《慢病毒轉(zhuǎn)染手冊(cè)》word版參考模板

1、 慢病毒（Lentivirus）載體是以HIV-1（人類免疫缺陷I型病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力。 基本概述慢病毒載體的研究發(fā)展得很快，研究的也非常深入。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞，從而達(dá)到良好的的基因治療效果，在美國已經(jīng)開展了臨床研究，效果非常理想，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。 慢病毒的應(yīng)用目前慢病毒也被廣泛地應(yīng)用于表達(dá)RNAi的研究中。由于有些類型細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效果差，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的si

2、RNA半衰期短，體外合成siRNA對(duì)基因表達(dá)的抑制作用通常是短暫的，因而使其應(yīng)用受到較大的限制。采用事先在體外構(gòu)建能夠表達(dá)siRNA的載體, 然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄siRNA的策略，不但使脂質(zhì)體有效轉(zhuǎn)染的細(xì)胞種類增加，而且對(duì)基因表達(dá)抑制效果也不遜色于體外合成siRNA，在長期穩(wěn)定表達(dá)載體的細(xì)胞中，甚至可以發(fā)揮長期阻斷基因表達(dá)的作用。在所構(gòu)建的siRNA表達(dá)載體中，是由RNA聚合酶啟動(dòng)子來指導(dǎo)RNA合成的，這是因?yàn)镽NA聚合酶有明確的起始和終止序列，而且合成的RNA不會(huì)帶poly A尾。當(dāng)RNA聚合酶遇到連續(xù)4個(gè)或5個(gè)T時(shí)，它指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄就會(huì)停止，在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3端形成14個(gè)U。U6和H1 RNA啟動(dòng)子

3、是兩種RNA聚合酶依賴的啟動(dòng)子，其特點(diǎn)是啟動(dòng)子自身元素均位于轉(zhuǎn)錄區(qū)的上游，適合于表達(dá)21ntRNA和50ntRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)（stem loop）。在siRNA表達(dá)載體中，構(gòu)成siRNA的正義與反義鏈，可由各自的啟動(dòng)子分別轉(zhuǎn)錄,然后兩條鏈互補(bǔ)結(jié)合形成siRNA；也可由載體直接表達(dá)小發(fā)卡狀RNA(small hairpin RNA, shRNA), 載體包含位于RNA聚合酶啟動(dòng)子和45T轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)之間的莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列，轉(zhuǎn)錄后即可折疊成具有14 個(gè)U 3 突出端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步加工成siRNA。構(gòu)建載體前通常要通過合成siRNA的方法，尋找高效的siRNA，然后從中挑選符合載體要求的序列，

4、將其引入siRNA表達(dá)載體。 慢病毒載體慢病毒載體（Lentiviral vector）較逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有更廣的宿主范圍，慢病毒能夠有效感染非周期性和有絲分裂后的細(xì)胞。慢病毒載體能夠產(chǎn)生表達(dá)shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性細(xì)胞、干細(xì)胞、受精卵以及分化的后代細(xì)胞中表達(dá)shRNA，實(shí)現(xiàn)在多種類型的細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因小鼠中特異而穩(wěn)定的基因表達(dá)的功能性沉默，為在原代的人和動(dòng)物細(xì)胞組織中快速而高效地研究基因功能，以及產(chǎn)生特定基因表達(dá)降低的動(dòng)物提供了可能性。慢病毒作為siRNA的攜帶者，不但具備特異性地使基因表達(dá)沉默的能力，而且充分發(fā)揮了慢病毒載體自身所具備的優(yōu)勢(shì)，為基因功能的研究提供了更強(qiáng)有力的

5、工具。 慢病毒表達(dá)載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質(zhì)?？商峁┧械霓D(zhuǎn)錄并包裝RNA 到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒同時(shí)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中，離心取得上清液后，可以直接用于宿主細(xì)胞的感染，目的基因進(jìn)入到宿主細(xì)胞之后，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，從而高水平的表達(dá)效應(yīng)分子。 慢病毒載體與其它常見病毒載體的特征比較目前常用的病毒載體有腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能感染分裂期細(xì)胞，而且容量有限，腺病毒一般不能整合到染色體上，只能進(jìn)行瞬時(shí)感染。與其它逆

