醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)參考模板

1、醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)概 述免疫學(xué)是一門既古老又嶄新的學(xué)科，涉及醫(yī)學(xué)各個(gè)領(lǐng)域，并與理工農(nóng)各學(xué)科相互滲透。醫(yī)學(xué)免疫學(xué)是生命科學(xué)的前沿學(xué)科，也是醫(yī)學(xué)生的主干必修課程之一。目前免疫學(xué)的研究已經(jīng)進(jìn)入了一個(gè)嶄新的時(shí)代?，F(xiàn)代免疫學(xué)的研究和應(yīng)用涉及到生物醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。它與分子生物學(xué)一樣是生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床工作不可缺的工具。醫(yī)學(xué)免疫學(xué)是一門實(shí)踐性、應(yīng)用性很強(qiáng)的學(xué)科，教學(xué)過(guò)程分為理論教學(xué)和實(shí)驗(yàn)教學(xué)。實(shí)驗(yàn)教學(xué)作為免疫學(xué)教學(xué)的重要環(huán)節(jié)，直接影響大人才的培養(yǎng)目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)，特別是在培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)態(tài)度、實(shí)踐技能、創(chuàng)新能力方面，具有重要的地位。一醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求 醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)課程的開(kāi)設(shè)，目的在于不僅使學(xué)生驗(yàn)證部分

2、理論知識(shí)和加深對(duì)課堂講授內(nèi)容的理解，更重要的是在掌握系統(tǒng)理論知識(shí)的基礎(chǔ)上，學(xué)習(xí)和掌握免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本技術(shù)和技能，培養(yǎng)學(xué)生觀察、思考、分析和解決問(wèn)題的能力，以及嚴(yán)肅認(rèn)真的科學(xué)態(tài)度和創(chuàng)新精神，提高學(xué)生的綜合素質(zhì)。1基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn) 要求學(xué)生系統(tǒng)學(xué)習(xí)和掌握常用的經(jīng)典免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)方法和現(xiàn)代免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，使學(xué)生理解和鞏固所學(xué)的理論知識(shí)，掌握相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)技能。2綜合性實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容涉及本課程的綜合知識(shí)或相關(guān)課程知識(shí)的實(shí)驗(yàn)，往往由多種實(shí)驗(yàn)手段、技術(shù)和層次的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容所組成。通過(guò)綜合性實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步訓(xùn)練學(xué)生對(duì)所學(xué)知識(shí)和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的綜合運(yùn)用能力、獨(dú)立工作能力和對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的綜合分析能力。3設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn) 是在完成基礎(chǔ)性試

3、驗(yàn)和綜合性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，給定實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、要求和所提供的?shí)驗(yàn)條件，由學(xué)生自行查閱資料，自選題目、設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，并在老師指導(dǎo)下，進(jìn)行試驗(yàn)，最后以論文形式寫出實(shí)驗(yàn)報(bào)告。目的在于激發(fā)學(xué)生的創(chuàng)新性思維，培養(yǎng)學(xué)生的科研能力，提高學(xué)生的綜合素質(zhì)。二醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則1學(xué)生在上實(shí)驗(yàn)課前，應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容進(jìn)行預(yù)習(xí)，明確實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⒁?，了解?shí)驗(yàn)原理和操作步驟，熟悉所要使用的儀器、藥品的性質(zhì)和注意事項(xiàng)，預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2注意保持科學(xué)實(shí)驗(yàn)的嚴(yán)肅性、嚴(yán)格性和嚴(yán)密性。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，應(yīng)仔細(xì)認(rèn)真地觀察教師的演示，嚴(yán)肅認(rèn)真地按規(guī)定步驟進(jìn)行操作。3仔細(xì)、耐心地觀察實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)的各種現(xiàn)象，及時(shí)、真實(shí)客觀地記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并積極思考，認(rèn)真分

4、析，得出結(jié)論。4積極參與小組設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，樹(shù)立團(tuán)隊(duì)精神，并發(fā)揮自己的聰明才智，創(chuàng)造性地開(kāi)展科學(xué)實(shí)驗(yàn)。5實(shí)驗(yàn)所用的儀器、器材和試劑須按照要求擺放，嚴(yán)格按照操作程序進(jìn)行操作，保證實(shí)驗(yàn)過(guò)程順利進(jìn)行，并取得預(yù)期結(jié)果。6要愛(ài)護(hù)公共財(cái)物，節(jié)約試劑材料，不得將實(shí)驗(yàn)室任何物品私自帶走。如將儀器、器材損壞，應(yīng)及時(shí)報(bào)告教師，并登記備案。7實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)保持安靜，遵守紀(jì)律，不得高聲談笑、隨便走動(dòng)、玩弄?jiǎng)游铩?實(shí)驗(yàn)室內(nèi)禁止吸煙、進(jìn)食、飲水、用嘴習(xí)習(xí)管及濕潤(rùn)標(biāo)簽，不準(zhǔn)隨地吐痰。9如有傳染性材料、有毒材料流灑與桌面、地面或衣服上，或發(fā)現(xiàn)割破皮膚、被動(dòng)物咬傷等意外時(shí)，要及時(shí)報(bào)告教師，做好妥善處理。10實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)清理實(shí)驗(yàn)用品，物

5、歸原處。實(shí)驗(yàn)廢棄物應(yīng)放入或倒入指定的地方或容器內(nèi)。服從衛(wèi)生值日安排，認(rèn)真負(fù)責(zé)地做好清潔衛(wèi)生。11離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室前應(yīng)洗手，注意關(guān)好水、電、門、窗等。12認(rèn)真填寫實(shí)驗(yàn)記錄，按時(shí)提交實(shí)驗(yàn)報(bào)告。第一章基礎(chǔ)性試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)一 免疫血清的制備免疫血清是機(jī)體受到抗原物質(zhì)刺激后的血清，含有特異性免疫球蛋白?？芍苯討?yīng)用于病原的診斷或感染性疾病的緊急預(yù)防和治療；也可通過(guò)純化血清中的免疫球蛋白來(lái)制作多種與免疫相關(guān)或不相關(guān)疾病的診斷和治療制劑。免疫血清又稱抗血清或抗體，而從抗血清中純化的免疫球蛋白則只能稱為抗體。在傳統(tǒng)的免疫學(xué)方法中，尤其是作細(xì)菌的血清學(xué)鑒定時(shí)，抗血清即能滿足要求，無(wú)需純化，因?yàn)榧兓倪^(guò)程將造成免疫球蛋白的丟

6、失。但在現(xiàn)代免疫學(xué)方法中，由于免疫標(biāo)記和反應(yīng)精確度的需要，必須純化抗血清的有效成分，即獲得免疫球蛋白甚至是某一類或亞類的免疫球蛋白。 抗體的制備大致包括三個(gè)階段，即抗原的制備與純化、動(dòng)物免疫和血清分離純化與鑒定?？乖侵苽淇贵w的先決條件，要制備高質(zhì)量的抗體，必須首先獲得特異性高的抗原性物質(zhì)?？贵w制備的方案視抗原的性質(zhì)不同而異?！灸康囊蟆勘緦?shí)驗(yàn)制備抗人全血清和傷寒沙門菌O抗體,要求掌握免疫血清制備的原理及其方法步驟?！緦?shí)驗(yàn)原理】 用抗原刺激機(jī)體可以使機(jī)體產(chǎn)生抗體，抗原與抗體是一對(duì)概念，抗原的純度和活性，影響著其免疫動(dòng)物后獲得的抗體的特異性和滴度。根據(jù)抗體產(chǎn)生的一般規(guī)律，視抗原的性質(zhì)選擇不同的途

