EMSA原理簡介教案資料

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。EMSA原理簡介-EMSA實(shí)驗(yàn)技術(shù)及方法簡介實(shí)驗(yàn)簡介凝膠遷移或HYPERLINK/doc/2902109.html電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA-electrophoreticmobilityshiftassay）是一種研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。這一技術(shù)最初用于研究DNA結(jié)合蛋白，目前已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常將純化的蛋白和細(xì)胞粗提液和32PHYPERLINK/doc/1638039.html同位素標(biāo)記的DNA或RNA探針一

2、同保溫，在非變性的聚丙烯HYPERLINK/doc/6587960.html凝膠電泳上，分離復(fù)合物和非結(jié)合的探針。DNA-復(fù)合物或RNA-復(fù)合物比非結(jié)合的探針移動得慢。同位素標(biāo)記的探針依研究的結(jié)合蛋白的不同，可是HYPERLINK/doc/4147258.html雙鏈或者是單鏈。當(dāng)檢測如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子一類的DNA結(jié)合蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白，或核細(xì)胞抽提液。在檢測RNA結(jié)合蛋白時，依據(jù)目的RNA結(jié)合蛋白的位置，可用純化或部分純化的蛋白，也可用核或HYPERLINK/doc/7276072.html胞質(zhì)細(xì)胞抽提液。競爭實(shí)驗(yàn)中采用含HYPERLINK/doc/1655572.html蛋白結(jié)合

3、序列的DNA或RNA片段和HYPERLINK/doc/6127469.html寡核苷酸片段（特異），和其它非相關(guān)的片段（非特異），來確定DNA或RNA結(jié)合蛋白的特異性。在競爭的特異和非特異片段的存在下，依據(jù)復(fù)合物的特點(diǎn)和強(qiáng)度來確定特異結(jié)合。凝膠遷移或電泳遷移率檢測（ElectrophoreticMobilityShiftAssay,EMSA）是一種檢測蛋白質(zhì)和DNA序列相互結(jié)合的技術(shù)，最初用于研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用，可用于定性和定量分析。這一技術(shù)目前已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。由于很多研究的TF不具有結(jié)合的特異性，所以即使發(fā)現(xiàn)TF和被研究的

4、寡核苷酸探針結(jié)合，也不表示在體內(nèi)該TF不能和其它寡核苷酸結(jié)合，運(yùn)用一些生物信息學(xué)軟件，可以模擬表示TF與基因啟動子區(qū)寡核苷酸結(jié)合的具體情況，發(fā)現(xiàn)TF可以和啟動子區(qū)PUTATIVE結(jié)合。同時，由于EMSA在體外不能模擬細(xì)胞內(nèi)眾多生物分子的相互作用，比如，某一TF在細(xì)胞內(nèi)由于受到其它TF的協(xié)同或者修飾后才能與寡核苷酸結(jié)合的話，那么在體外是不能重現(xiàn)這一結(jié)果的。2003年上一篇關(guān)于ChIP方法的介紹文獻(xiàn)攻擊EMSA沒有考慮細(xì)胞內(nèi)完整自然的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)的影響而受到很大的限制！下面是在一個PROTOCAL1.探針的標(biāo)記：(1)如下設(shè)置探針標(biāo)記的反應(yīng)體系：待標(biāo)記探針(1.75pmol/微升)2微升T4P

5、olynucleotideKinaseBuffer(10X)1微升Nuclease-FreeWater5微升-32PATP(3,000Ci/mmolat10mCi/ml)1微升T4PolynucleotideKinase(5-10u/微升)1微升總體積10微升按照上述反應(yīng)體系依次加入各種試劑，加入同位素后，Vortex混勻，再加入T4PolynucleotideKinase，混勻。(2)使用水浴或PCR儀，37反應(yīng)10分鐘。(3)加入1微升探針標(biāo)記終止液，混勻，終止探針標(biāo)記反應(yīng)。(4)再加入89微升TE，混勻。此時可以取少量探針用于檢測標(biāo)記的效率。通常標(biāo)記的效率在30以上，即總放射性的30%以

