11種植物提取物對4種病原細菌的抑菌活性篩選

1、11種植物提取物對4種病原細菌的抑菌活性篩選植物源殺菌劑具有選擇性高、環(huán)境友好、對非靶標生物安全、低毒、低殘留 等優(yōu)點，從植物中尋找抑菌活性物質(zhì)，是研發(fā)新型殺菌劑的熱點之一。目前， 中國開發(fā)與應(yīng)用的植物源殺菌劑主要有苦參堿、黃岑苷、小檗堿、丁子香酚、香 芹酚、兒茶素、大蒜素、乙蒜素、大黃素甲醚等。但前述產(chǎn)品多集中于對植物真 菌病害的防治，對植物源殺細菌劑的研究大多側(cè)重于食品污染菌的控制，且大多 數(shù)還處于室內(nèi)篩選階段。魏希穎等研究發(fā)現(xiàn)泡桐花提取液對金黃色葡萄球菌有很 強的抑制作用。葉舟測定了木麻黃(Casuarina equisetifolia Forst)小枝提取 液的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)對大腸桿菌

2、、金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出較強的抑制活性。崔彥 等的研究證明五倍子、丁香、地榆對黃瓜細菌角斑病菌表現(xiàn)出顯著的抑制作用， 其中五倍子提取物的活骨I防效可達60%，具有一定的開發(fā)潛力。李玉玲發(fā)現(xiàn)竹 焦油對甘藍黑腐病菌、番茄細菌性斑點病菌、茄青枯病菌等多種供試細菌都有不 同程度的抑制活性。為了獲得對植物細菌病害有廣泛抑菌譜的植物源物質(zhì)，本研 究選取已報道過的具有廣泛抑菌活性的11種植物提取物，對魔芋軟腐病菌、獼 猴桃潰瘍病菌、核桃黑斑病菌、白菜軟腐病菌4種常見的病原細菌進行室內(nèi)抑菌 活性篩選，旨在為新型植物源殺細菌劑的開發(fā)研究提供線索。1材料與方法1.1材料1.1.1 供試菌種魔芋軟腐病菌(Erwini

3、a carotovora pv. carotovora)、 獼猴桃潰瘍病菌(Pseudomonas syringae pv. actinidiae )、白菜軟腐病菌 (Erwinia carotorora )均由西北農(nóng)林科技大學無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心提供； 核桃細菌性黑斑病菌(Xanthomonas campestris pv. juglandis )由西北農(nóng)林 科技大學林學院提供。1.1.2供試植物源物質(zhì)及試劑大黃提取物（其中大黃素含量為0.30% ）、 博落回提取物（其中血根堿含量為0.57%）、狼毒提取物（其中狼毒素含量為 1.90%）、皂莢提取物（其中皂莢素含量為6.90%）、苦參提取

4、物（其中苦參堿 含量為2.15%）均由山西德威生化有限公司提供。90%的小檗堿、蛇床提取物 （其中蛇床子素的含量為10%）、藜蘆生物堿（其中藜蘆胺含量為2.30%）、 98%的肉桂酸、98%的丁香酚、98%的檸檬酸銅均由西北農(nóng)林科技大學無公害 農(nóng)藥研究服務(wù)中心提供。72%的農(nóng)用鏈霉素購自上海阿拉丁生化科技股份有限公 司。丙酮、葡萄糖、瓊脂粉、氯化納、胰蛋白腺、酒精、牛肉膏、酵母粉均購于 陜西天成化玻有限公司。1.2方法1.2.1培養(yǎng)基配制方法室內(nèi)生測用于細菌性病原菌的培養(yǎng)與保存的固體培 養(yǎng)基（NA）:稱取瓊脂粉15 g、蛋白腺5 g、牛肉膏3 g，加水至1 L，滅菌鍋滅菌待用；用于活化細菌性