7、徑免疫動(dòng)物，經(jīng)初次、再次免疫的過(guò)程，使得動(dòng)物血清中產(chǎn)生足量的特異性抗體，繼而分離血清并純化免疫球蛋白，得到免疫血清或抗體。 【器材試劑】1.抗原與免疫對(duì)象 細(xì)菌菌種(傷寒沙門菌O901)、混合人全血清、健康家兔。2.福氏佐劑 福氏不完全佐劑：稱取羊毛脂5g，逐滴加入石蠟油20ml（羊毛脂:石蠟油可為1:11:4），高壓滅菌后4保存?zhèn)溆?。福氏完全佐劑：于不完全佐劑中加入卡介?20mg/ml，研缽中研磨乳化后即為完全佐劑，冰箱保存?zhèn)溆谩?.生理鹽水、麥?zhǔn)媳葷峁堋⒏视?、防腐劑?.02疊氮鈉或0.01硫柳汞）等。4.剪刀、鑷子、注射器、研缽、試管等器材和冰箱、離心機(jī)等儀器 ?！痉椒ú襟E】1.傷寒沙

8、門菌O 抗體的制備 傷寒沙門菌O 抗原的制備：經(jīng)革蘭染色作細(xì)菌純度鑒定的傷寒沙門菌O901，密集劃線接種于普通瓊脂平板（若需大量制備，可接種于用柯氏瓶制備的瓊脂培養(yǎng)基），37培養(yǎng)2448h后，用生理鹽水將細(xì)菌菌苔洗于清潔、無(wú)菌的三角燒瓶中，置60水浴或隔水煮沸1h以破壞細(xì)菌的鞭毛，用濾紙過(guò)濾（大量制備時(shí)）或移入離心管4000r/min離心1020min（少量時(shí)）。將濾過(guò)的菌液接種少量于瓊脂平板進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn)（37，24h），確定無(wú)菌后用生理鹽水調(diào)整菌液濃度至109個(gè)/ml，此為細(xì)菌O抗原，置4保存?zhèn)溆?。若制備鞭毛抗原，則可用含有5石炭酸（苯酚）的生理鹽水洗下瓊脂平板上的菌苔，37溫育48h后作無(wú)

9、菌試驗(yàn)，濾過(guò)后用生理鹽水配成一定濃度。 傷寒沙門菌O 抗原免疫方案：用于免疫動(dòng)物的菌液濃度視菌種的不同而異，傷寒沙門菌、志賀痢疾菌等腸道桿菌，免疫濃度多為109個(gè)/ml左右。細(xì)菌性抗原的免疫方案大致相同，見(jiàn)表11 表11 傷寒沙門菌O抗原的免疫方案免疫日期（天）免疫途徑抗原免疫劑量（ml）1多點(diǎn)皮內(nèi)傷寒沙門O抗原1.06靜脈傷寒沙門O抗原0.511靜脈傷寒沙門O抗原0.516靜脈傷寒沙門O抗原1.019靜脈傷寒沙門O抗原2.0 試血：末次免疫7d后即可試血，耳靜脈或心臟采血，分離血清與傷寒沙門菌O抗原作試管凝集試驗(yàn)，凝集效價(jià)（滴度）在1:16003200之間時(shí)即可放血，若效價(jià)較低可繼續(xù)加強(qiáng)免疫

10、。 放血：勁動(dòng)脈放血（也可心臟采血），以最大限度的獲得血清。2.抗人全血清的制備 抗原-福氏完全佐劑：取混合人全血清，用生理鹽水作1:4稀釋。將稀釋血清按與完全佐劑1:1體積的比例混合，制成油包水狀態(tài)。具體方法如下：1)研磨法：取完全佐劑置于無(wú)菌研缽中，然后逐滴加入稀釋混合人血清，邊加邊研磨，直至滴一滴至水中不散開(kāi)為止，此即完全乳化的油包水狀態(tài)。若系不完全佐劑，則像加入人全血清那樣，按220mg/ml的量加入卡介苗。2)注射器法：即用兩個(gè)注射器對(duì)接，使佐劑與抗原往返推拉，以至乳化。另外，也可將佐劑置磁力攪拌器上，邊攪拌，邊滴加抗原并繼續(xù)攪拌，使其完全乳化。 抗原-福氏完全佐劑免疫動(dòng)物：取健康家

11、兔，用剪刀減去家兔雙后足足掌的毛，碘酒和酒精棉球消毒。每只足掌注射抗原-福氏完全佐劑0.5ml ,每只家兔注射量1ml。兩周后，再于腘窩淋巴結(jié)內(nèi)注射抗原-福氏完全佐劑，每側(cè)注射量仍為0.5ml 。 無(wú)佐劑的人血清加強(qiáng)免疫：上述免疫一周后，耳靜脈注射人血清（1:2稀釋）0.5ml 左右以加強(qiáng)免疫,如此重復(fù)12次，并于最后一次注射一周后采血。 試血：采血方法同傷寒沙門菌O抗血清制備。試血時(shí)，環(huán)狀沉淀測(cè)定的抗體效價(jià)達(dá)到1:5000，雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)效價(jià)達(dá)到1:16以上即可放血收集血清。如效價(jià)不夠，可追加免疫。 抗血清采集：頸動(dòng)脈放血或心臟采血獲得的兔血，置37促進(jìn)血塊收縮，并用毛細(xì)吸管吸取血清，經(jīng)3

12、000r /min離心去除殘留的紅細(xì)胞。3.抗血清的鑒定 獲得的免疫血清需要進(jìn)行特異性檢測(cè)、親和力測(cè)定和效價(jià)滴定。針對(duì)顆粒性抗原的免疫血清效價(jià)，可通過(guò)凝集或溶細(xì)胞試驗(yàn)（如溶血素效價(jià)滴定）檢測(cè)。可溶性抗原相應(yīng)抗體的效價(jià)和純度多選用環(huán)狀沉淀、瓊脂擴(kuò)散和免疫電泳的方法檢測(cè)。酶免疫測(cè)定、放射免疫分析及平衡透析等方法，可用于抗體的特異性和親和力測(cè)定?？寡彖b定的方法詳見(jiàn)后述相應(yīng)實(shí)驗(yàn)。4抗血清的純化 更加精細(xì)的免疫試驗(yàn)需要從抗血清中提取免疫球蛋白，此過(guò)程稱為抗血清的純化。純化的步驟為：50%飽和硫酸銨鹽析以沉淀血清球蛋白，應(yīng)用透析或分子篩法除鹽。除鹽后的球蛋白過(guò)陰離子交換柱（DEAE-纖維素），根據(jù)不同類

13、別免疫球蛋白的等電點(diǎn)，選用不同pH和離子強(qiáng)度的緩沖液分別洗脫之；高滲或風(fēng)于法濃縮免疫球蛋白，若使用冷凍干燥器則可獲得干燥制品。5抗血清的保存 抗體的保存以濃度2030mg/ml為宜，加入萬(wàn)分之一的硫柳汞或千分之一的疊氮鈉防腐，并加入等量的中性甘油，分裝小瓶，20以下保存，數(shù)月至數(shù)年內(nèi)抗體效價(jià)無(wú)明顯改變?！窘Y(jié)果分析】抗原免疫動(dòng)物后獲得的抗血清，效價(jià)可用上述相應(yīng)試驗(yàn)判斷；其特異性則可通過(guò)雙擴(kuò)，免疫電泳或交叉凝集試驗(yàn)進(jìn)行考察。各試驗(yàn)結(jié)果的觀察和判斷參見(jiàn)響應(yīng)單元。此外，抗血清的外觀應(yīng)該為澄清，力求無(wú)溶血。無(wú)血液有型成分殘留和無(wú)細(xì)菌等微生物污染?！咀⒁馐马?xiàng)】1、動(dòng)物的選擇 免疫血清的制備多選用家兔為免疫

