基于FMDV2A新型多基因共表達載體的構建及表達

1、 HYPERLINK javascript:void(0) 國家自然科學基金面上項目(63004601)作者簡介：劉丹清，女，碩士，研究方向：乙肝相關性肝癌機制研究，電話E-mail： HYPERLINK mailto: 通訊作者：廖勇，電話：02363893780，E-mail： HYPERLINK mailto:y8982000 y8982000；任紅，電話：02363693029，E-mail：renhong0531基于FMDV 2A新型多基因共表達載體的構建及表達劉丹清，殷文偉，劉俊英，盛云建，童師雯，湯慧，廖勇，任紅(重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院感染科，重慶醫(yī)科

2、大學病毒性肝炎研究所，重慶4000l0)摘要 目的 構建基于口蹄疫病毒 （Foot-and-mouth disease virus，FMDV) 2A片段的多順反子載體，在293T細胞中實現HBx基因、人Sox2基因及人c-Myc基因的共表達。方法 以FMDV 2A序列連接HBx、帶HA標簽Sox2和c-Myc編碼序列形成一個開放讀碼框（open reading frame ，ORF），化學法合成DNA序列，通過酶切連接構建多基因共表達載體pEGFPC-XSM。應用脂質體將重組質粒pEGFPC-XSM轉染293T細胞，48 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(green fluorescent p

3、rotein，GFP)，Western blot驗證HBx基因、Sox2基因和c-Myc基因的表達。結果 重組質粒pEGFPC-XSM經酶切、測序鑒定，目的序列插入位點及讀碼框正確；轉染48 h后熒光顯微鏡下pEGFP-C1、pEGFPC-XSM組可見GFP表達；Western blot結果表明轉染pEGFPC-XSM的293T細胞高效共表達含GFP標簽的HBx融合蛋白、含HA標簽的Sox2融合蛋白和c-Myc蛋白。結論 成功構建多順反子載體pEGFPC-XSM，利用相同的FMDV 2A序列實現HBx、Sox2和c-Myc蛋白的非融合共表達。關鍵詞 口蹄疫病毒2A；多順反子；共表達；質粒 中圖

4、法分類號 R735.7；R512.6+2Construction of a new vector for the co-expression of multigenes based on FMDV2ALiu Danqing，Yin Wenwei，Liu Junying，Sheng Yunjian，Tong Shiwen，Tang Hui，Liao Yon，Ren Hong（Department of Infectious Diseases of the Second Affiliated Hospital，Institute for Viral Hepatitis，Chongqing Medi

5、cal University， Chongqing，400010，China）Abstract Objective To construct a multicistronic vector for co-expression of HBx gene, human Sox2 gene and human c-Myc gene in 293T cells by using Foot-and-mouth disease virus (FMDV) 2A segment. Methods Sequence of the open reading frame (ORF) composed of codin

6、g sequences of HBx, Sox2 with HA tag and c-Myc connected by FMDV 2A was obtained by chemical synthesis. Multigene expression vector was constructed through restriction enzyme digestion and DNA ligation. The recombinant plasmid pEGFPC-XSM was transferred into 293T cells under the mediation of lipofec

7、tamine. Forty-eight hours after transfection, the expression of green fluorescent protein (GFP) was examined by fluorescence microscopy and the expression of HBx protein, Sox2 protein and c-Myc protein was tested by Western blot. Results The cloning site and reading frame of objective sequence was c

8、onfirmed by restriction endonuclease analysis and DNA sequencingAfter forty-eight hours, GFP was observed in groups transfected with pEGFP-C1 and pEGFPC-XSM. Western blot revealed highly efficient co-expression of GFP-HBX fusion protein, HA-Sox2 fusion protein and c-Myc protein in 293T cells transfe

9、cted with pEGFPC-XSM. Conclusion Multicistronic expression vector pEGFPC-XSM was successfully constructed and the same FMDV 2A sequence facilitate co-expression of HBx, Sox2 and c-Myc independentlyKey words Foot-and-mouth disease virus 2A; Multi-cistron; Plasmid; Co-expressionSupported by the Genera

