾色片色片吸收濾吸收濾色片色片濾掉激發(fā)光，透過濾掉激發(fā)光，透過

11、熒光熒光標本受激發(fā)產(chǎn)生標本受激發(fā)產(chǎn)生熒光向四周發(fā)散熒光向四周發(fā)散激發(fā)光受反射、折射激發(fā)光受反射、折射或衍射向四周發(fā)散或衍射向四周發(fā)散熒光的性質(zhì)熒光的性質(zhì) 吸收光，必需有激發(fā)光源吸收光，必需有激發(fā)光源 熒光波長激發(fā)波長（損失熱能）熒光波長激發(fā)波長（損失熱能） 熒光強度極小于激發(fā)光的強度熒光強度極小于激發(fā)光的強度 有不同程度的衰減有不同程度的衰減 熒光強度取決于激發(fā)光強度、被檢物濃熒光強度取決于激發(fā)光強度、被檢物濃度、熒光效率度、熒光效率熒光顯微鏡的優(yōu)點和用途熒光顯微鏡的優(yōu)點和用途優(yōu)點：優(yōu)點： 檢出能力高（放大作用）檢出能力高（放大作用） 對細胞的刺激?。梢曰铙w染色）對細胞的刺激小（可以活體染色

12、） 能進行多重染色能進行多重染色用途：用途： 物體構造的觀察物體構造的觀察熒光素熒光素 熒光的有無、色調(diào)比較進行物質(zhì)判別熒光的有無、色調(diào)比較進行物質(zhì)判別抗體抗體熒光等熒光等 發(fā)熒光量的測定對物質(zhì)定性、定量分析發(fā)熒光量的測定對物質(zhì)定性、定量分析熒光顯微鏡的主要部件熒光顯微鏡的主要部件 透射式透射式吸收濾色鏡吸收濾色鏡暗場聚光鏡暗場聚光鏡激發(fā)濾色鏡激發(fā)濾色鏡汞燈光源汞燈光源 落射式落射式吸收濾色鏡吸收濾色鏡分光鏡分光鏡激發(fā)濾色鏡激發(fā)濾色鏡汞燈光源汞燈光源落射熒光顯微鏡的構造落射熒光顯微鏡的構造落射熒光顯微鏡的構造落射熒光顯微鏡的構造熒光顯微鏡光源熒光顯微鏡光源 汞燈光源汞燈光源: :提供激發(fā)光提供

13、激發(fā)光(U(U、V V、B B、G) G) 氙燈光源：氙燈光源： 高峰值更寬，更穩(wěn)定高峰值更寬，更穩(wěn)定熒光顯微鏡激發(fā)透鏡組熒光顯微鏡激發(fā)透鏡組 激發(fā)激發(fā)濾色鏡濾色鏡: : 激發(fā)波長選擇激發(fā)波長選擇 激發(fā)透鏡組激發(fā)透鏡組（激發(fā)塊）（激發(fā)塊）: : T%nmBAND PASS入射光入射光發(fā)射光發(fā)射光激發(fā)激發(fā) 濾色鏡濾色鏡分光分光 濾色鏡濾色鏡吸收吸收 濾色鏡濾色鏡落射熒光顯微鏡各部件特性和落射熒光顯微鏡各部件特性和作用作用 吸收濾色鏡吸收濾色鏡: :熒光透過熒光透過, ,阻擋雜光阻擋雜光 分色鏡分色鏡: :反射激發(fā)光反射激發(fā)光, ,熒光透過熒光透過A 透過透過AA 反射反射BB 透過透過B 阻擋阻

14、擋nmnmT%T%A濾色鏡的選擇濾色鏡的選擇熒光素熒光素激發(fā)波長激發(fā)波長 發(fā)射波長發(fā)射波長DAPI372372456456AMCA350350450450Hoechst 33258365365465465FITC490490520520Acridine Orange490490590590Acridine Yellow470470550550CY3552552565565TRITC541541572572Propidium Iodide530530615615帶寬對圖象的影響帶寬對圖象的影響SWB: BP420-480SWB: BP420-480WB: BP450-480WB: BP450-480WIB: BP460-490WIB: BP460-490NB: BP470-490NB: BP470-490雙重染色標本的單色和