6、轉(zhuǎn)錄病毒相比，慢病毒（LV）具有可以感染非分裂期細(xì)胞、容納外源性基因片段大，可以長期表達(dá)等顯著優(yōu)點(diǎn)。慢病毒不產(chǎn)生任何有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答，可作為一種體外基因運(yùn)輸?shù)墓ぞ?。慢病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)能持續(xù)數(shù)月，且無可觀察到的病理學(xué)現(xiàn)象。1 病毒表達(dá)系統(tǒng)腺病毒表達(dá)系統(tǒng)慢病毒表達(dá)系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒病毒基因組雙鏈DNA病毒RNA病毒RNA病毒是否整合病毒基因組游離于宿主基因組外，瞬時(shí)表達(dá)外源基因病毒基因組整合于宿主基因組，長時(shí)間、穩(wěn)定表達(dá)外源基因病毒基因組整合于宿主基因組，長時(shí)間、穩(wěn)定表達(dá)外源基因感染細(xì)胞類型感染分裂和不分裂細(xì)胞感染分裂和不分裂細(xì)胞感染分裂細(xì)胞，但在干細(xì)胞中表達(dá)效率低表達(dá)豐度高水平表達(dá)高水平表

7、達(dá)高水平表達(dá)表達(dá)時(shí)間快（1-2 天）慢（2-4 天）快（1-2 天）滴度滴度高達(dá)1012pfu/ml最高可達(dá)10910TU/ml最高可達(dá)10910TU/ml克隆容量可插入高達(dá)8kb的外源片段，滴度隨插入片段長度增加而降低可插入不超過8kb的外源片段，滴度隨插入片段長度增加而降低可插入不超過6kb的外源片段免疫原性高免疫原性低免疫原性低免疫原性動(dòng)物模型不能得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，效率達(dá)50以上可以，但很難啟動(dòng)子可以更換特異性啟動(dòng)子可以更換特異性啟動(dòng)子不需要啟動(dòng)子能否用于MIRCORNA可以可以不可以能否用于四環(huán)素誘導(dǎo)不可以TET-ON , TET-OFF不可以系統(tǒng)的目的與意義 對(duì)于一些較

8、難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等,能大大提高目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，而且目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組的幾率大大增加，這就為RNAi,cDNA 克隆以及報(bào)告基因的研究提供了一個(gè)有利的途徑。 進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選； 為活體動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)提供高質(zhì)量的包含目的基因的病毒液； 解決的問題 對(duì)于一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等,能大大提高目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，而且目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組的幾率大大增加，這就為RNAi,cDNA 克隆以及報(bào)告基因的研究提供了一個(gè)有利的途徑。 進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選； 為活體動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)提供高質(zhì)量的包含目的基因的病毒液； 在細(xì)胞相關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作中，對(duì)

9、于一些按常規(guī)方法難以轉(zhuǎn)染甚至無法轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，通過病毒介導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虼蟠筇岣呋虻霓D(zhuǎn)導(dǎo)效率，以達(dá)到目的基因的高效瞬時(shí)表達(dá)。 細(xì)胞相關(guān)的實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?duì)于一些按常規(guī)方法難以轉(zhuǎn)染甚至無法轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，通過病毒介導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虼蟠筇岣呋虻霓D(zhuǎn)導(dǎo)效率，以達(dá)到目的基因的高效瞬時(shí)表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)流程1. 根據(jù)目的基因相關(guān)信息（序列，序列號(hào)等），構(gòu)建含有外源基因或siRNA的重組載體； 2. 對(duì)于測(cè)序正確的重組質(zhì)粒，提取和純化高質(zhì)量的不含內(nèi)毒素的重組質(zhì)粒； 3. 使用高效重組載體和病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，進(jìn)行病毒包裝和生產(chǎn)，收集病毒 液； 4. 濃縮、純化病毒液； 5. 用高質(zhì)量的病毒液感染細(xì)胞； 6. 通過

