TLC板技術(shù)經(jīng)驗交流PPT教案

1、會計學1TLC板技術(shù)經(jīng)驗交流板技術(shù)經(jīng)驗交流2 第1頁/共42頁背景：薄層色譜法(Thin-Layer Chromatography,簡稱TLC）是Kirchner等人在五十年代從經(jīng)典柱色譜法及紙色譜法的基礎上發(fā)展起來 的一 種 色 譜技術(shù)。六 十年代后，Stahl等人 對薄層色譜法的標準化、規(guī)格化及擴大應用等方面進行了許多工作，使該法日趨成熟。2010年版中國藥典一部有3341項鑒別采用TLC法分類：按薄層色譜使用的固定相的性質(zhì)及其分離機制可分為吸附薄層、分配薄層、離子交換薄層及分子排阻薄層背景和分類背景和分類第2頁/共42頁4 特點特點：微量、快速、簡單、節(jié)省微量、快速、簡單、節(jié)省一般認為T

2、LC是一種定性和半定量的方法原理和特點原理和特點第3頁/共42頁5點樣薄層板預處理展開展開劑選擇顯色顯色劑使用定位定量和定性操作過程操作過程第4頁/共42頁氧化鋁 有弱堿性 pH=9、酸性pH=4及中性pH=7.5三種氧化鋁。弱堿性氧化鋁用來分離中性或堿性化合物；中性氧化鋁適用于酸性及對堿不穩(wěn)定的化合物的分離；酸性化合物可用酸性氧化鋁分離。硅藻土、纖維素、葡聚糖凝膠等化學鍵合固定相（C18、C8 等）薄層板薄層板硅膠 表面帶硅醇基（SiOH），呈弱酸性 (pH=4.5)，活性硅膠適合分離酸性或中性化合物，如酚類、有機酸、醛類、甾體化合物以及氨基酸類，是基于吸附作用；非活性硅膠含有一定的水，在分

3、離色素時是基于分配作用。第5頁/共42頁硅膠G: 是含有13煅石膏（gypsum）黏合劑的硅膠硅膠H：不含黏合劑的硅膠硅膠HF254：不含黏合劑，含有一種無機熒光劑（如錳激活的硅酸鋅），在254nm波長紫外光下呈強烈黃綠色熒光硅膠GF254：含有煅石膏黏合劑，含熒光劑，在254nm波長紫外光下呈強烈黃綠色熒光硅膠HF254+366：不含粘合劑，在254與366nm波長有熒光硅膠PF254：制備型的，在254nm有熒光（有熒光劑，適用于不發(fā)光不易顯色物質(zhì)的制備與分離） 市售預制板規(guī)格市售預制板規(guī)格第6頁/共42頁將吸附劑或載體均勻涂布在玻璃板、塑料片或鋁箔上的預制板。薄層有軟板及硬板兩種。硬板系

4、在吸附劑中加入適量粘合劑后用濕法涂層，粘合劑的加入可以增加薄層的強度。常用的粘合劑為羧甲基纖維素鈉(CMCNa)或煅石膏(CaSO41/2H2O)使用前一般應于110下活化30min薄層厚度約為 0.2-0.3mm。 制備板0.5-2mm。 薄層的制備薄層的制備第7頁/共42頁手動點樣：靈活方便，常用于各種TLC鑒別中。自動點樣 重現(xiàn)性和準確性好，常用于薄層掃描法的含量測定。半自動點樣儀點樣量：原點位置的負荷有限，體積0.510微升，濃度通常為0.52mg。直徑3mm以內(nèi)樣品溶劑：原則上應選擇對可以溶解但溶解度不是很大的溶劑一定要有交叉點點樣點樣Spyringe第8頁/共42頁10Note:

5、毛細管取樣1cm？ 3.14*（0.3mm/2）*10mm=1.413mm=0.71L 3.14*（0.5mm/2）*10mm=3.925mm=1.96L第9頁/共42頁點樣常見問題點樣常見問題1、點樣量太多。展開劑不能全部負載2、太濃了。展開劑從原點外圍繞行3、濃。未分開4、樣品溶劑殘留。吹干時應注意高溫 破壞樣品5、點樣量太少。看不清6、樣品溶劑中溶解度很大。原點將變 成空心圓第10頁/共42頁12一般極性溶劑體系一般極性溶劑體系(CH2Cl2, THF, ethyl acetate, etc)強極性溶劑體系強極性溶劑體系(DMSO, DMF)需要淬滅的體系需要淬滅的體系(NaH, LiA