6、上標(biāo)記到了探針上。為實(shí)驗(yàn)簡便起見，通常不必測定探針的標(biāo)記效率。(5)標(biāo)記好的探針最好立即使用，最長使用時間一般不宜超過3天。標(biāo)記好的探針可以保存在-20。2.探針的純化：通常為實(shí)驗(yàn)簡便起見，可以不必純化標(biāo)記好的探針。在有些時候，純化后的探針會改善EMSA的電泳結(jié)果。如需純化，可以按照如下步驟操作：(1)對于100微升標(biāo)記好的探針，加入1/4體積即25微升的5M醋酸銨，再加入2體積即200微升的無水乙醇，混勻。(2)在-70至-80沉淀1小時，或在-20沉淀過夜。(3)在4，12,000g-16,000g離心30分鐘。小心去除上清，切不可觸及沉。(4)在4，12,000g-16,000g離心1分

7、鐘。小心吸去殘余液體。微晾干沉淀，但不宜過分干燥。(5)加入100微升TE，完全溶解沉淀。標(biāo)記好的探針最好立即使用，最長使用時間一般不宜超過3天。標(biāo)記好的探針可以保存在-20。3.EMSA膠的配制：(1)準(zhǔn)備好倒膠的模具?？梢允褂贸Ｒ?guī)的灌制蛋白電泳膠的模具，或其它適當(dāng)?shù)哪＞摺Ｗ詈眠x擇可以灌制較薄膠的模具，以便于干膠等后續(xù)操作。為得到更好的結(jié)果，可以選擇可灌制較大EMSA膠的模具。(2)按照如下配方配制20毫升4的聚丙烯酰胺凝膠(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis對結(jié)果影響不大)。TBEbuffer(10X)1毫升重蒸水16.2毫升39:1acrylamide/bisacrylamid

8、e(40%,w/v)2毫升80%甘油625微升10%過硫酸銨(ammoniumpersulfate)150微升TEMED10微升(3)按照上述次序加入各個溶液，加入TEMED前先混勻，加入TEMED后立即混勻，并馬上加入到制膠的模具中。避免產(chǎn)生氣泡，并加上梳齒。如果發(fā)現(xiàn)非常容易形成氣泡，可以把一塊制膠的玻璃板進(jìn)行硅烷化處理。4.EMSA結(jié)合反應(yīng)：(1)如下設(shè)置EMSA結(jié)合反應(yīng)(預(yù)期的結(jié)果參見圖1)：陰性對照反應(yīng)：Nuclease-FreeWater7微升EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X)2微升細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子0微升標(biāo)記好的探針1微升總體積10微升樣品反應(yīng)：Nuclease

9、-FreeWater5微升EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X)2微升細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子2微升標(biāo)記好的探針1微升總體積10微升探針冷競爭反應(yīng)：Nuclease-FreeWater4微升EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X)2微升細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子2微升未標(biāo)記的探針1微升標(biāo)記好的探針1微升總體積10微升突變探針的冷競爭反應(yīng)：Nuclease-FreeWater4微升EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X)2微升細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子2微升未標(biāo)記的突變探針1微升標(biāo)記好的探針1微升總體積10微升Super-shift反應(yīng)：Nuclease-FreeWater

10、4微升EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X)2微升細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子2微升目的蛋白特異抗體1微升標(biāo)記好的探針1微升總體積10微升(2)按照上述順序依次加入各種試劑，在加入標(biāo)記好的探針前先混勻，并且室溫(20-25)放置10分鐘，從而消除可能發(fā)生的探針和蛋白的非特異性結(jié)合，或者讓冷探針優(yōu)先反應(yīng)。然后加入標(biāo)記好的探針，混勻，室溫(20-25)放置20分鐘。(3)加入1微升EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(無色，10X)，混勻后立即上樣。注意：有些時候溴酚藍(lán)會影響蛋白和DNA的結(jié)合，建議盡量使用無色的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液。如果對于使用無色上樣緩沖液在上樣時感覺

11、到無法上樣，可以在無色上樣緩沖液里面添加極少量的藍(lán)色的上樣緩沖液，至能觀察到藍(lán)顏色即可。5.電泳分析：(1)用0.5XTBE作為電泳液。按照10V/厘米的電壓預(yù)電泳10分鐘。預(yù)電泳的時候如果有空余的上樣孔，可以加入少量稀釋好的1X的EMSA上樣緩沖液(藍(lán)色)，以觀察電壓是否正常進(jìn)行。(2)把混合了上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內(nèi)。在多余的某個上樣孔內(nèi)加入10微升稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(藍(lán)色)，用于觀察電泳進(jìn)行的情況。(3)按照10V/厘米的電壓電泳。確保膠的溫度不超過30，如果溫度升高，需要適當(dāng)降低電壓。電泳至EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液中的藍(lán)色染料溴酚藍(lán)