14、對(duì)象，若系大量制備或二抗種屬特異性的需要，也可選用羊或馬。應(yīng)用的動(dòng)物必須健康，且以雄性為佳。為了避免個(gè)體差異，每種抗原最好免疫3只以上動(dòng)物。2抗原的準(zhǔn)備 全血清抗愿應(yīng)該選擇3人以上混合血清，以避免個(gè)體差異性；血清應(yīng)新鮮，以保持血清中各成分的活性。在細(xì)菌性抗原制備過(guò)程中，應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌操作，保證其純度和避免對(duì)實(shí)驗(yàn)者的感染。3佐劑的準(zhǔn)備與使用 佐劑應(yīng)用于可溶性抗原的免疫，顆粒性抗原的免疫無(wú)需佐劑。佐劑與抗原混合研磨時(shí)，應(yīng)充分乳化，否則難以達(dá)到預(yù)期的免疫效果。在使用佐劑-抗原時(shí)，若難以吸入注射器，則可將連同裝有佐劑的容器置熱水上加熱，并選用較粗的注射針頭。注射完畢后，剩余佐劑-抗原置4保存。4免疫程序并

15、非固定不變，一般而言，不與佐劑一同免疫的抗原，免疫間隔時(shí)間較短，可每隔23天免疫一次。由于佐劑具有緩釋作用，于佐劑一起免疫的抗原可隔12周。無(wú)論有無(wú)佐劑，最后一次免疫一周后采取血清。加強(qiáng)免疫的劑量一般為首次劑量的1/52/5。如需制備高度特異性的抗血清，可選用低劑量抗原短程免疫；若欲得到高效價(jià)的抗血清，則宜采用大劑量抗原長(zhǎng)程免疫。由于免疫期限及間隔時(shí)間較長(zhǎng)，要注意脫敏，尤其在進(jìn)行靜脈免疫時(shí)。脫敏的原則是少量多次注射抗原，例如，在靜脈注入抗原前，先將抗原少量注入腹腔，lh后再作緩慢靜脈注射。 實(shí)驗(yàn)二 凝集反應(yīng) 細(xì)菌和紅細(xì)胞等顆粒性抗原，當(dāng)與相應(yīng)抗體特異結(jié)合后，在適量電解質(zhì)存在的條件下，可逐漸聚集

16、，出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象稱為凝集反應(yīng)。反應(yīng)中的抗原稱為凝集原（agglutinogen），抗體稱為凝集素（agglutinin）。反應(yīng)過(guò)程可分為兩階段：抗原抗體的特異結(jié)合；出現(xiàn)可見(jiàn)的顆粒凝集。凝集試驗(yàn)既是一個(gè)定性的檢測(cè)方法，即根據(jù)凝集現(xiàn)象的出現(xiàn)與否判定結(jié)果陽(yáng)性或陰性；也是一個(gè)半定量的檢測(cè)方法，即將標(biāo)本作一系列對(duì)倍稀釋后進(jìn)行反應(yīng)，以出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)的最高稀釋度作為滴度。由于凝集反應(yīng)方法簡(jiǎn)便，敏感度高，因而在臨床檢驗(yàn)中被廣泛應(yīng)用。凝集反應(yīng)可分為直接凝集反應(yīng)和間接凝集反應(yīng)兩大類。通過(guò)以下實(shí)驗(yàn)的實(shí)踐，掌握各種凝集反應(yīng)的原理，熟悉方法步驟、結(jié)果判斷以及注意事項(xiàng)。 一 直接凝集反應(yīng) 直接凝集（direct a

17、gglutination）反應(yīng)是指細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒性抗原，在適量電解質(zhì)參與下，直接與相應(yīng)抗體結(jié)合而出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。常用的凝集試驗(yàn)有玻片法和試管法兩種。 （一）玻片凝集試驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)原理】玻片凝集試驗(yàn)（slide agglutination test）多用作定性試驗(yàn)。一般是用1滴已知診斷血清與1滴受檢菌液或細(xì)胞懸液，在玻片上混勻后，短時(shí)間內(nèi)用肉眼觀察結(jié)果。出現(xiàn)顆粒凝集的為陽(yáng)性反應(yīng)。此法簡(jiǎn)便、快速，適用于從病人標(biāo)本中分離得到的菌種的診斷或分型。也常用于紅細(xì)胞ABO血型的鑒定?！酒鞑脑噭?標(biāo)本 任一常見(jiàn)細(xì)菌的平板或斜面培養(yǎng)物；待測(cè)血清2試劑 與細(xì)菌相對(duì)應(yīng)的診斷血清（可用生理鹽水作適當(dāng)稀釋，以免發(fā)生前

18、帶現(xiàn)象）、生理鹽水、已知沙門傷寒菌菌體抗原懸液（7×108/ml）、傷寒沙門菌O抗血清。方法步驟（以鑒定待測(cè)標(biāo)本中的細(xì)菌為例） 1、取潔凈玻片1張，用蠟筆劃分為左右2格。 2、用接種環(huán)按無(wú)菌操作取生理鹽水和已知診斷血清各2環(huán)分別置于左右格內(nèi)。 3、用接種環(huán)取標(biāo)準(zhǔn)菌液少許于左格生理鹽水中混勻， 4、滅菌接種環(huán)，同樣方法取待檢菌液少許于右格診斷血清并混勻。 5、將玻片輕輕晃動(dòng)，室溫下觀察結(jié)果， 【結(jié)果分析】 生理鹽水對(duì)照測(cè)不出現(xiàn)凝集，為均勻混濁的乳狀液。在診斷血清中，細(xì)菌與相應(yīng)抗體反應(yīng)會(huì)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集塊，為陽(yáng)性結(jié)果。如與對(duì)照測(cè)相同不發(fā)生凝集則為陰性?！咀⒁馐马?xiàng)】 1每一待檢菌均需作生

19、理鹽水對(duì)照，以排除當(dāng)細(xì)菌發(fā)生SR變異時(shí)的細(xì)菌自凝，保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。2在載波片兩端涂布細(xì)菌時(shí)，應(yīng)先涂生理鹽水一側(cè)，后涂診斷血清一側(cè)，以免將血清誤帶入生理鹽水一側(cè)3試驗(yàn)后的細(xì)菌仍有傳染性，應(yīng)將玻片放入消毒缸內(nèi)4若作ABO血型鑒定，室溫過(guò)低（10以下）可出現(xiàn)冷凝集，造成假陽(yáng)性結(jié)果。5嚴(yán)格無(wú)菌操作。 （二）試管凝集試驗(yàn)試管凝集試驗(yàn)（tube agglutination test）為半定量試驗(yàn)，在微生物學(xué)檢驗(yàn)中常用已知細(xì)菌作為抗原液與一系列稀釋的受檢血清混合，保溫后觀察每管內(nèi)抗原凝集程度，通常以產(chǎn)生明顯凝集現(xiàn)象的最高稀釋度作為血清中抗體的效價(jià)（titer），亦稱為滴度。在試驗(yàn)中，由于電解質(zhì)濃度和p

20、H不適當(dāng)?shù)仍?，可引起抗原的非特異性凝集，出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)，因此必須設(shè)不加抗體的稀釋液作對(duì)照組。臨床上常用的直接試管凝集試驗(yàn)為肥達(dá)試驗(yàn)（Widal test）和外斐試驗(yàn)（Weil-Felix test）。在輸血時(shí)也常用于受體和供體兩者的紅細(xì)胞和血清的交互配血試驗(yàn)。（方法步驟見(jiàn)肥達(dá)試驗(yàn)） 二 間接凝集反應(yīng) 將可溶性抗原（或抗體）先吸附于適當(dāng)大小的與免疫特異性無(wú)關(guān)的顆粒性載體的表面，形成人工的免疫微球（或致敏載體），然后與相應(yīng)抗體（或抗原）作用，在適宜的電解質(zhì)存在的條件下，出現(xiàn)特異性凝集現(xiàn)象，稱間接凝集反應(yīng)（indirect agglutination）或被動(dòng)凝集反應(yīng)（passive aggluti

