這版中國藥典檢驗操作規(guī)程

1、這版中國藥典檢驗操作規(guī)程1.1無菌操作要求 1.1.1 接種細菌時必須穿工作服、戴工作帽。 1.1.2專用的工作服、帽及拖鞋，應放在無菌室緩沖間，工作前經紫外線消毒后使用。 1.1.3 接種樣品時，應在進無菌室前用肥皂洗手，然后用75酒精棉球將手擦干凈。 1.1無菌操作要求1.1.4 進行接種所用的吸管，平皿及培養(yǎng)基等必須經消毒滅菌，打開包裝未使用完的器皿，不能放置后再使用，金屬用具應高壓滅菌或用95%酒精點燃燒灼三次后使用。 1.1.5 從包裝中取出吸管時，吸管尖部不能觸及外露部位，使用吸管接種于試管或平皿時，吸管尖不得觸及試管或平皿邊。 1.1無菌操作要求1.1.6 接種樣品、轉種細菌必須

2、在酒精燈旁操作，接種細菌或樣品時，吸管從包裝中取出后及打開試管塞（即硅氟膠塞）都要通過火焰消毒。 1.1.7 接種環(huán)和針在接種細菌前應經火焰燒灼全部金屬絲，必要時還要燒到環(huán)和針與桿的連接處。 1.1.8 吸管吸取菌液或樣品時，應用相應的橡皮頭吸取，不得直接用口吸。1.2無菌間使用要求 1.2.1無菌間內應保持清潔，工作后用消毒溶液消毒，擦拭工作臺面，不得存放與實驗無關的物品。 1.2.2無菌間使用前后應將門關緊，打開紫外燈，照射時間不少于30min，使用紫外燈，應注意不得直接在紫外線下操作，以免引起損傷，燈管每隔兩周需用酒精棉球輕輕擦拭，除去上面灰塵和油垢，以減少紫外線穿透的影響。1.3消毒滅

3、菌要求1.3.1滅菌前準備 1.2.3處理和接種樣品時，進入無菌間操作，不得隨意出入，如需要傳遞物品，可通過小窗傳遞。（1）所有需要滅菌的物品首先應清洗晾干，玻璃器皿用紙包裝嚴密，如用金屬筒應將上面通氣孔打開。（2）裝培養(yǎng)基的三角瓶，內容物不應超過總體積的2/3（例如500mL的三角瓶最好裝300350mL培養(yǎng)基，以防再次加熱融化時爆沸）。（3）無菌室內使用的毛巾、脫脂棉球用紙包裹，進行濕熱滅菌。1.3.2裝放（1）干熱滅菌器：裝放物品不可過擠，且不能接觸箱的四壁。（2）大型高壓蒸氣鍋：放置滅菌物品分別包扎好，直接放入消毒筒內，物品之間不能過擠。1.3.3設備檢查 （1）檢查門的開關是否靈活，

4、橡皮圈有無損壞，是否平整。（2）檢查壓力表蒸氣排盡時是否停留在零位，關好門和蓋，通蒸氣或加熱后，觀察是否漏氣，壓力表與溫度計所標示的狀況是否吻合，管道有無堵塞。（3）對有自動電子程序控制裝置的滅菌器，使用前應檢查規(guī)定的程序，是否符合于進行滅菌處理的要求。1.3.4滅菌處理(1) 干熱滅菌法：用于玻璃器皿、金屬制品、陶瓷制品等的滅菌。滅菌完畢后或溫度升溫過程中，須在60以下才能打開箱門。(2)立式壓力蒸氣滅菌器：待壓力恢復到零時，自然冷卻至60后開蓋取物，如為液體物品，不要打開排氣閥，而應立即將鍋去除熱源，待自然冷卻，壓力恢復至零，溫度降到60以下 再開蓋取物，以防突然減壓液體劇烈沸騰或容器爆破