10、定量PCR精確測(cè)定病毒滴度（高精確滴定方法）和Western 分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果； 7. 用高質(zhì)量的病毒液感染宿主細(xì)胞；檢測(cè)基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用藥物進(jìn) 行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選，通常狀況下，篩選的細(xì)胞克隆株具有長期的表達(dá)穩(wěn)定 性。病毒液足夠用于一般的動(dòng)物活體實(shí)驗(yàn)。 慢病毒使用操作手冊(cè)1慢病毒使用操作 2慢病毒安全使用規(guī)范 3懸浮細(xì)胞感染方法概要 4相關(guān)專業(yè)術(shù)語 5細(xì)胞培養(yǎng)器皿的相關(guān)參數(shù) 1、慢病毒使用操作手冊(cè) 1.1慢病毒的儲(chǔ)存與稀釋: 1.1.1病毒的儲(chǔ)存：用戶收到病毒液后在很短時(shí)間內(nèi)即使用慢病毒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可以將病毒暫時(shí)放置于4 保存；如需長期保存請(qǐng)放置于-80（病毒置于凍存管，

11、并使用封口膜封口） A病毒可以存放于-80 6個(gè)月以上；但如果病毒儲(chǔ)存時(shí)間超過6個(gè)月，我們建議在使用前需要重新滴定病毒滴度 B反復(fù)凍融會(huì)降低病毒滴度：每次凍融會(huì)降低病毒滴度10%；因此在病毒使用過程中應(yīng)僅盡量避免反復(fù)凍融，為避免反復(fù)凍融我們強(qiáng)烈建議客戶收到病毒后按照每次的使用量進(jìn)行分裝。 1.1.2病毒的稀釋：用戶需要稀釋病毒時(shí)，請(qǐng)將病毒取出置于冰浴融解后，使用培養(yǎng)目的細(xì) 胞用PBS或無血清培養(yǎng)基(含血清或含雙抗不影響病毒感染)混勻分裝后4保存(請(qǐng)盡量在三天內(nèi)用完) 分裝后使用。 1.2慢病毒用于體外（In Vitro）實(shí)驗(yàn)：感染培養(yǎng)原代細(xì)胞和建系細(xì)胞 1.2.1慢病毒對(duì)各種細(xì)胞和組織的親嗜性

12、不同，用戶使用Invabio提供的慢病毒之前可以通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，了解慢病毒對(duì)您的目的細(xì)胞的親嗜性，感染復(fù)數(shù)（MOI 值）以及在體（In Vivo）注射所需要的病毒量。如果沒有相關(guān)文獻(xiàn)支持，可以通過感染預(yù)實(shí)驗(yàn)得到合適的感染復(fù)數(shù)（MOI 值）（使用24孔板檢測(cè)病毒對(duì)目的細(xì)胞的親嗜性） 1.2.2慢病毒感染目的細(xì)胞預(yù)實(shí)驗(yàn) 1.2.2.1慢病毒感染目的細(xì)胞預(yù)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) A測(cè)定慢病毒對(duì)目的細(xì)胞的親嗜性時(shí)，需要同時(shí)設(shè)置對(duì)慢病毒親嗜性較高的細(xì)胞(HEK293T，Hela）作為平行實(shí)驗(yàn)的對(duì)照細(xì)胞。 B在進(jìn)行慢病毒感染實(shí)驗(yàn)時(shí),可以用完全培養(yǎng)基（培養(yǎng)目的細(xì)胞用）稀釋；理論上，含有血清，雙抗或者其他營養(yǎng)因子的完

13、全培養(yǎng)基不影響慢病毒的感染效率。 C Invabio提供的病毒單位為TU/ml, 即每毫升中含有具有生物活性的病毒顆粒數(shù)。如： 病毒滴度為>1X108 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1X108個(gè)具有生物活性的慢病毒顆粒。 1.2.2.2以24孔培養(yǎng)板為例，進(jìn)行目的細(xì)胞和HEK293T 細(xì)胞的感染預(yù)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前按照不同的MOI設(shè)置不同的感染孔，并根據(jù)MOI和細(xì)胞數(shù)量計(jì)算所需要的病毒量，如 有必要可以使用PBS溶液或者無血清培養(yǎng)基稀釋病毒原液 第一天，準(zhǔn)備細(xì)胞：在24孔培養(yǎng)板接種若干孔，每個(gè)孔內(nèi)接種35X104個(gè)目的細(xì)胞，鋪板時(shí)細(xì)胞的融合率為50%左右，每孔培養(yǎng)基體積為100 l；進(jìn)行