10、l Program of National Natural Science Foundation of China (63004601)Corresponding author: Liao Yon，Tel: 023 63893780，E-mail： HYPERLINK mailto:y8982000 y8982000；Ren Hong，Tel: 023 63693029， E-mail：renhong0531腫瘤的發(fā)生往往是多基因共同作用的結果，過去人們受限于基因工程技術的發(fā)展，僅能單一地調節(jié)12個基因的表達，對腫瘤進行有限的基因治療和生物醫(yī)學研究。近年來，利用多基因轉化策略從遺傳學角度調控腫

11、瘤相關功能基因高效表達，從而觀察共表達對分化、發(fā)育、病變的影響，已成為當前研究腫瘤發(fā)病機制和基因治療的趨勢 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_1 o Okita K, 2010 #3239 1, HYPERLINK l _ENREF_2 o Szymczak, 2004 #3202 2。目前的多基因共表達策略主要包括：多載體共轉法、構建多啟動子(multiple promotors)載體、構建剪接載體(splicing)、形成融合基因（fusions）、蛋白酶解分離（proteolytic processing）、內部核糖體

12、進入位點(internal ribosome entry site , IRES)連接目的基因、基因之間連接自剪切2A(self-cleavage 2A)元件等（表1）。然而前幾種方法因載體容量有限、工作量大、融合蛋白功能影響、上下游基因表達差異等缺陷逐步被放棄 ADDIN EN.CITE de Felipe2002324433244324417de Felipe, P.University of St. Andrews, Centre for Biomolecular Sciences, St. Andrews, KY16 9ST, Scotland, United Kingdom. pdf

13、st-andrews.ac.ukPolycistronic viral vectorsCurr Gene TherCurr Gene Ther355-78232002/08/23Artificial Gene Fusion*Genetic VectorsHumansPromoter Regions, GeneticProtein Processing, Post-TranslationalRNA SplicingSatellite Viruses/geneticsViruses/*genetics2002Sep1566-5232 (Print)1566-5232 (Linking)121897

14、21/pubmed/12189721eng HYPERLINK l _ENREF_3 o de Felipe, 2002 #3244 3。而FMDV 2A及源于其他病毒的類2A元件，可通過翻譯時自剪切，順式切開前后連接的氨基酸序列，實現上下游蛋白共表達 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_3 o de Felipe, 2002 #3244 3, HYPERLINK l _ENREF_4 o Carey, 2009 #3201 4。FMDV 2A具有結構小、上下游基因表達平衡、剪切效率高等優(yōu)點，因此該元件為多基因協(xié)同作用的生物學

15、效應研究提供了重要途徑。肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，但HCC發(fā)生發(fā)展的生物學機制尚未完全闡明。越來越多的研究表明肝癌的發(fā)生源于肝癌干細胞(liver cancer stem cells，LCSCs)，并與HCC的進展、耐藥、轉移和復發(fā)密切相關 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_5 o Roskams, 2006 #3246 5, HYPERLINK l _ENREF_6 o Yamashita, 2009 #3247 6。對LCSCs起源的假說，有學者認為

16、是已分化成熟的子代細胞再激活干細胞程序轉化而來。而且，最近研究發(fā)現分化成熟的體細胞僅需四個體細胞核再編程因子參與，即Oct3/4, Sox2, c-Myc和KLF4，便可誘導出與胚胎干細胞極其相似的可誘導的多潛能干細胞（induced pluripotent stem cells, iPS cells） ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_7 o Takahashi, 2006 #3252 7。LCSCs與iPS細胞在自我更新、分化潛能和細胞增殖等特征上極其相似。因此，借鑒研究iPS細胞的方法，用核重編程因子Sox2, c-M

17、yc等聯(lián)合HBx或其他致癌基因用于研究HCC具有重要的醫(yī)學意義。本研究使用兩段相同的FMDV 2A序列連接各目的基因形成多順反子，通過重組構建多基因共表達載體pEGFPC-XSM并轉染293T細胞，檢驗FMDV 2A是否能高效自剪切，從而共表達HBx蛋白、Sox2蛋白和c-Myc蛋白，為下一步深入研究HCC奠定基礎。1材料與方法材料1.1.1 主要試劑 大腸桿菌DH5感受態(tài)細胞購至天根生化科技公司，質粒提取試劑盒購至Qiagen。限制性內切酶Bgl II、 Sal I，T4 DNA Ligase購至Thermo scientific，DNA Marker 購至Novoprotein。細胞培養(yǎng)基