21、nation）。這種反應(yīng)適用于各種抗體和可溶性抗原的檢測(cè)，其敏感度高于沉淀反應(yīng)，因此被廣泛應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)。（一）間接血凝試驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)原理】 血凝試驗(yàn)（hem agglutination test）是紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)的簡(jiǎn)稱。間接血凝試驗(yàn)（indirect hem agglutination test）是將可溶性抗原（細(xì)菌的提取液等）吸附于紅細(xì)胞成為抗原致敏紅細(xì)胞，這種“致敏紅細(xì)胞”與相應(yīng)抗體作用可產(chǎn)生紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象（圖21）。以測(cè)定傷寒血清抗體滴度為例敘述如下： 圖21 間接血凝試驗(yàn)原理示意圖 【器材試劑】1 傷寒桿菌“O”抗原2 傷寒桿菌O901免疫兔血清。3 2%綿羊紅細(xì)胞懸液、生理鹽水、試管、

22、吸管、37水浴箱。4 “O”抗原的制備： 將傷寒桿菌O901接種于柯氏瓶，37培養(yǎng)1824h，用生理鹽水洗下菌苔配制成每毫升含100億細(xì)菌的懸液，置100水中2h，離心沉淀，吸取上清液分裝于無(wú)菌試管，4冰箱保存?zhèn)溆谩? 致敏紅細(xì)胞懸液制備： 取一定稀釋度的抗原（應(yīng)事先滴定）加等量2%綿羊紅細(xì)胞懸液，混合后放入37水浴箱中，每隔15min取出振搖1次，共經(jīng)2h，然后取出，用生理鹽水洗滌3次，再配制成0.25%懸液即成?！痉椒ú襟E】1 取小試管10支，排于試管架上，于第1管中加入生理鹽水0.9ml，其余各管加0.25ml。2 以吸管吸取已加熱滅活的免疫血清0.1ml，加入第1管，混勻后吸取0.75

23、ml，于第2管中加0.25ml，余下0.5ml棄去。3 將第2管血清與鹽水混合后，吸取0.25ml至第3管。如此依次稀釋到第9管，自第9管中吸出0.25ml棄去。第10管不加血清留作對(duì)照。4 于每管加入等量已致敏的0.25%綿羊紅細(xì)胞懸液，混勻后放入37水浴中2h觀察結(jié)果?！窘Y(jié)果分析】凡紅細(xì)胞沉積于管底，集中呈一圓點(diǎn)的為不凝集（一）。如紅細(xì)胞凝集，則分布于管底周圍。根據(jù)紅細(xì)胞凝集的程度判斷陽(yáng)性反應(yīng)的強(qiáng)弱（圖22），以凝集的孔為滴度終點(diǎn)。 ：紅細(xì)胞沉積于管底；：紅細(xì)胞沉積于管底，周圍有散在少量凝集；：紅細(xì)胞形成層凝集，面積較小，邊緣較松散；：紅細(xì)胞形成片層凝集，面積略多于；：紅細(xì)胞形成片層凝集，

24、均勻布滿孔底，或邊緣皺縮如花邊狀呈現(xiàn)明顯血凝（）試管中免疫血清的最高稀釋倍數(shù)，即為該血清的間接血凝效價(jià)?！咀⒁馐马?xiàng)】 參照反向間接血凝試驗(yàn) （二）反向間接血凝試驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)原理】 把純化的抗體吸附于醛化紅細(xì)胞上，即制成抗體致敏的紅細(xì)胞，它能與相應(yīng)可溶性抗原結(jié)合，出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集，此即反向間接血凝試驗(yàn)（reverse indirect hem agglutination test）（圖23）。常用于檢查HBsAg、甲胎蛋白、新型隱球莢膜抗原等可溶性抗原。 圖23 反向間接血凝示意圖 【器材試劑】11:20抗-HBs致敏的醛化紅細(xì)胞，純化的1:20抗-HBs，待檢血清，稀釋液。2配制致敏紅細(xì)胞懸液：于每

25、瓶?jī)龈稍\斷紅細(xì)胞加4ml稀釋液，輕輕旋搖使成均勻紅細(xì)胞懸液，濃度約為0.6%。3“V”型微量血凝板，0.025稀釋棒，微量攪拌器，刻度吸管，滴管（40滴/ml）?！痉椒ú襟E】（試驗(yàn)加樣程序見(jiàn)表21）1在“V”型血凝板上，每份待檢血清設(shè)立8孔，于各孔內(nèi)用40滴/ml滴管各加1滴稀釋液（相當(dāng)于0.025ml）。2用0.025ml容量的稀釋棒蘸滿待檢血清分別依次在各孔內(nèi)捻轉(zhuǎn)作倍比稀釋（一般每孔均需捻轉(zhuǎn)10次左右），直至第7孔、第8孔為致敏紅細(xì)胞對(duì)照。另設(shè)第9孔為陽(yáng)性對(duì)照，加0.025mlHBsAg陽(yáng)性血清。3于每孔中加入0.025ml混勻的致敏紅細(xì)胞懸液。依照表214將血凝板置于微型振蕩器上振蕩12

26、min，置371h后觀察結(jié)果。 表21 反向間接血凝試驗(yàn)加樣程序孔號(hào)123456789生理鹽水0.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.025 待檢血清0.0250.0250.0250.0250.0250.0250.025陽(yáng)性血清致敏紅細(xì)胞0.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.0250.025血清稀釋度1:41:81:161:321:64 1:1281:256紅細(xì)胞對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照 37h觀察結(jié)果 【結(jié)果分析】不凝集：紅細(xì)胞全部下沉，集中于孔底，形成致密的圓點(diǎn)。明顯凝集（+）：紅細(xì)胞于孔底形成簿膜狀凝集，中央可見(jiàn)疏松的紅

27、點(diǎn)。出現(xiàn)明顯凝集的血清最高稀釋度即為HbsAg效價(jià)，凡效價(jià)>1:16者需進(jìn)一步做中和試驗(yàn)。中和試驗(yàn)： 在血凝板上每份標(biāo)本設(shè)測(cè)定排與對(duì)照排，每排8孔，于每孔加稀釋液0.025ml，用2只稀釋棒蘸取被檢血清，分別在第2排作倍比稀釋至第7孔，第8孔不含血清，為紅細(xì)胞對(duì)照。然后，于測(cè)定排各孔加稀釋液0.025ml，對(duì)照排各孔加1:20抗-HBs0.025ml。12min后，血凝板置3730min。取出，于各孔加0.025ml致敏紅細(xì)胞振搖混勻，置371h后觀察結(jié)果。【注意事項(xiàng)】1致敏的新鮮紅細(xì)胞保存時(shí)間短，且易變脆、溶血和污染，所以配制的致敏紅細(xì)胞懸液一般在當(dāng)天用完，若置210，使用期不超過(guò)3d

28、。若想長(zhǎng)期保存而不溶血，可在致敏前先將紅細(xì)胞醛化。常用的醛類有甲醛、戊二醛、丙酮醛等。紅細(xì)胞經(jīng)醛化后體積略有增大，兩面突起呈圓盤狀。2試驗(yàn)用的血凝板、滴管、稀釋棒等器材必須十分清潔，否則易造成非特異性凝集。3血凝板、稀釋棒用后均需用體積分?jǐn)?shù)為10%次氯酸鈉浸過(guò)夜；滴管需煮佛10min，然后用水沖凈，再用蒸餾水沖洗，晾干備用。4致敏用的抗原或抗體要求純度高，并保持良好的免疫活性。 （三）膠乳凝集抑制試驗(yàn)在呈陽(yáng)性反應(yīng)的乳膠集凝試驗(yàn)中，若先將待測(cè)抗原（抗體）與已知的抗體（抗原）混合，隔一定時(shí)間后再加入抗原（抗體）致敏的乳膠顆粒，此時(shí)，通過(guò)觀察原有的陽(yáng)性試驗(yàn)結(jié)果是否轉(zhuǎn)陰而得出結(jié)果（圖24），此為膠乳凝