5、病原菌菌株的液體培養(yǎng)液（LB）：稱取胰蛋白腺10 g、酵母粉5 g、氯化鈉3 g， 加水至1 L，滅菌鍋滅菌待用。1.2.2藥劑配制采用對供試病菌沒有抑菌作用的丙酮作為溶劑，將供試植 物源物質(zhì)溶解。用20%丙酮-水溶液將各植物源提取物或化合物按其有效成分含 量溶解稀釋成2 000 pg/mL藥液（作為母液備用）。用無菌水將各母液分別依 次2倍稀釋最終確定為1 000、500、250、125、62.5 pg/mL 5個濃度梯度 處理，均以濃度為200 pg/mL的72%農(nóng)用鏈霉素作藥劑對照，采用對供試細菌沒有抑菌作用的20%丙酮-水溶液作為空白對照，每個處理重復(fù)3次，以減少 誤差。1.2.3供試

6、菌種的準備將供試菌種在試驗前1 d轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)液中，置于 28 C恒溫搖床箱中活化12 h。用無菌水調(diào)配成菌液濃度為1x106 CFU/mL , 以供室內(nèi)抑菌活性篩選使用。1.2.4瓊脂擴散法室內(nèi)抑菌活性篩選方法 采用瓊脂擴散法進行室內(nèi)抑菌活 性篩選，將溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基冷卻至45-50 1,加入活化好的細菌數(shù)量大 于106 CFU/mL的供試菌懸液搖勻（成帶菌培養(yǎng)基）。每次取15 mL的帶菌培 養(yǎng)基，分別倒入直徑為9 cm的玻璃培養(yǎng)皿中，制成帶菌平板。待冷卻后用直徑 為9 mm的打孔器在平板上均勻打3個孔，并用接種針挑出孔中培養(yǎng)基，在每 孔內(nèi)加入75 pL配好的供試植物源物質(zhì)，以200

7、pg/mL的農(nóng)用鏈霉素作為藥 劑對照，并以丙酮作為溶劑對照，每組處理重復(fù)3次。置于28 C恒溫培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果，用直尺按十字交叉法測量抑菌圈直徑（減去孔徑9 mm） 求取平均值，進行比較。1.2.5最低有效抑制濃度（MIC ）的測定方法 采用二倍稀釋法測定待測植 物源物質(zhì)的MIC值，取編號為1 11的試管以及適量的蒸餾水，放入滅菌鍋里 滅菌待用。滅菌完成后，取無菌試管，分別往試管內(nèi)加入2 mL無菌水。將2 mL 濃度為2 000 pg/mL待測藥液加入1號試管中，搖勻后，將混合后的藥液2 mL 加入2號試管中，依次操作到10號虎管為止，棄掉10號管中的2 mL藥液，使 各個試管

8、中的藥液體積一樣，將11號管設(shè)為空白對照，加入同等含量丙酮的水 溶液。每種病菌設(shè)3組重復(fù)處理。最后將稀釋好的細菌數(shù)量達104 CFU/mL的 病原菌菌懸液2 mL分別加入1 11號試管中，置于適宜的溫度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待空白對照試管菌液出現(xiàn)渾濁，觀察結(jié)果，進行比較。結(jié)果判斷：由于菌液與藥液等量混合，相當于將藥液二倍稀釋，最終待測藥液為10個濃度梯度，分別為500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9、1.8、0.9 pg/mLo結(jié)果觀察：通過肉眼比對發(fā)現(xiàn)試管內(nèi)液體澄清透明經(jīng)震蕩后仍無沉淀產(chǎn)生， 則此試管對應(yīng)的藥液濃度即為此藥劑對待測病菌的MIC值。1.3數(shù)據(jù)分析利用SPS

9、S 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。2結(jié)果與分析11種植物提取物對4種病原細菌的室內(nèi)抑菌活性篩選2.1.1魔芋軟腐病菌的室內(nèi)抑菌活性篩選采用瓊脂擴散法測定了 11種植 物提取物對魔芋軟腐病菌的抑制活性，結(jié)果表明，供試11種植物提取物對魔芋 軟腐病菌的抑制效果有明顯的差異。大黃、狼毒、博落回提取物、小檗堿、肉桂 酸和藜蘆生物堿6種植物提取物對魔芋軟腐病菌均有不同程度的抑制作用(表 1),皂莢、苦參、蛇床提取物及丁香酚、檸檬酸銅對魔芋軟腐病菌則無明顯抑 制效果。由表1可看出，博落回提取物對魔芋軟腐病菌的抑制作用最強，濃度在 1 000 pg/mL時，抑菌圈直徑最高達(19.30.30 ) mm ;