18、DMEM購至Thermo scientific，胎牛血清購至Gbico。Lipofectamine TM 2000 reagent購至Invitrogen。小鼠抗Myc單克隆抗體和兔抗HA多克隆抗體購至abcam、兔抗GFP多克隆抗體購至Cell Signaling，小鼠抗HBX單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG、辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG二抗均購至Santa cruz。1.1.2 質粒 pEGFP-C1由本實驗室保存，pCR4TOPO-C0263G為華大基因購買。1.1.3 細胞 293T人胚腎細胞株(下文中簡稱293T細胞) 購至ATCC。1.2方法1.2.1 化學合成由FM

19、DV 2A連接的多順反子序列在NCBI中查找血清型為ayr的HBV基因定位NC_003977，編碼HBx蛋白的cDNA含465個核苷酸。相似的方法查找人Sox2基因及c-Myc基因定位NM_003106和NM_002467，其cDNA分別由954、1320個核苷酸序列組成。根據相關文獻，獲得HA標簽序列和FMDV O1K16型 2A序列 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_8 o Hasegawa, 2007 #3199 8, HYPERLINK l _ENREF_9 o Wang, 2011 #3278 9。以FMDV 2A

20、連接各基因cDNA序列，同時去除其上游cDNA的終止密碼子形成一個ORF，即組合為:HBx-2A-HA-Sox2-2A-c-Myc多順反子。將設計的多順反子序列送華大基因科技公司化學合成。1.2.2 真核表達載體pEGFPC-XSM的構建將pEGFP-C1(4.7kb)及pCR4TOPO-C0263G(7kb)用Bgl II、 Sal I雙酶切后，凝膠回收目的片段與酶切回收的載體pEGFP-C1用T4 DNA連接酶22連接過夜，得到重組質粒pEGFPC-XSM多順反子真核表達載體。將連接產物pEGFPC-XSM熱激轉化入DH5感受態(tài)大腸桿菌，涂布于含卡那霉素（Kanamycin，Kan）50m

21、g/L的LB固體培養(yǎng)基平板上，37，培養(yǎng)過夜，次日，挑取單菌落，提質粒酶切電泳初步篩選檢測后送上海生工生物公司測序鑒定。1.2.3 重組質粒轉染293T細胞 采用含10胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM細胞培養(yǎng)基，在37、5CO2條件下，常規(guī)培養(yǎng)293T細胞。轉染前12小時取呈對數生長的293T細胞接種于6孔板，細胞覆蓋孔面積約50%-60%時用Lipofectamine TM 2000轉染。轉染時Lipofectamine TM 2000：DNA比例為9ul：3ug，分別用250ul的Opti-MEM稀釋混勻后，將質粒與脂質體等比例混勻，室溫下放置15-20

22、min；每孔加入500ul混合物輕輕混勻，于細胞培養(yǎng)箱37、5CO2培養(yǎng)。5小時后移去含Lipofectamine TM 2000的Opti-MEM，用含10 FBS 的DMEM細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。同時以轉染pEGFP-C1和未轉染質粒的細胞作為對照。124 轉染后細胞GFP的表達 轉染48 h后，于暗室熒光顯微鏡下觀察各組細胞GFP表達情況。125 HBx、Sox2和c-Myc蛋白表達的鑒定 移去轉染pEGFPC-XSM質粒的293T細胞株培養(yǎng)液，用冰PBS洗3次，加入蛋白裂解液RIPA 100ul/孔，1ul 100mmol/L的苯甲基磺酰氟（PMSF 100），反應5分鐘后將細胞刮下，繼續(xù)在