29、集抑制試驗(yàn)（indirect agglutination inhibition test）。本次實(shí)驗(yàn)以臨床上常用的檢測(cè)絨毛膜促性腺激素（HCG）的妊娠試驗(yàn)（preg- nancy testing）為例。圖24 間接凝集抑制試驗(yàn)原理示意圖【實(shí)驗(yàn)原理】 將含有可溶性抗原的待測(cè)標(biāo)本先與已知抗體混合，充分作用后再加入抗原致敏的乳膠顆粒，因抗體已與標(biāo)本中的可溶性抗原結(jié)合，乳膠顆粒不再出現(xiàn)可見(jiàn)凝集現(xiàn)象?！酒鞑脑噭?HCG致敏乳膠試劑 妊娠診斷試劑（有商品出售）。2抗HCG抗體 與妊娠診斷試劑配套供應(yīng)。3孕婦尿液、正常人尿液、待測(cè)尿液均可臨床篩選獲得。4生理鹽水、黑色方格反應(yīng)板、牙簽、毛細(xì)滴管、刻度吸管、

30、試管、水浴箱等等?！痉椒ú襟E】1、在黑色方格反應(yīng)板上取3 個(gè)格，用毛細(xì)滴管分別加待測(cè)尿液，、孕婦尿液、正常人尿液（或生理鹽水）1滴，然后每格加抗HCG抗體1滴，分別用牙簽混勻后連續(xù)搖動(dòng)12min。2、于上述3格每格加HCG致敏乳膠試劑1滴，分別用牙簽混勻后，連續(xù)搖動(dòng)23min后觀察結(jié)果?！窘Y(jié)果分析】 如試驗(yàn)格出現(xiàn)明顯凝集為陰性反應(yīng)，即HCG陰性；不出現(xiàn)明顯凝集者為陽(yáng)性反應(yīng)，即HCG陽(yáng)性?！咀⒁馐马?xiàng)】1、乳膠抗原使用前一定要搖勻。2、放置時(shí)間不應(yīng)過(guò)長(zhǎng)，一般不超過(guò)5min。3、注意不出現(xiàn)凝集為陽(yáng)性，出現(xiàn)凝集為陰性。4、測(cè)定HCG時(shí)最好取晨尿，待測(cè)標(biāo)本如試劑的加入順序應(yīng)遵守規(guī)定的步驟，否則無(wú)法判斷結(jié)

31、果。 （四）金黃色葡萄球菌A蛋白協(xié)同凝集試驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)原理】 金黃色葡萄的細(xì)胞壁成分中，含有一種稱為A蛋白的抗原物質(zhì)（SPA）能與人及多種哺乳動(dòng)物IgG的Fc段發(fā)生非特異性結(jié)合，因此可利用金黃色葡萄球菌為載體吸附IgG。當(dāng)SPA與IgG相應(yīng)結(jié)合后有抗體活性的Fab段暴露于SPA菌表面，此時(shí)若有與該IgG相應(yīng)的特異性抗原存在時(shí)，則可發(fā)生凝集反應(yīng)，即為金黃色葡萄球菌A蛋白協(xié)同凝集試驗(yàn)（staphylococcal protein A co agglutination test）（圖25）。本試驗(yàn)是反向間接凝集試驗(yàn)的一種，特異性及敏感性均高，主要用于檢測(cè)可溶性微量抗原。圖25 協(xié)同凝集試驗(yàn)原理示意圖 【

32、器材試劑】1、流行腦膜炎病人腦脊液（用前經(jīng)煮沸處理2min，并適當(dāng)稀釋）。2、A群腦膜炎球菌家兔免疫血清（用前經(jīng)5630min滅活）。3、SPA菌穩(wěn)定液。制備過(guò)程為：選取能產(chǎn)生SPA的金黃色葡萄球菌Cowan I株接種在瓊脂斜面培養(yǎng)基上，37孵育1824h，。用少量PBS洗下菌苔，以3000r/min離心30min，其沉淀物用PBS洗2次，然后以含0.5%福爾馬林0.01mol/LPBS制成10%懸液，置室溫作用6h或過(guò)夜。再將此懸液加熱5630min，迅速冷卻，再以PBS洗3次，最后用含0.05%0.1%NaN3的PBS制成10%懸液，置4冰箱保存?zhèn)溆谩?、抗體標(biāo)記SPA菌的制備 將SPA菌

33、穩(wěn)定液用PBS洗1次后，再用PBS制成2%的懸液，用PBS將免疫血清稀釋成適宜濃度，一般可將測(cè)定合適的稀釋度減少半倍（如適宜濃度為1:8，則實(shí)際應(yīng)用為1:6）。將2%SPA菌穩(wěn)定液與稀釋免疫血清等量混合，置37水浴中30min（也可置4冰箱過(guò)夜）。取出混合液后，以3000r/min離心30min，棄上清，其沉淀物用PBS洗2次，然后用含0.05%0.1%NaN3，制成2%懸液，放4冰箱保存?zhèn)溆茫话憧杀４?個(gè)月左右，其敏感性不變?！痉椒ú襟E】1取潔凈玻片1張，將其分為3大格，第1格及第2格先各加1滴抗體標(biāo)記SPA菌液，第3格加1滴未經(jīng)抗體標(biāo)記的葡萄球菌菌液。2然后第1格及第3格各加1滴病人腦脊

34、液，第2格加1滴生理鹽水。3分別用牙簽混合均勻并不斷搖動(dòng)玻片，在日光燈下觀察結(jié)果，一般在幾分鐘內(nèi)出現(xiàn)反應(yīng)。分析各格反應(yīng)有何不同，并作出判斷。【結(jié)果分析】 第1格內(nèi)形成白色凝集物，第2、3格內(nèi)無(wú)凝集?！咀⒁馐马?xiàng)】 1、用前仔細(xì)檢查試劑本身有無(wú)自凝顆粒。2、本試驗(yàn)的特異性取決于標(biāo)記用抗血清的特異性，凝集反應(yīng)的強(qiáng)弱取決于抗血清的效價(jià)高低，故應(yīng)選用特異性強(qiáng)和效價(jià)高的抗血清 實(shí)驗(yàn)三 沉淀反應(yīng) 一 環(huán)狀沉淀實(shí)驗(yàn) 【目的要求】要求掌握實(shí)驗(yàn)原理，熟悉其方法步驟，了解其檢測(cè)意義。實(shí)驗(yàn)原理可溶性抗原（如血清、細(xì)菌浸出液、毒素等）和相應(yīng)抗體在適當(dāng)?shù)臈l件下可發(fā)生結(jié)合，經(jīng)過(guò)一定的時(shí)間，在二者比例適當(dāng)時(shí)形成肉眼可見(jiàn)的沉淀

35、物，稱為沉淀反應(yīng)（precipitation）。環(huán)狀沉淀實(shí)驗(yàn)是把可溶性抗原小心加入已含抗體溶液的環(huán)狀沉淀管液面上，當(dāng)對(duì)應(yīng)的抗原與抗體相遇，在二者交界面處可出現(xiàn)乳白色環(huán)狀沉淀物，即為環(huán)狀沉淀陽(yáng)性反應(yīng)?！酒鞑脑噭?標(biāo)本 人待檢血清 2試劑 稀釋雞血清、抗人血清、生理鹽水 3器材 沉淀小管（內(nèi)徑1.53mm）或小試管、毛細(xì)吸管、試管架等 【方法步驟】 1取3支沉淀小管，排列于試管架并作好標(biāo)記； 2在1號(hào)、2號(hào)兩支試管內(nèi)分別加入抗人血清0.4ml，3號(hào)試管內(nèi)加入0.4ml生理鹽水作為對(duì)照； 3再在1號(hào)、3號(hào)試管內(nèi)分別加入人待檢血清0.2ml，2號(hào)試管內(nèi)加入雞血清0.2ml； 4室溫靜置10分鐘，觀察