10、其次是大黃、狼毒 提取物，抑菌圈直徑分別為(17.30.48 )、( 11.90.26 ) mm，均高于或相 當于對照藥劑農(nóng)用鏈霉素200 pg/mL的抑菌圈直徑(12.60.26 ) mm洞時， 小檗堿、藜蘆生物堿的抑菌圈直徑也達到了( 10.00.26 )、( 10.10.34 ) mm , 對魔芋軟腐病抑制作用較好；肉桂酸僅有微弱抑菌活性，其1 000 ?g/mL處理 抑菌直徑僅(0.30.10) mm。2.1.2獼猴桃潰瘍病菌的室內(nèi)抑菌活性篩選 通過對獼猴桃潰瘍病菌的室內(nèi) 活性篩選結(jié)果表明(表2),在濃度為1 000 pg/mL時，大黃和狼毒提取物抑菌圈直徑分別為(13.30.47 )

11、、( 12.20.32 ) mm，均大于對照藥劑農(nóng)用鏈霉素濃度在200 pg/mL時的抑菌圈直徑(12.00.18 ) mm ;博落回、皂莢、 苦參、蛇床提取物對病原菌抑制作用次之，最大抑菌圈直徑在6.7 9.8 mm之 間；檸檬酸銅的最大抑菌圈直徑為(0.20.00 ) mm，抑菌作用較弱；小檗堿、 丁香酚、肉桂酸以及藜蘆生物堿則無明顯抑制效果，故在表2中未列出。2.1.3核桃黑斑病菌的室內(nèi)抑菌活性篩選從表3結(jié)果可看出，蛇床子提取 物對核桃黑斑病菌的抑菌作用最好，在濃度為1 000 g/mL時，抑菌直徑達到 (12.70.13) mm，其次是苦參提取物，抑菌圈直徑為(10.00.23) mm

12、。皂莢提取物、丁香酚、肉桂酸對核桃黑斑病菌也有一定的抑制作用。大黃、博落 回、狼毒提取物、小檗堿、檸檬酸銅以及藜蘆生物堿對核桃黑斑病菌無抑制作用， 在表3中未列出。而藥劑對照鏈霉素在200 ?g/mL時抑菌圈直徑達(17.00.58 ) mm。由此表明，這11種植物提取物對核桃黑斑病菌抑制作用不顯著。2.1.4白菜軟腐病菌的室內(nèi)抑菌活性篩選試驗結(jié)果(表4)表明，在11種 供試植物提取物中，僅苦參提取物、丁香酚和肉桂酸對白菜軟腐病菌有抑菌作用， 而大黃、博落回、狼毒、蛇床子提取物、小檗堿、檸檬酸銅、藜蘆生物堿及皂莢 提取物對白菜軟腐病菌無明顯抑制作用，在表4的抑菌活性篩選的結(jié)果中未列 出；苦參提

13、取物、丁香酚和肉桂酸對白菜軟腐菌均有一定的抑制作用但不顯著， 其最大的抑菌圈直徑均比對照藥劑農(nóng)用鏈霉素在200 ?g/mL時的抑菌圈直徑 小。2.2抑菌活性較好的植物源物質(zhì)的MIC測定結(jié)果5種植物提取物對魔芋軟腐病菌的MIC測定結(jié)果由表5可知，大黃 和博落回提取物對魔芋軟腐病菌的MIC值分別為7.8、15.6 ?g/mL，均顯著低 于對照農(nóng)用鏈霉素的MIC值31.3 ?g/mL。狼毒提取物、小檗堿和藜蘆生物堿的 MIC值分別為125、62.5、250 ?g/mL，表現(xiàn)出一定的抑菌活性，與表1的抑 菌圈試驗結(jié)果基本一致。綜合表1和表5可知，大黃和博落回提取物對魔芋軟 腐病菌的抑菌作用最為顯著，有