14、病毒感染時(shí)細(xì)胞的融合度約為 70%左右。 第二天，準(zhǔn)備病毒：取出4保存的病毒，使用臺(tái)式離心機(jī)離心20 秒（使病毒完全懸于 離心管底部即可）；如果是凍存在-80的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可以根據(jù)實(shí)驗(yàn) 室的實(shí)際情況將按照MOI準(zhǔn)確計(jì)算好的慢病毒稀釋到培養(yǎng)基中，并盡可能保證所獲得的含有 慢病毒的培養(yǎng)基的總體積為最小體積，以期獲得最佳的感染效率。 第二天，感染目的細(xì)胞：病毒準(zhǔn)備好之后，從培養(yǎng)箱中拿出細(xì)胞，首先觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，如細(xì)胞狀態(tài)較好則開始實(shí)驗(yàn) a使用移液器吸取準(zhǔn)確體積的病毒液加入準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基 b吸去培養(yǎng)基的培養(yǎng)器皿中的培養(yǎng)基（如果細(xì)胞生長良好，密度適宜，則不用換液） c在目的細(xì)胞和對(duì)照

15、細(xì)胞中分別加入計(jì)算好的病毒液 d混勻后放于二氧化碳培養(yǎng)箱（37、5%CO2）孵育過夜 注：感染前細(xì)胞的狀態(tài)好壞對(duì)最終的感染效果高低影響很大，所以務(wù)必保證加病毒之前細(xì)胞處于良好的生長狀態(tài) 亦可以將預(yù)先準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基和慢病毒的混合液直接加入培養(yǎng)器皿中 慢病毒對(duì)目的細(xì)胞的感染效率較低，通過提高M(jìn)OI 值可以提高病毒的感染效率，但是當(dāng)MOI高于20時(shí)，我們建議客戶在培養(yǎng)基中加入ploybrene（8 g/ml左右）來提高病毒的感染效率。 A第三天，更換培養(yǎng)液：一般在24小時(shí)候后將含有慢病毒的培養(yǎng)液更換成正常培養(yǎng)液；在 感染后觀察細(xì)胞狀態(tài)，如果慢病毒對(duì)細(xì)胞有明顯毒性作用而影響細(xì)胞生長狀態(tài)，可以最 短在加

16、病毒4小時(shí)候更換新鮮培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)（建議在8-12小時(shí)更換為宜）。第一次換 液后，如果慢病毒對(duì)細(xì)胞沒有明顯毒性作用，按照正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)換液。 B第六天，感染效率檢測(cè)：在倒置熒光顯微鏡觀察熒光，估計(jì)慢病毒感染目的細(xì)胞的效率； 如何由于目的基因較大而造成選擇的載體不能攜帶Marker Gene的，可以通過Real-time RT-PCR檢測(cè)目的基因的表達(dá)來拍評(píng)估感染效率。 注意： Invabio提供的病毒載體上帶有GFP 綠色熒光蛋白，用戶可以在病毒感染96小時(shí)后用倒置 熒光顯微鏡觀察GFP 綠色熒光，以觀察病毒對(duì)目的細(xì)胞的感染情況。 如果慢病毒載體攜帶其他Marker Gene如RFPBFP