23、冰上反應10分鐘。然后，于4，13000rpm/離心30分鐘，取上清進行western blot分析。2結果2.1 化學合成多順反子序列及pEGFPC-XSM的構建設計的多順反子序列HBx-2A-HA-Sox2-2A-c-Myc送深圳華大基因科技公司化學法人工合成，得到質粒pCR4TOPO-C0263G。這樣所得DNA序列準確性高，避免了傳統(tǒng)聚合酶鏈式反應（PCR)多輪擴增可能帶來的錯配，導致基因序列的改變。pCR4TOPO-C0263G經Bgl II和 Sal I雙酶切后可見4kb載體片段及3kb的目的片段，將目的片段定向克隆至Bgl II和 Sal I雙酶切后4.7kb的載體pEGFP-C

24、1中，得到重組質粒pEGFPC-XSM（圖1，圖2A）。圖1 pEGFPC-XSM的構建及2A自剪切介導的多順反子表達Fig.1 Construction of pEGFPC-XSM and multicistronic expression via the 2A-mediated self-cleaving mechanism2.2 多基因共表達載體pEGFPC-XSM的鑒定化學合成的多順反子片段克隆到pEGFP-C1中，構建的重組pEGFPC-XSM多基因共表達載體經Bgl II單酶切和0.7%瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現一長約7.7kb的DNA條帶，Bgl II、 Sal I雙酶切后產生兩條DNA

25、條帶，分別4.7kb和3kb（圖2B）。酶切電泳結果顯示目的序列插入表達載體位點正確。同時，測序結果顯示構建的多基因共表達載體所含目的序列正確（圖3）。圖2 質粒pEGFPC-XSM的構建與鑒定(A) M. DL10 000 DNA Marker；1. pEGFP-C1 Bgl II酶切；2. pEGFP-C1 Bgl II/Sal I酶切；3. pCR4TOPO-C0263G Bgl II酶切；4. pCR4TOPO-C0263G Bgl II/Sal I酶切；5. 陰性對照(B) M. DL10 000 DNA Marker；1. pEGFPC-XSM Bgl II酶切；2. pEGFPC

26、-XSM Bgl II/Sal I酶切；3. 陰性對照Fig.2 Construction and identification of pEGFPC-XSM圖3 測序鑒定pEGFPC-XSMFig.3 Sequencing identify of pEGFPC-XSM2.3 GFP在293T細胞中的表達轉染空質粒pEGFP-C1和重組質粒pEGFPC-XSM 48 h后，熒光顯微鏡下觀察兩組293T細胞均可見特異性的綠色熒光，表明質粒pEGFP-C1和重組質粒pEGFPC-XSM均成功轉染293T細胞，而且轉染重組質粒pEGFPC-XSM的293T細胞表達的GFP結構未被其他共表達蛋白影響（圖

27、4）。未轉染質粒的293T細胞不能觀察到綠色熒光，表明293T未受其他表達綠色熒光的載體污染。圖4 熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白A. 空白對照組 ；B. 空載pEGFP-C1組；C. pEGFPC-XSM組Fig.4 Green fluorescent protein observed by fluorescent microscopy （100）2.4 293T細胞中HBx蛋白、Sox2蛋白及c-Myc蛋白表達的檢測Western blot檢測HBx蛋白的表達結果顯示（圖5A），在轉染多基因共表達質粒pEGFPC-XSM組，可檢測到C-端含2A殘端并含有GFP標簽的HBX融合蛋白條帶，GFP-

28、HBx-2A融合條帶約47kD，而對照、空載pEGFP-C1組沒有表達，空載pEGFP-C1組僅表達27kD的GFP蛋白，GAPDH為內參；同時，在pEGFPC-XSM組中檢測到含HA標簽和2A殘端的Sox2融合蛋白條帶，HA-Sox2-2A蛋白條帶約38kD，對照、空載pEGFP-C1組無表達（圖5B）；檢測c-Myc蛋白的表達結果顯示，對照、空載pEGFP-C1、pEGFPC-XSM組均可見約49kD的c-Myc蛋白條帶，但對照、空載pEGFP-C1組僅微弱表達，pEGFPC-XSM組c-Myc蛋白表達水平明顯高于前兩組（圖5C）。在pEGFPC-XSM組中，各目的蛋白條帶大小與預期結果一