5、。（3）物品取出,隨即檢查包裝的完整性,若有破壞或棉塞脫掉、包裝有明顯的水浸者,不可作為無菌物品使用。培養(yǎng)基或試劑等,應檢查是否符合達到滅菌后的色澤或狀態(tài),未達到者應廢棄。取出的物品掉落在地或誤放不潔處,或沾有水液,均視為受到污染,不可作為無菌物品使用。取出的合格滅菌物品,應存放于貯藏室或防塵柜內,嚴禁與未滅菌物品混放。凡屬合格物品,應標有滅菌日期及有效期限。1.4有毒有菌污物處理要求1.4.1經培養(yǎng)的污染材料及廢棄物應放在嚴密的容器或鐵絲筐內，并集中存放在指定地點，待統(tǒng)一進行高壓滅菌（經微生物污染的培養(yǎng)物，必須經12130min高壓滅菌）。1.4.2染菌后的吸管（即進行陽性菌操作后的），使用

6、后放入5煤酚皂溶液或石炭酸液中，最少浸泡24h（消毒液體不得低于浸泡的高度）再經12130 min高壓滅菌。有毒有菌污物處理要求1.4.3涂片染色沖洗片的液體，一般可直接沖入下水道，強致病菌的沖洗液必須沖在燒杯中，經高壓滅菌后方可倒入下水道，染色的玻片放入5煤酚皂溶液中浸泡24 h后，煮沸洗滌。做凝集試驗用的玻片或平皿，必須高壓滅菌后洗滌。1.4.4打碎的培養(yǎng)物，立即用5煤酚皂溶液或石炭酸液噴灑和浸泡被污染部位，浸泡半小時后再擦拭干凈。有毒有菌污物處理要求1.4.5污染的工作服或進行強致病菌試驗所穿的工作服、帽、口罩等，應放入專用消毒袋內，經高壓滅菌后方能洗滌。 1.5培養(yǎng)基制備要求1.5.1

7、根據培養(yǎng)基配方的成分按量稱?。筛鶕a品說明書用量和方法進行），然后溶于蒸餾水中，在使用前對應用的試劑藥品應進行質量檢驗。1.5.2因高壓滅菌可影響一些培養(yǎng)基的PH降低或升高，故不宜滅菌壓力過高或次數太多，以免影響培養(yǎng)基的質量。有毒有菌污物處理要求1.5.3盛裝培養(yǎng)基不宜用鐵、銅等容器，使用洗凈的中性硬質玻璃容器（三角燒瓶）為好。1.5.4每批培養(yǎng)基制備好后，應做無菌生長試驗（空白平皿試驗）及所檢菌株生長試驗。如果是生化培養(yǎng)基，使用標準菌株接種培養(yǎng)，觀察生化反應結果，應呈正常反應，培養(yǎng)基不應貯存過久，必要時可置4冰箱存放。2.實驗操作2.1準備用具，配制培養(yǎng)基、稀釋液、培養(yǎng)箱2.1.1用具：1

8、50mL三角燒瓶 試管 1mL移液管 10mL移液管 2.1.2培養(yǎng)基：需氧菌菌總數 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、霉菌和酵母菌總數 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基控制菌 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基 腸道菌增菌液體培養(yǎng)基麥康凱液體培養(yǎng)基RV沙門增菌液體培養(yǎng)基接種平板 紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基麥康凱瓊脂培養(yǎng)基木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基實驗操作2.1.3稀釋液：0. 9%無菌氯化鈉溶液2.1.4培養(yǎng)箱：3個（3035、2025、4244）2.2培養(yǎng)基配制2.3滅菌2.4無菌檢查：將滅菌的培養(yǎng)基放入37的溫室中培養(yǎng)24至48小時，以檢查滅菌是否徹底。2.5無菌室準備：用消毒液擦拭無菌室，將本次試驗所用的器皿、培養(yǎng)基通過

9、傳遞窗送到無菌室，樣品置于傳遞窗，一次性使用物料（工作服、口罩、手套）置于緩沖間。開啟凈化系統(tǒng)1小時，關閉凈化系統(tǒng)，打開紫外燈0.5小時，關閉紫外燈，至少0.5小時后進入無菌室。2.6微生物計數檢驗（平皿傾注法）2.6.1供試液制備2.6.1.1稱取樣品：一般供試品的檢驗量為10g或10ml;膜劑為100cm2; 貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗量可以酌減。檢驗時，應從2 個以上最小包裝單位中抽取供試品，大蜜丸還不得少于4 丸，膜劑還不得少于4 片。2.6.1.2稀釋液制備：0. 9%無菌氯化鈉溶液Title and content layout (Text page)2.6.2平皿的制備：3個稀