17、可以用熒光顯微鏡在對(duì)應(yīng)的激發(fā)光波長下觀察熒光表達(dá)的情況 慢病毒表達(dá)時(shí)間較慢，熒光表達(dá)所需時(shí)間較長，建議感染后96小時(shí)后觀測(cè)熒光表達(dá)。感染后的細(xì)胞可以連續(xù)培養(yǎng)一周，通過觀察熒光的表達(dá)時(shí)間和表達(dá)強(qiáng)度來確定慢病毒對(duì)目的細(xì)胞 的感染情況。感染期間請(qǐng)根據(jù)細(xì)胞生長的情況對(duì)細(xì)胞進(jìn)行及時(shí)換液，以保證細(xì)胞良好的生長狀態(tài)。 2、慢病毒使用安全使用規(guī)范 Invabio提供的慢病毒為“自殺”性病毒，即病毒感染目的細(xì)胞后不會(huì)再感染其他細(xì)胞，也不 會(huì)利用宿主細(xì)胞產(chǎn)生新的病毒顆粒。慢病毒中的毒性基因已經(jīng)被剔除并被外源性目的基因所 取代，屬于假型病毒因此沒有毒性作用。但該病毒仍然具有可能的潛在的生物學(xué)危險(xiǎn)， Invabio建

18、議不要使用編碼已知或可能會(huì)致癌的基因的假型病毒。除非已經(jīng)完全公認(rèn)某個(gè)基 因肯定沒有致癌性，否則均不建議采用假型病毒進(jìn)行生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。如有疑問，請(qǐng)與我們聯(lián)系。 使用時(shí)請(qǐng)參照如下所示進(jìn)行實(shí)驗(yàn)： 2.1病毒操作時(shí)最好使用生物安全柜。如果使用普通超凈工作臺(tái)操作病毒， 請(qǐng)不要打開排風(fēng)機(jī)。 2.2病毒操作時(shí)請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服，帶口罩和手套。 2.3操作病毒時(shí)特別小心不要產(chǎn)生氣霧或飛濺。如果操作時(shí)超凈工作臺(tái)有病毒 污染，請(qǐng)立即用70%乙醇加1%的SDS 溶液擦拭干凈。接觸過病毒的槍頭， 離心管，培養(yǎng)板，培養(yǎng)液請(qǐng)于84 消毒液或1%SDS 中浸泡過夜后棄去。 2.4用顯微鏡觀察細(xì)胞感染情況時(shí)應(yīng)遵從以下步驟：擰緊培養(yǎng)瓶或

19、蓋緊培養(yǎng) 板。用70%乙醇清理培養(yǎng)瓶外壁后到顯微鏡處觀察拍照。離開顯微鏡實(shí)驗(yàn) 臺(tái)之前，用70%乙醇清理顯微鏡實(shí)驗(yàn)臺(tái)。 2.5如需要離心，應(yīng)使用密封性好的離心管，或者用封口膜封口后離心， 而且盡量使用組織培養(yǎng)室內(nèi)的離心機(jī)。 2.6脫掉手套后，用肥皂和水清洗雙手。 3、懸浮細(xì)胞感染方法概要 1.1根據(jù)細(xì)胞的量將細(xì)胞在1.5ml 管中離心收集然后用100-200ul 的無血清培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞 沉淀，以細(xì)胞完全浸沒在培養(yǎng)基中為準(zhǔn) 1.2按照MOI 換算病毒顆粒數(shù)量，吸取病毒液加入細(xì)胞中，將1.5ml 管放在37度培養(yǎng)箱 中孵育30 分鐘 1.3將管中混合溶液吸出加到培養(yǎng)皿中或孔里 1.4加入足夠量的新鮮

20、培養(yǎng)液 1.512 小時(shí)后換液 1.696 小時(shí)后觀察細(xì)胞陽性率 4、相關(guān)專業(yè)術(shù)語 （詳情可參考公司網(wǎng)站FAQ） 常用術(shù)語： MOI:病毒感染復(fù)數(shù)傳統(tǒng)的MOI 概念起源于噬菌體感染細(xì)菌的研究。其含義是感染時(shí)噬菌體 與細(xì)菌的數(shù)量比值，也就是平均每個(gè)細(xì)菌感染噬菌體的數(shù)量。噬菌體的數(shù)量單位為pfu。 一般認(rèn)為MOI 是一個(gè)比值，沒有單位，其實(shí)其隱含的單位是pfu number/cell。后來MOI 被 普遍用于病毒感染細(xì)胞的研究中，含義是感染時(shí)病毒與細(xì)胞數(shù)量的比值，本手冊(cè)中提到的 MOI都是沿用這個(gè)概念。 然而，由于病毒的數(shù)量單位有不同的表示方式，從而使MOI 產(chǎn)生了不同的含義。能產(chǎn)生細(xì) 胞裂解效應(yīng)