29、致，而且HBx蛋白、Sox2蛋白和c-Myc蛋白條帶表達強度接近，說明FMDV 2A自剪切作用準確，表達蛋白產物較均衡（圖5A，B，C）。在蛋白表達過程中，相同的FMDV 2A序列在同一讀碼框中仍具有高效自剪切活性，2A氨基酸序列連接的上下游蛋白分別表達，剪切作用較完全，僅見極少量大分子多聚蛋白條帶（圖5C）。 A B C圖5 Western blot檢測轉染pEGFPC-XSM后293T細胞中蛋白的表達Fig.5 Protein expression of 293T cells after transfection demonstrated by Western blot討論隨著人類迎來后基

30、因組時代，HCC的研究及治療已逐漸向多基因、多靶點方向發(fā)展。早期研究者探索了各種多基因共表達方法，但很多方法因實驗投入高、效率低而逐漸被放棄（表1）。其中最常用的是多啟動子法，各啟動子分別與不同基因形成獨立的ORF并串聯(lián)于同一個表達載體，但多啟動子占據載體克隆空間，而且啟動子間存在轉錄干擾，使各基因難以有效表達 ADDIN EN.CITE Proudfoot19863231103231323117Proudfoot, N. J.Transcriptional interference and termination between duplicated alpha-globin gene co

31、nstructs suggests a novel mechanism for gene regulationNatureNature562-532260791986/08/07*Gene Expression RegulationGenesGlobins/*geneticsHeLa CellsHumansPromoter Regions, GeneticRNA Polymerase II/genetics*Transcription, Genetic1986Aug 7-130028-0836 (Print)0028-0836 (Linking)3736674/pubmed/373667410

32、.1038/322562a0eng HYPERLINK l _ENREF_10 o Proudfoot, 1986 #3231 10。后來人們把目光聚焦到IRES序列，該序列最初在小核糖核酸病毒(picornavirus)中發(fā)現，IRES在上游啟動子控制下可使與之相連的下游基因轉錄，并以不依賴5端帽子(cap)結構的方式啟動下游基因mRNA的翻譯，從而實現多基因共表達。但是，IRES結構大(0.5 kb)，載體容量往往有限，共表達基因超過2個就相當困難；不依賴帽子結構的翻譯效率低，下游基因表達量僅能達到上游基因的2050，限制了其廣泛應用 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE

33、.DATA HYPERLINK l _ENREF_11 o Mizuguchi, 2000 #3197 11。表1 各種多基因共表達策略比較Tab.1 Comparison of different methods for multigene co-expression多基因共表達策略方法優(yōu)點缺點多載體共轉法多個單基因載體同時轉染靶細胞各基因表達時間及表達量可控工作量大、共表達效率低多啟動子載體多個啟動子分別與不同基因形成獨立ORF，各ORF串聯(lián)于一個表達載體不同種類啟動子協(xié)調各基因表達基因轉錄干擾，啟動子抑制，載體重編構建剪接載體在基因兩端輔以剪接信號序列，轉錄后剪接形成不同的mRNA分別表

34、達各基因剪接信號結構短，減輕載體負擔剪接不可控、表達效率不穩(wěn)定形成融合基因多個目的基因編碼序列融合在同一個ORF，表達融合蛋白操作簡便、目的基因等量表達蛋白功能受影響蛋白酶解分離在各基因間插入蛋白酶特異識別位點，翻譯后蛋白酶切割分離各目的蛋白結構小、各基因表達水平相當蛋白酶不穩(wěn)定，可酶解細胞其他蛋白IRES連接基因IRES序列插入需共表達的目的基因之間確保多基因共表達自身結構較大，載體容量受限；上下游基因表達差異2A自剪切元件2A片段連接各目的基因編碼序列，通過翻譯后自剪切作用使各蛋白分離結構小、剪切效率高、基因高水平共表達少量不完全剪切自剪切2A元件的發(fā)現，為構建共表達三個及以上目的基因的多