10、釋級（常用10-1、10-2、10-3）（每稀釋級每種培養(yǎng)基至少制備2 個平板），同時做空白（等量稀釋劑）供試液用量為適應性試驗確定的，常用1ml2.6.3加入培養(yǎng)基：取培養(yǎng)基，融化并讓其冷卻至45左右，傾入已加入供試液的平皿中，每個平皿約15mL（即傾倒時液面剛剛閉合時），在超凈臺面上輕輕晃動使供試液均勻混合于培養(yǎng)基中，放置一旁待冷卻凝固。2.6.4培養(yǎng)：待平皿完全冷卻凝固，通過傳遞窗取出，倒置疊放置于培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)時間及溫度：需氧菌菌總數 3035培養(yǎng)35 天霉菌和酵母菌總數 2025培養(yǎng)57 天，2.7控制菌檢驗2.7.1供試液制備：取供試品10g，用稀釋劑制成1 : 10供試液，混勻，

11、在2025培養(yǎng)約2小時(可以在無菌室中先做這一步，等其余試驗步驟完成，再繼續(xù)進行控制菌的下一步)。耐膽鹽革蘭陰性菌 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基大腸埃希氏菌 0. 9%無菌氯化鈉溶液沙門菌 直接取樣品10g或10ml2.7.2預培養(yǎng)（增菌培養(yǎng)）：取供試液10mL（相當于1g樣品），加在 ml增菌液體培養(yǎng)基（經方法適用性試驗確定）中，3035培養(yǎng)2448小時。耐膽鹽革蘭陰性菌 腸道菌增菌液體培養(yǎng)基大腸埃希氏菌 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基沙門菌 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基2.7.3選擇和分離培養(yǎng)2.7.3.1耐膽鹽革蘭陰性菌：取相當于0.1g、0.01g和0.001g(或0.1ml、0.01ml和0.001tnl)

12、供試品的預培養(yǎng)物或其稀釋液分別接種至適宜體積(經方法適用性試驗確定）腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，303 5培養(yǎng)244 8小時。2.7.3.2大腸埃希氏菌：l ml接種至100 ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，4244培養(yǎng)244 8小時。選擇和分離培養(yǎng)2.7.3.3沙門菌：0.1 ml接種至10mlRV沙門增菌液體培養(yǎng)基中，3035培養(yǎng)182 4小時。2.7.4平板劃線分離培養(yǎng)（1）培養(yǎng)基平板的準備：取培養(yǎng)基，融化并讓其冷卻至50左右，傾入滅菌平皿中，每個平皿約15mL，使其分布均勻，冷卻凝固后即為固體平板培養(yǎng)基。耐膽鹽革蘭陰性菌 紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基大腸埃希氏菌 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基沙門菌 木糖賴氨酸脫氧

13、膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（2）各種物品的準備取出預培養(yǎng)后的控制菌供試液，置于工作臺上；接種前準備好酒精燈、一次性接種針、火柴、酒精棉球、試管架等。可在陽性菌室或無菌室操作，無菌室準備工作相同。（3）平板劃線以左手持平板，中指、無名指和小指托著平板底,拇指和食指打開上蓋，使蓋與底成30角，以便劃線。Title and content layout (Text page)右手握一次性接種針，把接種針上的菌液涂在培養(yǎng)基一側，一般作5-8次劃線。將環(huán)上的多余細菌材料燒掉后，從第1次劃線引出第2次劃線；再從第2次劃線引出第3次劃線，如此反復3-4次劃線后，即可把整個平板表面劃滿，注意每一次劃線只能與上一次劃線重