36、結(jié)果。 【結(jié)果分析】11號(hào)試管兩液面交界處出現(xiàn)乳白色沉淀環(huán)，為環(huán)狀沉淀試驗(yàn)陽(yáng)性，2號(hào)和3號(hào)試管為陰性。2由于沉淀反應(yīng)抗原多系膠體溶液，沉淀物主要是由抗體蛋白所組成，為求得抗原與抗體的適宜比例，故操作中通常是稀釋抗原而不稀釋抗體，并以抗原的稀釋度作為沉淀反應(yīng)的效價(jià)。3本試驗(yàn)常用于抗原的定性試驗(yàn)，如診斷炭疽的Ascoli 試驗(yàn)、血跡的鑒別等?！咀⒁馐马?xiàng)】1加抗原時(shí)應(yīng)使沉淀管傾斜，使其緩慢由管壁流下，輕浮于抗體上面，勿使相混，避免氣泡產(chǎn)生。2觀察結(jié)果時(shí)將沉淀管平放在眼前，如在沉淀管后面襯以黑紙或手指，使光線從斜上方射入兩液面膠結(jié)處，則能更清楚地看到沉淀環(huán)。 二 雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn) 【目的要求】要求掌握

37、試驗(yàn)原理、結(jié)果分析，熟悉其方法步驟?！緦?shí)驗(yàn)原理】 將對(duì)應(yīng)的抗原與抗體放在瓊脂凝膠板中的相應(yīng)孔內(nèi)，讓二者在凝膠中自由擴(kuò)散。當(dāng)二者相遇時(shí)發(fā)生特異性反應(yīng)，在濃度比例合適處形成可見(jiàn)的白色沉淀線。若同時(shí)含有多種抗原抗體系統(tǒng)，根據(jù)抗原與抗體的性質(zhì)、純度和比例的不同，沉淀線的形狀、位置和數(shù)量不一。 【器材試劑】1標(biāo)本 待檢人血清、陽(yáng)性對(duì)照血清。 2試劑 羊抗人IgG診斷血清、15g/L鹽水瓊脂等。 3器材 載玻片、吸管、打孔器、濕盒、微量加樣器等。 【方法步驟】1澆板 用粗孔吸管吸取熔化的15g/L鹽水瓊脂4.5ml ,澆注于潔凈載玻片上，要均勻、平整、無(wú)氣泡、布滿整個(gè)玻片。2打孔 待瓊脂凝固后，用直徑3m

38、m的打孔器打孔，使孔間距為4 5mm。臨床常用的孔型為梅花形，中間為抗體孔，四周等距排列6個(gè)抗原孔。3加樣 用微量加樣器向中央孔加入抗體（羊抗人IgG診斷血清），周圍孔加入待測(cè)抗原，其中第1、4孔加入陽(yáng)性對(duì)照血清，第2、3、5、6孔分別加入不同的待檢血清。如用于檢測(cè)抗體特異性時(shí)，中央孔加抗血清，四周孔加入不同的有關(guān)抗原。如進(jìn)行抗體效價(jià)滴定時(shí)，則在中央孔加入抗原，四周孔加入不同稀釋的抗血清。4擴(kuò)散 將加好樣的瓊脂板放入濕盒中（內(nèi)有5mol/L的石炭酸紗布），置室溫或3712d，于24h和48h各觀察和記錄結(jié)果一次?！窘Y(jié)果分析】1如果凝膠中出現(xiàn)白色沉淀線，說(shuō)明抗原與抗體相對(duì)應(yīng)。若抗原與抗體只含單一

39、的成分則形成一條沉淀線；若含多種成分，可形成多條沉淀線。沉淀線的位置因抗原和抗體的分子量、濃度比例、擴(kuò)散速度等因素不同而異。另外，若相臨抗原濃度相等，可出現(xiàn)對(duì)稱相融的沉淀線；若不等，沉淀線移向低濃度一邊。2在梅花孔型中，若相臨兩條沉淀線完全融合，說(shuō)明兩抗原部分相同；若相臨沉淀線發(fā)生交叉，說(shuō)明兩抗原完全相同。3陽(yáng)性結(jié)果多在24h以內(nèi)出現(xiàn)，48h不出現(xiàn)沉淀線可判為陰性結(jié)果。放置過(guò)久可使沉淀線消失。4此方法簡(jiǎn)便易行，結(jié)果穩(wěn)定可靠；但靈敏度低，試驗(yàn)所需時(shí)間長(zhǎng)，且只能定性，不能定量，僅適用于大量普查項(xiàng)目?！咀⒁馐马?xiàng)】1所用載玻片要潔凈、邊緣無(wú)破損，否則難以澆制瓊脂板。2緩沖瓊脂的溫度要適宜，溫度過(guò)高澆板

40、時(shí)易外溢，同時(shí)表面蒸發(fā)量大，瓊脂板光潔度差；但溫度過(guò)低則瓊脂凝固過(guò)快，制板厚度不均勻，表面不光滑。3澆制瓊脂板時(shí)動(dòng)作要迅速，過(guò)于緩慢容易邊加邊凝，使瓊脂板凹凸不平。4打孔時(shí)要小心，勿使瓊脂層脫離載玻片或瓊脂板底層開(kāi)裂，以免加樣時(shí)順裂縫或底部散失。一旦出現(xiàn)裂縫或脫離現(xiàn)象，可向孔內(nèi)滴加少許溫瓊脂加以彌補(bǔ)或?qū)傊逶诨鹧娓咛巵?lái)回通過(guò)幾次補(bǔ)底。5為了使沉淀線保持清晰度，可在加樣完畢將瓊脂板置37下進(jìn)行擴(kuò)散，形成沉淀線后置室溫或4冰箱為佳。 三 單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn) 【目的要】求要求掌握試驗(yàn)原理、熟悉試驗(yàn)方法及結(jié)果分析，了解其臨床意義?！緦?shí)驗(yàn)原理】 將一定量抗體混勻于瓊脂凝膠內(nèi)，凝膠孔中加入抗原，抗原向四周

41、擴(kuò)散的過(guò)程中與凝膠中的抗體發(fā)生反應(yīng)，在抗原與抗體比例合適處形成抗原抗體復(fù)合物，呈現(xiàn)白色沉淀環(huán)。沉淀環(huán)直徑的大小與孔中抗原濃度成正比。如預(yù)先用已知不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，可從已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待檢標(biāo)本中抗原的含量。 【器材試劑】1標(biāo)本 待檢人血清、免疫球蛋白工作標(biāo)準(zhǔn)（IgG含量10mg/ml）。2試劑 羊抗人IgG診斷血清（單擴(kuò)效價(jià)160）、15g/L鹽水瓊脂。3器材 三角燒瓶、載玻片、打孔器、吸管、滴管、濕盒、水浴箱、微量加樣器和半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙等?！痉椒ú襟E】1瓊脂準(zhǔn)備 吸取已熔化瓊脂59ml于三角燒瓶中，置56水浴保溫，將預(yù)溫的羊抗人IgG診斷血清1ml與瓊脂充分混合，繼續(xù)保溫于56