35、順反子載體提供了可行性 ADDIN EN.CITE Kaji20093200123200320017Kaji, K.Norrby, K.Paca, A.Mileikovsky, M.Mohseni, P.Woltjen, K.MRC Centre for Regenerative Medicine, Institute for Stem Cell Research, University of Edinburgh, Edinburgh EH9 3JQ, UK. keisuke.kajied.ac.ukVirus-free induction of pluripotency and subseq

36、uent excision of reprogramming factorsNatureNature771-545872392009/03/03AnimalsBiological Markers/analysisCell LineCells, CulturedFibroblasts/cytologyGene Expression ProfilingGenetic Vectors/*geneticsHumansMiceNuclear Reprogramming/*geneticsPluripotent Stem Cells/*cytology/metabolismTransfection/*me

37、thodsTransgenes/genetics2009Apr 91476-4687 (Electronic)0028-0836 (Linking)19252477/pubmed/19252477266791010.1038/nature07864nature07864 piieng HYPERLINK l _ENREF_12 o Kaji, 2009 #3200 12。自剪切2A最早在FMDV中發(fā)現，FMDV編碼外殼蛋白前體（PI-2A)和2BCP3的基因中即含2A序列，轉錄形成一條長的mRNA，可編碼產生PI-2A和2BCP3多聚蛋白，而在翻譯到2A氨基酸序列時以類順式水解酶元件(cis-

38、acting hydrolase element,CHYSEL)發(fā)揮“剪切”作用 ADDIN EN.CITE de Felipe20043253133253325317de Felipe, P.Centre for Biomolecular Sciences, School of Biology, Biomolecular Sciences Building, University of St, Andrews, North Haugh, St, Andrews KY16 9ST, Scotland, UK. pdfst-andrews.ac.uk.Skipping the co-expres

39、sion problem: the new 2A CHYSEL technologyGenet Vaccines TherGenet Vaccines Ther13212004/09/152004Sep 131479-0556 (Print)1479-0556 (Linking)15363111/pubmed/1536311152149710.1186/1479-0556-2-131479-0556-2-13 piiEng HYPERLINK l _ENREF_13 o de Felipe, 2004 #3253 13。但是，與CHYSEL不同，2A分離多聚蛋白的整個過程不需要任何蛋白酶參與。

40、這種剪切效應由2A高度保守的固有基序(Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly-Pro)決定，在翻譯過程中，2A固有序列高級結構阻礙C-端甘氨酸、脯氨酸（Gly、Pro）形成肽鍵，上游蛋白釋放出來，而核糖體能繼續(xù)翻譯下游蛋白 ADDIN EN.CITE Szymczak2004320223202320217Szymczak, A. L.Workman, C. J.Wang, Y.Vignali, K. M.Dilioglou, S.Vanin, E. F.Vignali, D. A.Correction of multi-gene deficiency in vivo usi

41、ng a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vectorNature biotechnologyNature biotechnologyNat Biotechnol589-942252004/04/06Amino Acid SequenceAnimalsCell Line*Genetic VectorsHumansMiceMice, Inbred C57BLMolecular Sequence DataPeptides/chemistry/genetics/*metabolismRetroviridae/*

42、geneticsSequence Homology, Amino Acid2004May1087-0156 (Print)1087-0156 (Linking)15064769/pubmed/1506476910.1038/nbt957nbt957 piieng HYPERLINK l _ENREF_2 o Szymczak, 2004 #3202 2（圖1）。其中，2A氨基酸C-端高度保守序列是高剪切活力的保證。FMDV 基因表達產物中無多聚蛋白前體，即FMDV 2A天然剪切效率可達100%。然而，FMDV 2A元件用于體外多順反子表達載體構建，表達產物不能完全剪切，剪切效率約80%90%以

43、上 ADDIN EN.CITE Mattion19963260143260326017Mattion, N. M.Harnish, E. C.Crowley, J. C.Reilly, P. A.Wyeth-Lederle Vaccines and Pediatrics, Viral Vaccine Research, Pearl River, New York 10965, USA. nmattion.Foot-and-mouth disease virus 2A protease mediates cleavage in attenuated Sabin 3 poliovirus vect