21、的病毒例如單純皰疹病毒等習(xí)慣上仍用pfu 表示病毒數(shù)量，因此其MOI 的含義 與傳統(tǒng)的概念相同。 MOIstands for "Multiplicity of Infection." It is the ratio of infectiousvirus particles to the number of cells being infected. The recommended MOI isin the range of 0.1 (meaning that you inoculate 1 virus particle for every 10cells) to 0.01.

22、 The general theory behind MOI is to introduce one infectiousvirus particle to every host cell that is present in the culture. However, more than one virus may infect the same cellwhich leaves a percentage of cells uninfected. This occurrence can be reduced by using a higherMOI to ensure that every

23、cell is infected. 5、細(xì)胞培養(yǎng)器皿的相關(guān)參數(shù) Flask/DishSurface (mm)Cell numberMedia Volume96 well plate501.5-5.0×10100 l48 well plate1003.0×104-1.0×10200 l24 well plate2008.0×104-2.0×10500 l12 well plate4011.6-4.0×101.0 ml6 well plate9623.0-8.0×102.0 ml35mm9623.0-8.0×102.0

24、 ml60mm28271.0-2.5×106.0 ml100mm78542.5-6.4×1010.0 ml慢病毒載體的包裝與純化 1實(shí)驗(yàn)流程 制備慢病毒穿梭質(zhì)粒及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒，四種質(zhì)粒載體分別進(jìn)行高純度無內(nèi)毒素抽提，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后8 h 更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h后，收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，對(duì)其濃縮后得到高滴度的慢病毒濃縮液,感染Hela細(xì)胞后定量PCR檢測(cè)病毒滴度。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)對(duì)慢病毒滴度的要求不同，生產(chǎn)過程中可以通過濃縮得到不同滴度的慢病毒顆粒。 2實(shí)驗(yàn)材料 2.1慢病毒載體、包裝細(xì)胞和菌株 慢病毒載體系統(tǒng)（Tronolab）該病毒包裝

25、系統(tǒng)為四質(zhì)粒系統(tǒng)，組成為pRsv-REV， pMDlg-pRRE，pMD2G, 目的干擾質(zhì)粒。其中目的干擾質(zhì)粒能表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）. pRsv-REV， pMDlg-pRRE，pMD2G含有病毒包裝所必須的元件. 細(xì)胞株 293T，慢病毒的包裝細(xì)胞，為貼壁依賴型成上皮樣細(xì)胞，生長培養(yǎng)基為DMEM(含10% FBS)。貼壁細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)生長增殖形成單層細(xì)胞。 菌株 大腸桿菌菌株DH5。用于擴(kuò)增慢病毒載體和輔助包裝載體質(zhì)粒。 2.2主要試劑 試劑名稱 生產(chǎn)廠家 貨號(hào) 包裝細(xì)胞293T細(xì)胞株 中科院上海細(xì)胞所 大腸桿菌菌株DH5 Invitrogen公司 胎牛血清 Invitrogen公司 胰蛋

26、白酶 Invitrogen公司 限制性內(nèi)切酶 Fermentas T4DNA連接酶 NEB公司 M0202V 質(zhì)粒DNA提取試劑盒 Axygen公司 制備感受態(tài)試劑盒 BIOSCIENCES 凝膠回收試劑盒 Qiagen公司 1kb/100bpladder Fermentas 2.3 主要儀器 儀器名稱 生產(chǎn)廠家 貨號(hào) PCR儀 Applied Biosystems公司 電泳儀 Bio-rad公司 熒光倒置顯微鏡 奧林帕斯 冷凍超速離心機(jī) Hitachi 細(xì)胞培養(yǎng)箱 healforce 凝膠成像儀穩(wěn)壓DNA電泳儀 Tianneng 恒溫?fù)u床 上海博訊儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海博訊儀器 移液器 eppendorf 電熱恒溫水浴鍋 上海一