6、lH4, n-BuLi, etc)強堿、酸性物質(zhì)強堿、酸性物質(zhì)(NaOH, H2SO4,etc)一般不推薦直接取一般不推薦直接取樣，建議淬滅后簡樣，建議淬滅后簡單后處理再取樣，單后處理再取樣，或稀釋后取樣?；蛳♂尯笕?。最好簡單后處理最好簡單后處理（加水和有機溶劑（加水和有機溶劑萃取）以后取樣萃?。┮院笕犹幚硖幚恚ㄈ缂铀颍ㄈ缂铀蛩岷陀袡C溶劑）酸和有機溶劑）后取樣后取樣最好中和后取樣最好中和后取樣Note: ：第11頁/共42頁展開方法 展開劑浸入薄層下端高度不應超過 0.5cm，當心將樣品帶被展開劑浸泡硬板可以進行近水平、上行、下行、雙向、多次展開等展開槽有直立式、平臥式、雙槽式、夾心式

7、或水平式第12頁/共42頁Note：a.展開槽應密閉。溶劑蒸氣、液相( 展開劑)、固定相 ( 吸附劑) 一起構(gòu)成復雜的三維層析過程b.展缸預先飽和以減弱邊緣效應，如果薄層板也同時預飽和效果更佳。c.點樣帶寬時（常見制備板）。先用大極性溶劑展2cm以濃集樣品，干燥薄層板，再用所需展開劑展開。第13頁/共42頁使各成分間有較好的分離;Rf在0.20.8為有效;監(jiān)控點應在0.40.6之間不與待測組分發(fā)生化學反應;沸點適中，黏度較??；展開后組分斑點圓且集中；混合溶劑最好新鮮配制; 展開劑的選擇原則展開劑的選擇原則第14頁/共42頁16展開方向有單向、單向長板、多次、多種極性展開等.展一次展多次第一次展

8、開PE/EA=4:1 第二次展開CH2Cl2/MeOH=10:1采用多次展開的方法可以提高TLC的分離效果。做一次檢測得到較多的樣品信息，展開前多思考。第15頁/共42頁17展開機理的探討展開機理的探討ABCD為硅膠層， EFCDG為展開劑，EF為展開劑前沿，CDG為展開劑水平面。展開劑以硅膠膠表面ED為界分A AB BC CD DE EF FG G展開方向毛細層（EFCD）內(nèi)的展開劑理所當然向AB方向運動依附層（EDG）的展開劑作為額外的補充源泉 同一瞬間，跨過薄層板上任一點展開劑的絕對量彼此相等，但由于液層厚度不同，必然存在速度差異所以，Rf 值越大 ，斑點也就越大。第16頁/共42頁堿性

9、物質(zhì)能與硅膠作用，易被吸附出現(xiàn)脫尾，加TEA，NH3H2O，Pyridine等避免先低后高，先單一后復雜，酸加酸，堿加堿，羰基加丙酮，相似相容原則展開劑的選擇方法展開劑的選擇方法石油醚二氯甲烷乙醚四氫呋喃乙酸乙酯丙酮正丙醇甲醇水常用展開劑極性順序常用展開劑極性順序第17頁/共42頁三角形法三角形法（a）適于吸附薄層; (b) 適于分配薄層. （a）第18頁/共42頁點滴實驗法點滴實驗法最合適的展開劑？第19頁/共42頁Note：a.展開劑渾濁不清，應分液澄清后b.正丁醇和丙醇對斑點擴散影響較小c.丙酮可混溶溶劑，降低劑粘度，加快展速d.由于混溶性和硅膠耐酸能力的限制，水和酸的使 用是有限度的。

10、大展開劑: ArOH (aq sat.)、n-BuOH (aq sat.) 、nBuOH-AcOH-H2O(5:1:1)、iPrOH-NH4OH-H2O(10:5:1)常用展開劑對：E/P、M/D、PE / Acetone、THF/PE、 MeOH/Toluene、DCM/PE第20頁/共42頁nBuOH/acetone/AcOH/H2OVB1及其磷酸酯nPrOH/NH3H2O(con.)/H2O=20/20/1AMP單磷酸及3,5-雙磷酸n-BOH/HOAc/H2O=5/1/1巰基乙胺及甲基化后第21頁/共42頁DCM/MeOH/HOAc=10/1/0.05甘氨膽酸THF/PE=2/3ED-

11、71中間體AsMg、FPM中間體硫醚，亞砜、砜第22頁/共42頁24顯色顯色一一看看、首先在日光下觀察，劃出有色物質(zhì)的斑點位置、首先在日光下觀察，劃出有色物質(zhì)的斑點位置二二照照、在紫外燈下觀察有無暗斑或熒光斑點、在紫外燈下觀察有無暗斑或熒光斑點三三碘碘、多數(shù)有機物吸附碘可逆的產(chǎn)生棕色或黃色斑點、多數(shù)有機物吸附碘可逆的產(chǎn)生棕色或黃色斑點四四顯顯、既無色又無紫外吸收的物質(zhì)，可以用顯色劑顯色、既無色又無紫外吸收的物質(zhì)，可以用顯色劑顯色DIEADIEAPE/EA=1:2NEtNEt3 3第23頁/共42頁25各種常用顯色劑及其配制方法各種常用顯色劑及其配制方法: :硫酸溶液硫酸溶液 硫酸-水(1：1)