12、至膠的下緣1/4處，停止電泳。(4)剪一片大小和EMSA膠大小相近或略大的比較厚實(shí)的濾紙。小心取下夾有EMSA膠的膠板，用吸水紙或普通草紙大致擦干膠板邊緣的電壓液。小心打開兩塊膠板中的上面一塊(注：通常選擇先移走硅烷化的那塊玻璃板)，把濾紙從EMSA膠的一側(cè)逐漸覆蓋住整個EMSA膠，輕輕把濾紙和膠壓緊。濾紙被膠微微浸濕后(大約不足1分鐘)，輕輕揭起濾紙，這時EMSA膠會被濾紙一起揭起來。把濾紙側(cè)向下，放平，在EMSA膠的上面覆蓋一層保鮮膜，確保保鮮膜和膠之間沒有氣泡。(5)干膠儀器上干燥EMSA膠。然后用X光片壓片檢測，或用其它適當(dāng)儀器設(shè)備檢測。EMSA的典型分析結(jié)果可以參見下圖說明:陰性對照

13、反應(yīng)(標(biāo)記探針)；2,常規(guī)反應(yīng)(含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白標(biāo)記探針)；3,探針冷競爭反應(yīng)(含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白標(biāo)記探針標(biāo)記探針100倍量的未標(biāo)記探針)；4,突變探針的冷競爭反應(yīng)(含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白標(biāo)記探針標(biāo)記探針100倍量的未標(biāo)記突變探針)；5,Super-shift反應(yīng)(含激活的目的轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白標(biāo)記探針目的轉(zhuǎn)錄因子的特異抗體)。生物體內(nèi)DNA轉(zhuǎn)錄成RNA是基因表達(dá)的關(guān)鍵過程，基因表達(dá)調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。近年來，基因分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的趨勢之一是逐漸從基因結(jié)構(gòu)和功能分析轉(zhuǎn)到基因順式作用元件和轉(zhuǎn)錄因子及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理上，對基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究將是今后相當(dāng)長一段時期內(nèi)功能

14、基因組學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。在轉(zhuǎn)錄水平，基因的轉(zhuǎn)錄行為是由順式作用元件（cis-actingelements）和反式作用因子（trans-actingfactors）（即轉(zhuǎn)錄因子）相互作用調(diào)控的，因此要探討基因的表達(dá)調(diào)控規(guī)律，分離、鑒定基因的位點(diǎn)控制區(qū)（locicontrolregion，LCR）中順式作用元件和相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子至關(guān)重要。但僅僅如此還不夠，對于基因表達(dá)調(diào)控，必須從三個層次展開：一是分離和鑒定基因5端核心啟動子等順式作用元件，二是分離和鑒定與各順式作用元件相對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，三是檢測各順式作用元件與對應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的相互作用。鑒定順式調(diào)控元件和轉(zhuǎn)錄因子是研究得比較多的內(nèi)容，而對于順式作用元件與對應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的相互作用這個層次的研究相對較為薄弱。電泳遷移率檢測（ElectrophoreticMobilityShiftAssay,EMSA）是一種檢測蛋白質(zhì)和DNA序列相互結(jié)合的技術(shù)，它正是對第三個層次進(jìn)行研究的技術(shù)之一，核心功能是驗(yàn)證蛋白質(zhì)與特定核酸序列的結(jié)合特性，從而間接推斷已知蛋白質(zhì)的靶序列或已知序列的結(jié)合蛋白分子。我們知道，結(jié)構(gòu)基因組學(xué)已經(jīng)很容易實(shí)現(xiàn)高通量分析，但在功能研究這個層次上，目前還沒有真正高通量的分析技術(shù)出現(xiàn)。技術(shù)的缺乏是后基因組學(xué)時代功能研究的主要瓶頸。和其他功能研究技術(shù)一樣，電