42、備用。如果羊抗人IgG診斷血清的單擴(kuò)效價(jià)不是160，試驗(yàn)時(shí)所需瓊脂量與抗體量的比例應(yīng)加以調(diào)整。2澆板 取混有抗血清的瓊脂液4.5ml澆注于載玻片上，注意澆板要均勻、平整、無(wú)氣泡、布滿整張載玻片。3打孔 待瓊脂凝固后，用打孔器打孔，孔徑3.5mm，孔距1012mm。孔要打得圓整光滑，邊緣不要破裂，底部不要與載玻片脫離。如有脫離應(yīng)注意補(bǔ)底。4加樣 將待檢血清用生理鹽水做140稀釋，用微量加樣器取稀釋血清10l加入相應(yīng)的試驗(yàn)孔內(nèi)，每份標(biāo)本加兩孔。如同時(shí)測(cè)定多個(gè)標(biāo)本，注意做好標(biāo)記，認(rèn)真記錄，不要搞混。另外，取免疫球蛋白工作標(biāo)準(zhǔn)1支加0.5ml 蒸餾水溶解，用生理鹽水稀釋成如下濃度：110、116、12

43、0、132、140，分別加入另一套孔中，每孔中加10l，用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。5擴(kuò)散 將加樣完畢的瓊脂放于濕盒中，置室溫或37 24h后觀察結(jié)果。6繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 以各稀釋度工作標(biāo)準(zhǔn)的沉淀環(huán)直徑為橫坐標(biāo)，相應(yīng)孔中IgG含量為縱坐標(biāo)，在半數(shù)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?！窘Y(jié)果分析】1精確測(cè)量各試驗(yàn)孔沉淀環(huán)直徑，如果沉淀環(huán)不太圓，則取最大直徑和最小直徑的平均值。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相對(duì)應(yīng)的IgG含量，乘以稀釋倍數(shù)，即為待檢血清中IgG的實(shí)際含量。2瓊脂單擴(kuò)散試驗(yàn)為定量測(cè)定法，常用于血清中IgG、IgA、IgM、補(bǔ)體、白蛋白、蛋白酶等物質(zhì)的定量測(cè)定，為臨床診斷提供參考指標(biāo)。3本方法比較穩(wěn)定，易于操作；但觀察結(jié)果需時(shí)間長(zhǎng)，

44、敏感度偏低，每次試驗(yàn)均需做參考血清的標(biāo)準(zhǔn)曲線。【注意事項(xiàng)】1澆制瓊脂板的事項(xiàng)同凝膠雙擴(kuò)散試驗(yàn)。2每批試驗(yàn)均應(yīng)同步繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。即檢測(cè)待檢血清所用瓊脂板應(yīng)和繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線采用的瓊脂板為同一批瓊脂板。3瓊脂熔化后置水浴中保溫時(shí)，溫度不可超過(guò)56，否則會(huì)使抗體變性；溫度也不可過(guò)低，否則瓊脂易凝固而不能澆制出很好的瓊脂板。 四 對(duì)流免疫電泳 【目的要求】本實(shí)驗(yàn)以測(cè)定血清中AFP為例，要求掌握實(shí)驗(yàn)原理、熟悉操作過(guò)程和結(jié)果分析；了解臨床應(yīng)用及意義。【實(shí)驗(yàn)原理】對(duì)流免疫電泳實(shí)質(zhì)上是定向加速的電泳技術(shù)與免疫雙擴(kuò)散技術(shù)的結(jié)合。在偏堿性的緩沖液環(huán)境和適當(dāng)?shù)闹绷麟妶?chǎng)中，大部分抗原帶有較多的負(fù)電荷，電泳力大于電滲力，向

45、正極移動(dòng)；而抗體（尤其是IgG）在同樣的環(huán)境中帶負(fù)電荷較少，而且其分子量又較大，加上凝膠內(nèi)較強(qiáng)的電滲作用，故抗體電泳力小于電滲力，向負(fù)極移動(dòng)。試驗(yàn)中將抗原放負(fù)極，抗體放正極，在一定的時(shí)間內(nèi)（約3090min），移動(dòng)的抗原與抗體在兩孔間相遇并發(fā)生反應(yīng)，在濃度比例適當(dāng)時(shí)形成沉淀線。【器材試劑】1標(biāo)本 待測(cè)人血清、陽(yáng)性對(duì)照血清。2試劑 AFP診斷血清、pH8.6 0.05mol/L巴比妥緩沖液、15g/L瓊脂（用pH8.6 0.05mol/L巴比妥溶液配制）。3器材 電泳槽、電泳儀、孔型模板、打孔器、載玻片、吸管、微量加樣器、吸球、濾紙或紗布條等?！痉椒ú襟E】1制板 用粗孔吸管吸取已熔化好的巴比妥瓊

46、脂4.5ml加到潔凈載玻片上澆制成瓊脂板。 2打孔 待瓊脂凝固后成對(duì)打孔，孔徑為3mm，孔距為5mm。 3加樣 做好抗原和抗體的標(biāo)記（例如在無(wú)關(guān)緊要的邊緣打一小孔等），按標(biāo)記分別加入抗原、抗體及陽(yáng)性對(duì)照。4電泳 將加樣完畢的瓊脂板置電泳槽的支架上，抗原孔置陰極端，抗體孔置陽(yáng)極端，電泳槽內(nèi)加0.05mol/L PH8.6的巴比妥緩沖液，液面至槽高2/3處，瓊脂板兩端用濾紙條或紗布條與緩沖液相連。接通電源，控制電流強(qiáng)度在2.53.5mA/cm板寬。電泳3090min后切斷電源，取出瓊脂板觀察結(jié)果。 【結(jié)果分析】1待測(cè)孔與抗血清之間出現(xiàn)沉淀線為陽(yáng)性，否則為陰性。2陽(yáng)性結(jié)果的沉淀線位置與抗原和抗體分子

47、的電荷情況有關(guān)，也與抗原和抗體的濃度比例有一定關(guān)系。3對(duì)流免疫電泳實(shí)際上是電場(chǎng)作用下的瓊脂雙擴(kuò)散試驗(yàn)，操作簡(jiǎn)便，觀察結(jié)果快，敏感度比瓊脂雙擴(kuò)散法高816倍。制作瓊脂板時(shí)必須選擇高電滲作用的普通瓊脂，還要選擇高特異性、高親和力的抗體，否則結(jié)果難以解釋。4該方法可用于抗原的半定量測(cè)定或根據(jù)沉淀線的位置、形狀做抗原和抗體相對(duì)濃度的分析。但分辯率較差，當(dāng)有多種抗原抗體系統(tǒng)存在時(shí)，形成的沉淀線常形成重疊，難以分辯清楚，所以用作此目的時(shí)，反倒不如瓊脂雙擴(kuò)散試驗(yàn)。【注意事項(xiàng)】1澆制瓊脂板的注意事項(xiàng)同瓊脂雙擴(kuò)散試驗(yàn)。2搭橋時(shí)應(yīng)注意與凝膠接觸緊密，否則會(huì)使電流不均勻，致使沉淀線歪斜、不均勻。3電泳時(shí)抗原、抗體電

48、極方向不可放反。4電泳時(shí)間和電流強(qiáng)度及孔間距有關(guān)，電泳時(shí)電流不可太大，以免蛋白質(zhì)變性，孔間距如果較大應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)電泳時(shí)間。5電泳完畢，先斷電源（不僅關(guān)閉電源按鈕，一定要脫開(kāi)電泳槽和電泳儀之間的連接線，以防積蓄電壓觸電），再取出電泳板。6抗體或抗原要根據(jù)所標(biāo)效價(jià)做適當(dāng)稀釋，多做幾個(gè)稀釋度，選擇最適的比例關(guān)系。 五 火箭電泳 【目的要求】要求掌握火箭電泳的原理，熟悉其操作方法，了解其應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)原理將凝膠單擴(kuò)散的瓊脂板置人直流電場(chǎng)，板孔中的抗原因帶有負(fù)電荷會(huì)在含有抗體的離子瓊脂中向正極泳動(dòng)，并于比例合適處與抗體發(fā)生反應(yīng)，在泳道上形成可見(jiàn)的沉淀帶。泳動(dòng)中的抗原濃度越來(lái)越小，沉淀帶越來(lái)越窄，直至全部抗原與