12、溶液；硫酸-甲醇或乙醇(1：1)溶液；1.5 molL硫酸溶液與0.5-1.5 molL硫酸銨溶液大部分化合物大部分化合物高錳酸鉀高錳酸鉀 1.5g KMnO4 + 10g K2CO3 + 1.25mL 10% NaOH + 200mL含還原性基團化合物，含還原性基團化合物，比如羥基，氨基，醛比如羥基，氨基，醛磷鉬酸磷鉬酸(PMA) (PMA) 乙醇5磷鉬酸乙醇溶液 噴后120（可用加熱槍）緩慢烘烤還原性化合物顯藍色，還原性化合物顯藍色，再用氨氣薰，則背景再用氨氣薰，則背景變?yōu)闊o色。變?yōu)闊o色。茚三酮茚三酮O.2g溶于乙醇l00 ml中。方法：噴后于110oC加熱。醋酸呈紅紫色斑點氨基酸或胺基氨

13、基酸或胺基溴甲酚綠溴甲酚綠溴甲酚綠0.1g溶于乙醇500ml和0.1mol/L氫氧化鈉溶液5ml酸或堿酸或堿第24頁/共42頁26續(xù)表續(xù)表茴香醛溶液茴香醛溶液674mL乙醇+18.5mL茴香醛+25mL濃硫酸浸泡后吹干再加熱氰基、胺基及硝基氰基、胺基及硝基2,4-二硝基苯二硝基苯肼肼2g 2,4-二硝基苯肼+ 60mL濃硫酸+ 80mL水+ 200mL乙醇酮一般顯黃色，飽和醛則顯紅色或磚紅色不定羰基的化合物羰基的化合物吲哚醌吲哚醌1g溶于100ml丙酮中，加入10ml醋酸。噴灑試劑后，100110加熱l0min，顯藍、紅、桃紅或棕色斑點氨基酸、多肽氨基酸、多肽香草醛香草醛/ /硫酸硫酸 香草醛

14、1g溶于硫酸lOOml。噴后于120加熱至呈色最深。高級醇、酚、甾類及精高級醇、酚、甾類及精油油第25頁/共42頁定性定性影響Rf值的因素較多：溫度、濕度。一般在較高溫度下展開時，Rf值較高，反之降低需經(jīng)過兩種以上不同組成的展開劑得到的 R f值與標準品一致時，才可認定該斑點與標準品是同一化合物；通過斑點顏色，有無紫外吸收或產(chǎn)生螢光的顏色，以及用專屬性顯色劑后斑點顯色的情況與標準品對照可幫助鑒定第26頁/共42頁手性薄層色譜手性薄層色譜一、手性選擇劑混合制板（較難實現(xiàn)）二、手性選擇劑添至流動相中，作展開劑使用三、？好的分析方法應該是簡單的，簡潔是一種美。第27頁/共42頁手性薄層色譜分離的因素

15、手性選擇劑的種類、 純度、 濃度大小、 與吸附劑的比例化合物消旋化， 配置成溶液后這種趨勢變得更大。第28頁/共42頁Nature 1965 208, p71 - 72nBuOH/Pyridine/H2O=1/1/1L-isomerD-isomernBuOH/Pyridine/H2O=1/1/1L-isomerD-isomer第29頁/共42頁31純 度?狀 態(tài)?合 理?可 行?第30頁/共42頁32監(jiān)測反應進程監(jiān)測反應進程: :Note：a.點樣量 b.檢測時間c.留樣對照 d. 重要板留存第31頁/共42頁33檢測時機檢測時機第32頁/共42頁34官能團轉(zhuǎn)化官能團轉(zhuǎn)化極性大極性大極性小極性

16、小R=R R-RCHO C=COHX (Cl, Br, I) COOHCO2R ,R-SO-R R-SO2-R-NH2(-OH) NH-R ,(OH- R ,)第33頁/共42頁35TLCTLC組合判斷組合判斷TLCTLCMSMSNMRNMRLCMs/HPLCLCMs/HPLC第34頁/共42頁36后處理情況后處理情況EAEAH H2 2O O固體的純度和母液的取舍固體的純度和母液的取舍SolidSolidMother solutionMother solutionsolidmother .萃取是否有效萃取是否有效第35頁/共42頁37摸索柱層析洗脫條件摸索柱層析洗脫條件Note: Rf值在值在0.2左右的展開劑比例為洗脫劑的合適值左右的展開劑比例為洗脫劑的合適值 過柱時組分流出順序未必和過柱時組分流出順序未必和TLC上點極性順序一致上點極性順序一致Rf = 0.2Desired productDesired pr