14、進一步研究的潛力。同等含量丙酮的水溶液對魔 芋軟腐病菌的MIC值無影響。6種植物提取物對獼猴桃潰瘍病菌的MIC測定結(jié)果 從表6可知，大 黃提取物對獼猴桃潰瘍病菌的MIC值與對照農(nóng)用鏈霉素均為3.9 ?g/mL，表明 獼猴桃潰瘍病菌對大黃提取物比較敏感。其次苦參和狼毒提取物的MIC值均達 到15.6 ?g/mL，皂莢和博落回提取物分別為31.3、250 ?g/mL，與表3的抑 菌活性篩選結(jié)果基本相同。結(jié)合表56可看出，大黃、博落回和狼毒提取物對 魔芋軟腐病菌和獼猴桃潰瘍病菌均有顯著的抑制作用，表現(xiàn)出廣譜的抑菌活性。 同等含量丙酮的水溶液對獼猴桃潰瘍病菌的MIC值無影響。3種植物提取物對核桃黑斑病

15、菌的MIC測定結(jié)果由表7可見，核桃 黑斑病菌對農(nóng)用鏈霉素最敏感，其MIC值為7.8 ?g/mL。皂莢、苦參和蛇床子、 提取物的MIC值分別為15.6、31.3、15.6 ?g/mL,也表現(xiàn)出較好的抑菌活性。 同等含量丙酮的水溶液對核桃黑斑病菌的MIC值無影響。3討論本研究采用瓊脂擴散法、二倍稀釋法對11種植物提取物對魔芋軟腐病菌、 獼猴桃潰瘍病菌、白菜軟腐病菌、核桃細菌性黑斑病菌4種病原細菌的抑菌活性 進行了研究。結(jié)果表明大黃、博落回和狼毒提取物均具有顯著抑制植物病原細菌 的活性，有開發(fā)為新型植物源殺細菌劑的潛力。其中，大黃提取物對魔芋軟腐病 菌和獼猴桃潰瘍病菌的抑制效果最為突出；博落回提取物

16、對魔芋軟腐病菌、狼毒 提取物對獼猴桃潰瘍病菌、蛇床提取物對核桃黑斑病菌的MIC均在20 ?g/mL 以下，與相應(yīng)的對照藥劑農(nóng)用鏈霉素的MIC值相當，有顯著的抑菌活性?？鄥?、 蛇床子和皂莢提取物望寸特定病菌有良好的抑制活性，在殺細菌應(yīng)用上有研究的價 值。狼毒、大黃和博落回提取物在抗細菌作用方面的研究甚少，且多集中于醫(yī)藥、 食品研究。前人的=研究表明，狼毒石油醚提取物的殺煙蚜活性最好；瑞香狼毒 提取物對小菜蛾、枸杞蚜蟲有十分顯著的毒殺活性。南蘋瑤等發(fā)現(xiàn)大黃乙醇提取 物對大腸埃希菌ATCC25922的體外抑菌作用明顯。Hazni等研究結(jié)果顯示，大 黃素對金黃色葡萄球菌、溶血溶血性鏈球菌、肺炎球菌、白喉桿菌、炭疽桿菌、 痢疾桿菌、大腸桿菌、變形桿菌等都有較強的抑制作用；李文娟研究證明瑞香狼 毒(Stellera chamaejasme L.)乙酸乙酯萃取物對金黃色葡萄球菌的抑菌作用 最顯著，其最低抑菌濃度和最低殺菌濃度為0.63 mg/mL ;郁建平研究發(fā)現(xiàn)鹽酸 血根堿具有很強的廣譜抑菌作用，對木霉、根霉、黃曲霉、黑曲霉、米曲霉、毛 霉、酵母的最低抑菌濃度均低于40 ?g/mL。楊軍輝等