14、疊，這樣就可在最后的1-2次劃線上出現多量的單個菌落，以便進行純培養(yǎng)。Title and content layout (Text page)2.7.4培養(yǎng)：接種后的平板倒置疊放置于培養(yǎng)箱中，3035培養(yǎng)1824小時。2.8培養(yǎng)物的觀察2.8.1需氧菌總數：每天觀察菌落的生長情況，如數目多，應及時點計。2.8.2霉菌和酵母菌總數：每天觀察菌落的生長情況，如數目多，應及時點計。2.8.3大腸埃希菌：每天觀察菌落的生長情況。2.8.4沙門氏菌：菌落為淡紅色或無色、透明或半透明、中心有或無黑色。如有疑似菌落則用接種針挑選于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)182 4小時，或采用其

15、他適宜方法進一步鑒定。3.數據報告3.1平皿法：點計平板上生長的所有菌落數，計數并報告。菌落蔓延生長成片的平板不宜計數。點計菌落數后，計算各稀釋級供試液的平均菌落數，按菌數報告規(guī)則報告菌數。若同稀釋級兩個平板的菌落數平均值不小于15，則兩個平板的菌落數不能相差1 倍或以上。3.2控制菌3.2.1耐膽鹽革蘭陰性菌：紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，則對應培養(yǎng)管為陽性，否則為陰性。根據各培養(yǎng)管檢查結果，從表2查l g 或lm l供試品中含有耐膽鹽革蘭陰性菌的可能菌數。3.2.2大腸埃希菌：若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，應進行分離、純化及適宜的鑒定試驗，確證是否為大腸埃希菌；若麥康凱瓊

16、脂培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。3.2.3沙門菌：若木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上有疑似菌落生長，且三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面為紅色、底層為黃色，或斜面黃色、底層黃色或黑色，應進一步進行適宜的鑒定試驗，確證是否為沙門菌。如果平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性，或三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面未見紅色、底層未見黃色（或斜面黃色、底層未見黃色或黑色，判供試品未檢出沙門菌。Title and content layout (Text page)3.3報告規(guī)則：需氧菌總數測定宜選取平均菌落數小于300cfu的稀釋級、霉菌和酵母菌總數測定宜

17、選取平均菌落數小于l00cfu的稀釋級，作為菌數報告的依據。取最髙的平均菌落數，計算lg 、lmL或10cm2供試品中所含的微生物數，取兩位有效數字報告。如各稀釋級的平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板有菌落生長，但平均菌落數小于1 時，以 1 乘以最低稀釋倍數的值報告菌數。3.4結果判斷：10 cfu：可接受的最大菌數為20100cfu：可接受的最大菌數為2001000cfu：可接受的最大菌數為2000，依此類推Title and content layout (Text page)3.5限度標準：3.5.1不含中藥原粉的口服中藥制劑：需氧菌總數 103cfu（2000） 102cfu（2

18、00）霉菌和酵母菌總數 102cfu（200） 101 cfu（20）大腸埃希菌 不得檢出沙門菌（含臟器提取物的）不得檢出3.5.2含中藥原粉的口服中藥制劑3.5.2.1不含發(fā)酵原粉需氧菌總數 104cfu（20000） 5102cfu（1000）霉菌和酵母菌總數 102cfu（200） 102 cfu（20）大腸埃希菌 不得檢出Title and content layout (Text page)沙門菌（含臟器提取物的）不得檢出耐膽鹽革蘭陰性菌 1003.5.2.2含發(fā)酵原粉需氧菌總數 105cfu（200000） 103cfu（2000）霉菌和酵母菌總數 5100cfu（1000） 100 cfu（200）大腸埃希菌 不得檢出沙門菌（含臟器提取物的）不得檢出耐膽鹽革蘭陰性菌 104.實驗時間安排4.1第一天：準備用具、培養(yǎng)基、稀釋劑，滅菌4.2第二天：準備無菌室（預計2小時），檢驗（無菌室操作預計3小時），平皿冷卻（夏季預計2小時，冬季預計1小時），移出無菌室進行培養(yǎng)（預計0.5小時）4.3第三天：觀察培養(yǎng)物（需氧菌菌總數、霉菌和酵母菌總數第一天），耐膽鹽革蘭陰性菌、大腸埃希菌、沙門氏菌的預培養(yǎng)結束，進行分離培養(yǎng)操作，準備培