LS50熒光分光光度計操作手冊

1、LS-45/55熒光/磷光/發(fā)光分光光度計使用說明書美國PerkinElmer公司王國強(qiáng)黃建權(quán)編譯2002年4月、理論基礎(chǔ)熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光及生物發(fā)光均屬于分子發(fā)光?，F(xiàn)將其原理簡介如下：室溫下，大多數(shù)分子處于基態(tài)的最低振動能層。處于基態(tài)的分子吸收能量后被激發(fā)為激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，將很快衰變到基態(tài)。若返回到基態(tài)時伴隨著光子的輻射，這種現(xiàn)象被稱為“發(fā)光”。每個分子具有一系列嚴(yán)格分立的能級，稱為電子能級，而每個電子能級中又包含了一系列的振動能層和轉(zhuǎn)動能層。圖中基態(tài)用S表示，第一電子激發(fā)單重態(tài)和第二電子激發(fā)單重0態(tài)分別用SS表示，0、1、2、3表示基態(tài)和激發(fā)態(tài)的振動能層（見圖1）,第一、1、2二電

2、子的激發(fā)三重態(tài)分別用T和T表示（見圖2）。12圖1熒光的能級圖VibrationalLevelsofsecondexcitedtateVibrationalLevelsoffirstexcitedstateInternalCcnversianFluofescence(109-W12*6sec)VibrationalLevelsofgroundstateRotationallevelsSfngletsystemso3、化學(xué)發(fā)光及生物發(fā)光的產(chǎn)生某些物質(zhì)在進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)時，由于吸收了反應(yīng)時產(chǎn)生的化學(xué)能，而使反應(yīng)產(chǎn)物分子激發(fā)至激發(fā)態(tài)，受激分子由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時，便發(fā)出了一定波長的光，這種吸收化學(xué)能使分子

3、發(fā)光的過程稱為化學(xué)發(fā)光?；瘜W(xué)發(fā)光也發(fā)生于生命體系，這種發(fā)光被稱為生物發(fā)光。儀器簡介儀器原理Samp：e檢測墨連績光譜連銭英光光譜發(fā)射單色器草一死譜用于測量熒光/磷光/發(fā)光的LS45/55是由圖3所示的五個主要部件組成的：光源、激發(fā)光單色器、樣品池、發(fā)光單色器及檢測器。由光源發(fā)出的光經(jīng)激發(fā)光單色器得到所需要的激發(fā)光波長。如其強(qiáng)度為I,通過樣品0池后，由于一部分光能被熒光物質(zhì)吸收，其透射光強(qiáng)度減為I。熒光物質(zhì)被激發(fā)后，將發(fā)t射熒光。為了消除入射光和散射光的影響，熒光的測量通常在與激發(fā)光成直角的方向進(jìn)行。為了消除可能共存的其他光纖的干擾，如由激發(fā)光所產(chǎn)生的反射光、瑞利散射光和拉曼光，以及為將溶液中的

4、雜質(zhì)所發(fā)生的熒光濾去，以獲得所需要的熒光，在樣品池和檢測器之間設(shè)置了發(fā)光單色器，熒光作用于檢測器上，得到了相應(yīng)的電信號，經(jīng)放大后再記錄下來。(1)激發(fā)光源：在紫外一可見區(qū)范圍內(nèi)，氙燈最為常用，而又分連續(xù)和脈沖氙燈。LS45/55采用的是脈沖氙燈。二者比較如下:脈沖氤燈與連續(xù)氤燈的比較總對耗迖奄源鍥應(yīng)復(fù)蘿柱連續(xù)亂燈聲生曼氧很另他型倒逾遽一遼生熱量犧一一二ZZT麺展時闊預(yù)熱，不測垃感亙爰囲萃當(dāng)崢啟動陳沖T20S申僅宥10W的強(qiáng)光照蔚，丸丸減少光W_._.*匸*脈沖麗測定暗遇流.増進(jìn)極熒光一h礦T禺隸韓控制即可測楚磷竝還蠱鯉不憨脈沖率延遲以閹及脈沖氙燈的LS4_需m池脈沖氙燈的樣當(dāng)于4需5用低(5的

5、工作雜升驗0迴竺.肩;長硏同預(yù)臥飛達(dá)45世“陋鑽有咅壓啟動脈沖麗戡礙住麗生光帥用麗亦或切勰翩定SOTO越光附待才能側(cè)定礙蘇雨匱用時杵而有損失，雜遲時闔込附杵轉(zhuǎn)速隈制-直&接測址而光衩f5光及_為宜。（3）激發(fā)單色器：用于選擇激發(fā)波長。（4）發(fā)射單色器：用于分離出熒光/磷光/發(fā)光的發(fā)射波長。（5）檢測器：熒光的強(qiáng)度通常比較弱，因此應(yīng)采用具有較高靈敏度的光電倍增管，并與激發(fā)光成直角。LS45/LS55的標(biāo)準(zhǔn)檢測器檢測下限為650nm,若要測到90Onm則應(yīng)選擇紅敏倍增管。三、軟件應(yīng)用（一）、儀器狀態(tài)菜單的應(yīng)用圖4儀器狀態(tài)（Status）菜單在儀器狀態(tài)（Status）菜單（見圖4）中的應(yīng)用（Appl