44、ors engineered for delivery of foreign antigensJ VirolJ Virol8124-770111996/11/01Amino Acid SequenceAntigens, Viral/genetics/*metabolismAphthovirus/*enzymology/geneticsCysteine Endopeptidases/genetics/*metabolismGene Transfer TechniquesGenetic Engineering*Genetic VectorsHeLa CellsHumansMolecular Seq

45、uence DataPoliovirus Vaccine, Oral/*geneticsVaccines, Attenuated/*geneticsViral Envelope Proteins/genetics/*metabolism*Viral Proteins1996Nov0022-538X (Print)0022-538X (Linking)8892938/pubmed/8892938190887eng HYPERLINK l _ENREF_14 o Mattion, 1996 #3260 14。Hasegawa等分別用IRES和FMDV 2A連接GFP、RFP基因構建質粒轉染細胞，結

46、果表明IRES下游RFP表達明顯弱于FMDV 2A介導的RFP表達，且FMDV 2A剪切效率超過93%，GFP：RFP蛋白條帶表達強度約為1:1.2 ADDIN EN.CITE Hasegawa2007319983199319917Hasegawa, K.Cowan, A. B.Nakatsuji, N.Suemori, H.Laboratory of Embryonic Stem Cell Research, Stem Cell Research Center, Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University, 53 Kaw

47、aharacho, Shogoin, Sakyo-ku, Kyoto 606-8507, Japan.Efficient multicistronic expression of a transgene in human embryonic stem cellsStem cells (Dayton, Ohio)Stem cells (Dayton, Ohio)Stem Cells1707-122572007/03/31AnimalsEmbryonic Stem Cells/cytology/*metabolismFoot-and-Mouth Disease Virus/genetics*Gen

48、e ExpressionHumansMiceTransgenes/*geneticsViral Proteins/genetics2007Jul1066-5099 (Print)1066-5099 (Linking)17395772/pubmed/173957722006-0813 pii10.1634/stemcells.2006-0813eng HYPERLINK l _ENREF_8 o Hasegawa, 2007 #3199 8。本研究中，Western blot檢測發(fā)現四種表達產物，GFP-HBx融合蛋白、HA-Sox2融合蛋白、c-Myc蛋白及GFP-HBx-2A-HA-Sox2

49、-2A-c-Myc多聚蛋白。表達形成的多聚蛋白產物含量遠遠低于已剪切蛋白，表明FMDV 2A在293T細胞中也能高效自剪切。而多聚蛋白殘留可能是因為2A固有序列周圍氨基酸序列或蛋白質空間結構影響了其自剪切活性。已有實驗證明，改變Gly-Pro剪切位點下游序列并不影響FMDV 2A剪切效率，而改變上游序列則會影響其效率 ADDIN EN.CITE de Felipe19993266153266326617de Felipe, P.Martin, V.Cortes, M. L.Ryan, M.Izquierdo, M.Departamento de Bioquimica y Biologia Mo

50、lecular, Universidad Autonoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Spain.Use of the 2A sequence from foot-and-mouth disease virus in the generation of retroviral vectors for gene therapyGene TherGene Ther198-208621999/08/063T3 CellsAcetyltransferases/geneticsAnimalsAntiviral Agents/pharmacologyAphthovir

51、us/*geneticsBlotting, WesternChimeraGanciclovir/pharmacologyGene ExpressionGenetic Therapy/*methods*Genetic VectorsGenome, ViralHumansMicePlasmidsThymidine Kinase/geneticsTumor Cells, Cultured1999Feb0969-7128 (Print)0969-7128 (Linking)10435104/pubmed/1043510410.1038/sj.gt.3300811eng HYPERLINK l _ENR

52、EF_15 o de Felipe, 1999 #3266 15。實驗結果中，GFP-HBx融合蛋白、HA-Sox2融合蛋白、c-Myc蛋白在表達量上無明顯差異，說明FMDV 2A并非選擇性剪切，上下游基因順序對其活性基本無影響。FMDV 2A構建多順反子表達系統(tǒng)已用于腺病毒（Adenovirus）、逆轉錄病毒（Retroviral）、慢病毒載體（Lentivirus）等，但目前以質粒做載體的多順反子表達系統(tǒng)研究較少 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_2 o Szymczak, 2004 #3202 2, HYPERLINK