49、抗體結(jié)合，形成一個(gè)錐形的沉淀峰。整個(gè)沉淀帶的形狀呈火箭樣，故名火箭電泳。抗原含量越高，所形成的火箭峰就越長(zhǎng)。將沉淀峰與事先用已知不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，即可得出標(biāo)本中抗原的含量。 【器材試劑】 1標(biāo)本 待檢人血清、陽(yáng)性血清(臍帶血清)。 2試劑 抗AFP抗體、pH8.6 0.05molL巴比妥緩沖液、精制瓊脂粉或瓊脂糖等。 3器材 電泳槽、電泳儀、打孔器、水浴箱、玻璃板、吸管、三角燒瓶和微量加樣器等。 【方法步驟】 1常規(guī)配制pH8.6 0.05molL巴比妥緩沖液，稱取1.5g精制瓊脂粉或瓊脂糖加到100ml緩沖液中，在三角燒瓶?jī)?nèi)加熱熔化。 2將熔化好的瓊脂置56恒溫水浴中預(yù)溫

50、，待溫度平衡(瓊脂膠溫度為56)后，將抗AFP抗體加到瓊脂液中，二者比例為130。搖勻后迅速澆制瓊脂板。 3待瓊脂凝固后在瓊脂板的一端(距板端約5mm)打孔，孔徑3mm，孔間距68mm，孔的數(shù)目根據(jù)需要而定。 4向每孔加入不同稀釋度的待檢血清，其稀釋倍數(shù)分別是5、10、20、40、80。另外，向另一板的孔中加入系列已知濃度的陽(yáng)性血清或其他抗原，用來(lái)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 5電泳槽內(nèi)加入pH8.6 0.05molL巴比妥緩沖液至槽高的23處。將加樣完畢的瓊脂板置電泳槽的支架上，將打孔加樣端置陰極，用濾紙或紗布條將凝膠板與電泳液相連。接通電源，調(diào)整電流強(qiáng)度在24mAcm板寬。電泳12h可見(jiàn)火箭峰的出現(xiàn)。

51、6電泳結(jié)束后，切斷電源，取下瓊脂板，如沉淀峰清晰可見(jiàn)，可直接判讀結(jié)果，否則將瓊脂板浸入10gL鞣酸生理鹽水中10分鐘，可使沉淀峰更明顯。如欲永久保留，可將瓊脂板進(jìn)行染色干燥處理。 【結(jié)果分析】 1首先測(cè)量已知抗原的火箭峰高度，以此為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)濃度為縱坐標(biāo)作圖，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測(cè)樣品的定量可根據(jù)峰高從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出。 2火箭峰高度與孔中抗原濃度呈正相關(guān)，與凝膠中抗體濃度呈負(fù)相關(guān)。但抗原濃度過(guò)高則在瓊脂板上看不到峰頂；而抗體濃度過(guò)高則沉淀峰太低，降低試驗(yàn)的敏感度。 3沉淀峰呈尖角狀表示無(wú)游離抗原，泳動(dòng)已到終點(diǎn)；前端呈鈍圓形或云霧狀則表示還未到終點(diǎn)，應(yīng)繼續(xù)電泳。 4用多價(jià)抗血清時(shí)每個(gè)火箭可出現(xiàn)

52、多個(gè)子峰；抗原與抗體比例不適合或電泳條件不適當(dāng)時(shí)不出現(xiàn)火箭峰。 5與前述幾個(gè)電泳方法相比，火箭電泳操作簡(jiǎn)便省時(shí)，結(jié)果重復(fù)性好，檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.3gm1。6如在抗原標(biāo)本中加入微量放射性核素，電泳后具有放射性的沉淀帶在暗室中可使膠片感光，感光峰比凝膠中肉眼可見(jiàn)的火箭峰高得多此法稱火箭電泳放射自顯影，檢測(cè)靈敏度可提高4060倍。 【注意事項(xiàng)】 1凝膠單擴(kuò)散中的注意事項(xiàng)在此均適用，例如加入抗體時(shí)要嚴(yán)格掌握瓊脂膠的溫度，抗原與抗體的濃度應(yīng)預(yù)先試驗(yàn)。 2應(yīng)選擇電滲作用最小的精制瓊脂粉或優(yōu)質(zhì)瓊脂糖來(lái)制備凝膠，而不用普通瓊脂。 3打孔完畢，可先將瓊脂板放在電泳槽上，低電流通電后再加樣，加樣后立即加大電流。這

53、樣可防止抗原液向孔四周擴(kuò)散，使火箭峰形狀良好，敏感性增加。這一做法適用于所有打孔加樣的凝膠電泳。使用低電壓、低離子強(qiáng)度、電泳時(shí)間長(zhǎng)些，效果會(huì)更好。4火箭電泳適用于測(cè)定那些在pH8.6以上環(huán)境中帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，IgG、IgA等在pH8.6條件下凈電荷幾乎等于零，因此要使IgG、IgA等在電場(chǎng)中也向正極泳動(dòng)，應(yīng)先經(jīng)乙?；?、甲酰化或氨甲?；幚韥?lái)增加它們的負(fù)電荷。甲?；姆椒ǎ喝〈龣z血清若干，用0.36甲醛稀釋至分析要求的濃度，室溫30min，即可使蛋白質(zhì)分子中的氨基與甲醛發(fā)生縮合反應(yīng)，該反應(yīng)抑制了蛋白質(zhì)分子中堿性基團(tuán)的解離，使其形成某種酸，因此在pH8.6的堿性條件下增加了其負(fù)電荷量。 六 免疫

54、電泳 【目的要求】本試驗(yàn)以鑒定人血清IgG提取物的純度為例，掌握免疫電泳的原理，熟悉操作方法，了解結(jié)果分析及臨床應(yīng)用?！緦?shí)驗(yàn)原理】免疫電泳(immunoeletrophoresis，IEP)是瓊脂區(qū)帶電泳和凝膠雙擴(kuò)散相結(jié)合的一種免疫技術(shù)。試驗(yàn)時(shí)先進(jìn)行瓊脂凝膠電泳，將樣品中不同分子量和不同電荷的組分分離成若干區(qū)帶；然后與電泳方向平行挖一小槽，加入含相應(yīng)抗體的免疫血清，與已分離的各抗原成分在瓊脂中作雙向免疫擴(kuò)散。各區(qū)帶蛋白在相應(yīng)位置與抗體形成弧形沉淀線。根據(jù)沉淀弧的位置、數(shù)量和形態(tài)，可分析樣品中所含抗原成分及其性質(zhì)。 【器材試劑】 1標(biāo)本 正常人血清、待鑒定的人IgG提取液。 2試劑 兔抗人全血清、pH8.6 0.05molL巴比妥緩沖液、12gL瓊脂巴比妥液 凝膠、凝膠指示劑(葡萄糖0.5g和氨基黑10B 0.1g溶于20ml巴比妥緩沖液中)等。 3器材 電泳儀、電泳槽、37溫箱、恒溫水浴箱、水平臺(tái)、載玻片、吸管、3mm打孔器、孔型樣板、尖頭棉簽棒、毛細(xì)滴管、手術(shù)刀片、濕盒等。 【方法步驟】 1瓊脂板制備 加熱熔化巴比妥瓊脂膠，用粗口吸管吸取4ml瓊脂膠，澆注到置于水平臺(tái)上的潔凈載玻片上。凝固后按孔型樣板打孔、開(kāi)槽。槽可用刀