6、ication）項下的下拉菜單中的LS-55Status中點(diǎn)擊，則出現(xiàn)圖5的菜單。圖5儀器狀態(tài)菜單此菜單中的各部分，均為動態(tài)對話框。點(diǎn)擊其中任何部分均可進(jìn)入下一級菜單，通過參數(shù)上的設(shè)置，直接用軟件控制儀器。如點(diǎn)擊左上角的光源部分（Source）,隨即出現(xiàn)圖6的菜單：可實現(xiàn)光源的開關(guān)、及熒光、磷光和發(fā)光測定模式的選擇。1、熒光測定模式的設(shè)置圖6熒光測定模式的設(shè)定在紅色的“LuminescenceMode”中“fluor（熒光）”，即可選定熒光測定模式。通過點(diǎn)擊右上角的紅色數(shù)字“1（氙燈開）”或“0（氙燈關(guān)）”，即可控制光源的開關(guān)。2、磷光測定的設(shè)置在紅色的“LuminescenceMode”中“

7、phos（磷光）”，即可選定熒光測定模式（圖7）圖7在磷光測定模式下樣品受脈沖氙燈光源激發(fā)后的測定條件。氙燈每閃亮一次所產(chǎn)生的能帶峰其帶寬不超過1Ous。在此期間，受激樣品所產(chǎn)生的磷光達(dá)到最大強(qiáng)度值I,0然后按指數(shù)曲線衰減直至消失。樣品光電倍管要等延遲一段時間（t）后才開啟，所以不d會與光源的閃亮?xí)r間重合，門限時間（tg）測量時間與延遲時間（t）均可調(diào)節(jié)，最小調(diào)整步距為0.01ms如選擇的延遲時間大于0.1ms，就不會測量到熒光信號。每個測定周期可以大于一次閃亮。例如：設(shè)閃亮次數(shù)為3,則在每一個測定周期中有3次閃亮及其后的延遲時間和門開時間。所設(shè)的周期時間（CycleTime）應(yīng)三（閃亮數(shù)X電

8、源頻率周期）+tg+t-12.99ms。如tg+t值大于12.99ms，周期時間應(yīng)設(shè)至大于一個電源周期。閃亮頻gdgd率及電源的周波（在中國為50Hz）,所以每次閃亮即電源的一個周期（在中國為20ms）。在磷光的測定模式中，暗電流是在開始測定后自動在20個數(shù)據(jù)收集周期中進(jìn)行測定的，暗電流信號被儲存并在該設(shè)定波長下測定的樣品信號中被減去。每當(dāng)改變門限時間時，自動重新測定暗電流。各參數(shù)范圍如下表：參數(shù)范圍步距延遲時間(DelayTime,t)09000ms0.01ms門限時間(GateTime,t)0.01500ms0.01ms周期時間(CycleTime)19999ms一個電源周期（ms）閃亮次

9、數(shù)（Flash）1101注：周期時間（CycleTime）應(yīng)三（閃亮數(shù)X電源頻率周期）+tg+td-12.99ms。如tg+td值大于12.99ms，則周期時間應(yīng)設(shè)至大于一個電源周期。3、發(fā)光（化學(xué)、生物）發(fā)光測定的設(shè)置在紅色的“LuminescenceMode”中“biolum（發(fā)光）”，即可選定發(fā)光測定模式（圖8）。圖8發(fā)光測定模式的設(shè)定當(dāng)測定化學(xué)或生物發(fā)光時，應(yīng)將光源燈關(guān)閉，只有樣品光電倍增管接受數(shù)據(jù)信號，積分時間與磷光測定時一致。暗電流則自動測定20次（每隔20ms測一次），數(shù)據(jù)儲存并自動從樣品測定數(shù)據(jù)中減去。每當(dāng)門限時間改變后，都會自動重測暗電流。（二）掃描（Scan）菜單的應(yīng)用1、