53、 l _ENREF_16 o Fang, 2005 #3272 16。本研究以pEGFPC1做載體，巨細胞病毒(Cytomegaoviyns,CMV)啟動子作為調控序列，以完全相同的FMDV 2A元件連接HBx、Sox2和c-Myc的編碼序列形成真核共表達質粒載體。以質粒作載體避免了病毒載體可能導致的隨機整合，引起插入誘變或基因功能障礙。已有研究發(fā)現，在逆轉錄病毒載體中使用相同的2A序列會導致部分基因刪除或載體序列重組 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_2 o Szymczak, 2004 #3202 2, HYPERLIN

54、K l _ENREF_13 o de Felipe, 2004 #3253 13。本研究構建的pEGFPC-XSM多順反子表達載體，經酶切瓊脂糖凝膠電泳及核苷酸測序鑒定，片段大小和目的序列都符合預期，說明pEGFPC-XSM中相同的2A序列并未引起基因刪除或載體重組。本實驗采用化學法人工合成的目的序列避免了傳統(tǒng)PCR多輪擴增可能引起堿基錯配，導致基因序列的改變及翻譯蛋白結構影響。然而，FMDV 2A自剪切形成的C-端氨基酸殘基和N-端Pro是否會影響蛋白生物活性？Varshavsky 等研究表明，N-端連接Pro的蛋白仍然具有生物活性 ADDIN EN.CITE Varshavsky19963

55、274173274327417Varshavsky, A.Division of Biology, California Institute of Technology, Pasadena 91125, USA. varshavskyaThe N-end rule: functions, mysteries, usesProc Natl Acad Sci U S AProc Natl Acad Sci U S A12142-993221996/10/29Acyltransferases/metabolismAmidohydrolases/metabolism*Amino Acid Sequen

56、ceAnimalsEvolution, MolecularFemaleFungal Proteins/chemistry/metabolismGTP-Binding Proteins/chemistry/metabolismHalf-LifeLigases/metabolismMaleMice*Models, Biological*Models, ChemicalProtein ConformationProteins/*metabolismProto-Oncogene Proteins c-mos/metabolismRabbits*Saccharomyces cerevisiae Prot

57、eins*Ubiquitin-Protein Ligases1996Oct 290027-8424 (Print)0027-8424 (Linking)8901547/pubmed/890154737957eng HYPERLINK l _ENREF_17 o Varshavsky, 1996 #3274 17。Furler等證實與2A自剪切C-端氨基酸殘基形成融合蛋白的上游蛋白，其生物活性不受任何影響 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA HYPERLINK l _ENREF_3 o de Felipe, 2002 #3244 3, HYPERLINK l _EN

58、REF_18 o Furler, 2001 #3275 18。而且，隨著抗C-端氨基酸殘基抗體的研發(fā)，2A自剪切C-端殘基可作為標簽抗體用于檢測與之相連的上游蛋白。本實驗將目的基因以完全相同的FMDV 2A序列連接在pEGFP-C1真核表達質粒中，首次實現了HBX、Sox2、c-Myc這三個肝癌相關基因高效共表達，避免了其他方法工作量大，共表達效率低等缺點。FMDV 2A自剪切介導的新型多基因聯(lián)合表達策略高效、簡單、實用、可靠，為下一步探索共表達HBX、Sox2、c-Myc蛋白對細胞生物學影響乃至疾病模型的建立奠定了基礎。參考文獻： ADDIN EN.REFLIST 1Okita K, Hon

59、g H, Takahashi K, et al. Generation of mouse-induced pluripotent stem cells with plasmid vectors J. Nat Protoc, 2010;5(3):418-28.2Szymczak A L, Workman C J, Wang Y, et al. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single self-cleaving 2A peptide-based retroviral vector J. Nat Biotechnol, 2

60、004;22(5):589-94.3de Felipe P. Polycistronic viral vectors J. Curr Gene Ther, 2002;2(3):355-78.4Carey B W, Markoulaki S, Hanna J, et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector J. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009;106(1):157-62.5Roskams T. Liver stem cells an