10、掃描的三種方式1.1預(yù)掃描：以便找出未知樣品的最適宜激發(fā)波長；12單個單色器掃描：可單獨(dú)進(jìn)行激發(fā)光或發(fā)射光的光譜掃描；1.3同步掃描：兩個單色器以一定的波長間距同步轉(zhuǎn)動進(jìn)行掃描；2、預(yù)掃描2.1激發(fā)光單色器預(yù)掃描（發(fā)射光單色器固定在某波長）2.2發(fā)射光單色器預(yù)掃描（激發(fā)光單色器固定在某波長）2.3激發(fā)/發(fā)射預(yù)掃描（自動順序進(jìn)行上述兩種預(yù)掃描）圖9激發(fā)/發(fā)射預(yù)掃描菜單在相應(yīng)的對話小框中分別鍵入激發(fā)光和發(fā)射光的起止波長。在狹縫小框中分別鍵入激發(fā)光和發(fā)射光的寬度。3、激發(fā)或發(fā)射光譜的掃描3.1激發(fā)光譜的掃描3.2發(fā)射譜的掃描點(diǎn)擊圖中Ex.Momo或Em.Mono的單色器圖標(biāo)，則可得到下圖：圖13激發(fā)

11、或發(fā)射單色器的設(shè)置菜單點(diǎn)擊圖13中的“EmissionFilter”中下拉箭頭，即可出現(xiàn)一下拉菜單，可選擇在光路中加入一定波長下的截止濾光片以消除倍頻峰，還可選擇“1%Attenuator”即1%的透過衰減片，以降低過強(qiáng)的熒光強(qiáng)度。4、同步掃描同步掃描有助于一些有機(jī)化合物的判別，特別是復(fù)雜的混合物物，如粗油。同步掃描又分為“固定波長差”或“固定能量差”這兩種形式。SetupParametersSynchronousWavelengthScan辭Scan:C:FLWINLABMETHODSscanmthFileInstrurneritHedp:SetupparametersUserinfoVie

12、wresultsExcitationEmiion|Synchronous$入Synchronous6EPje-ScanScanRangeParametersStart(nm):370End(nm):阿D|DeltaLambda(nm)=弓|ScanSpeed(nm/min):500ExSlit(nmjpO.O|EmSlit(nm):卩0一。j4、時間驅(qū)動模式時間驅(qū)動模式可供在固定波長上記錄一定時間內(nèi)的樣品熒光強(qiáng)度變化。圖14的菜單中“Durations（s）”為所要測定的總時間（秒），“DataInterval（s）”為每兩個測量點(diǎn)間的時間（秒）。5、強(qiáng)度/濃度模式（Read）自動測濃度的步驟

13、：5.1將所含已知濃度的樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液放入樣品室；5.2確認(rèn)所需的波長及狹縫均已設(shè)好；5.3選定Autococn行，并在下面的小框中鍵入該標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度值；5.4鍵入所需的信號積分時間；5.5單擊Intensity,標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度值會顯示在其右邊的小框中，此值自動被剛輸入的濃度值所除，得到其商K并暫存，只要一直選定Autococn行，以后的樣品測定所得的熒光強(qiáng)度會自動乘上K值而成為濃度值顯示。6、波長編程掃描模式(WavelengthProgram)圖16波長編程掃描模式(WavelengthProgram)菜單波長編程掃描可在一系列不同的激發(fā)和發(fā)射波長下來測定樣品的熒光強(qiáng)度。7、用標(biāo)準(zhǔn)曲線

14、法測定濃度的模式ApplicationMenuFileViewUtilitiesDatahandlingWindowHelp辭FLWinLabApplication園RmltWinci回回函|壓D師Region回回罔顱Graphl回回囲圖17儀器應(yīng)用選項菜單在圖17中選擇“Concentration（濃度）”項，即可出現(xiàn)下圖:設(shè)定激發(fā)波長、最大發(fā)射波長及激發(fā)與發(fā)射狹縫等條件后，點(diǎn)擊“Refrence”項，即可出現(xiàn)下圖：ReferencesUserinfoMeasurestdlanewInsert|Add|RemoveFilldownclearRef.IDFactorCone.Int.BG.st

15、dla1.0010.GC8.0000.000stdlb1.010ao20.0000.000Tstd2a1.050.0052.0000.000std2b1Eid50.0055.0000.000std3a1.0100.0098.0B00.000std3b1.0100.00120EjDC0.000std4a1Eid500.00501.0.000std4b1.0500.00G000.000Concentrationunits光強(qiáng)度I下圖:Cone,limitswarningx-10.00ViewresultsSampleIDFactorInformationIntensityBGCone.Sampleli.oeunder-range1.0G00000O.l；23Sample2i.ob戚1000D鈕2.442Sample3i.obover-range20.00(000017.902在圖20中輸入相應(yīng)的數(shù)據(jù)后，點(diǎn)擊“ViewResuIts項，即可得到下圖:圖21濃度測定模式待測樣品結(jié)果圖21顯示了待測樣品的濃度。1、熒光的產(chǎn)生當(dāng)分子處于單