植物基因轉(zhuǎn)化的受體課件

1、第七章Genetic transformation in plant2目錄轉(zhuǎn)基因技術(shù)現(xiàn)狀及其應(yīng)用植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)載體構(gòu)建遺傳轉(zhuǎn)化操作轉(zhuǎn)基因鑒定3第三節(jié)載體構(gòu)建4Transformation CassettesContains1. Gene of interest The coding region and its controlling elements2. Selectable marker Distinguishes transformed/untransformed plants3. Insertion sequences Aids Agrobacterium insertion5Let

2、s Build A Complex CassettepB19hpc (Golden Rice Cassette)TLTRaphIV35SGt1psy35SrbcScrtlHygromycinResistancePhytoeneSynthasePhytoeneDesaturaseT-DNABorderT-DNABorderSelectableMarkerGene ofInterestGene ofInterestInsertionSequenceInsertionSequence61. gene of interest Based on what you are doing and what y

3、ou want to getQualityStress toleranceSecondary metabolism7A cloning site for the gene of interest 82. Selectable marker Allows the transgenic plants to survive under stringent selection.Coding Region Gene that breaks down a toxic compound;non-transgenic plants dieex.: nptII kanamycin (bacterial anti

4、biotic) resistance aphIV hygromycin (bacterial antibiotic) resistance Bar glufosinate (herbicide) resistance9Effect of Selectable MarkerTransgenic = Has Kan or Bar GenePlant grows in presenceof selective compoundPlant dies in presenceof selective compoundNon-transgenic = Lacks Kan or Bar GeneX10A se

5、lectable marker gene 抗性素類kanamycin resistance, nptII hygromycin resistance, hpt 除草劑類bar gene (for resistance to herbicide phosphinothricin)草胺膦 DHFR gene (for resistance to methotrexate)甲氨蝶呤ESPS gene (for resistance to glyfosate)11常用抗生素抗性酶基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(NPTII)，抗卡那霉素潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（HPT），抗潮霉素(hygromycin) 12 n

6、pt基因在植物基因工程中被廣泛使用，來(lái)源于細(xì)菌轉(zhuǎn)座子Tn5上的ahpA2。該基因編碼氨基糖苷-3-磷酸轉(zhuǎn)移酶（aminnoglycoside3-phosphotransferase）。Npt使ATP分子上的-磷酸基轉(zhuǎn)移到抗生素分子上，影響抗生素與核糖體亞基的結(jié)合，從而使氨基糖苷類抗生素（新霉素、卡那霉素、慶大霉素、巴龍霉素和G418等）磷酸化失活。13HPT潮霉素是一種很強(qiáng)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，對(duì)許多種植物都產(chǎn)生很高的毒性。而潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因產(chǎn)物通過(guò)酶促磷酸化作用能使潮霉素失活，從而產(chǎn)生抗性。14常用抗除草劑基因 bar基因，產(chǎn)生PPT乙酰轉(zhuǎn)移酶，抗Bialaphos或glufosinate草

7、銨膦EPSP基因，產(chǎn)生5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶，抗glyphosate草甘磷GOX基因，產(chǎn)生草甘膦氧化酶,降解草甘膦 153. Reporter genes: scorable marker gene具有兩大特點(diǎn)（1）便于檢測(cè)；（2）其表達(dá)產(chǎn)物及產(chǎn)物的類似功能在未轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞內(nèi)并不存在。optional, but very useful16Reporter genesbeta-glucuronidase activity (GUS) green fluorescent protein (GFP)chloramphenicolacetyl transferase activity

8、luciferase activity 17 (1) GUS基因Gus基因編碼-葡萄糖苷酸酶（ -glucuronidase，GUS），能催化許多-葡萄糖苷脂類物質(zhì)的水解。能被許多葡萄糖苷誘導(dǎo)，即其表達(dá)受GUS底物的誘導(dǎo)。 18GUS組織化學(xué)染色以X-gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚- -D-葡萄糖苷酸脂）為底物，在適宜條件下，底物進(jìn)入檢測(cè)組織。經(jīng)氧化二聚作用形成5，5-二溴-4，4-二氯靛藍(lán)染料，使具有GUS活性的產(chǎn)位呈現(xiàn)藍(lán)色。19(2) 綠色熒光蛋白基因 GFP is a fluorescent protein isolated from Coelenterates, such as t

9、he Pacific jellyfish, Aequoria victoria, or from the sea pansy, Renilla reniformis.Osamu Shimomura was the first person to isolate GFP and to find out which part of GFP was responsible for its fluorescence. 20 gfpIts role is to transduce the blue chemiluminescence of the protein aequorin into green

10、fluorescent light by energy transfer. The gene for GFP has been isolated and has become a useful tool for making chimeric proteins of GFP linked to other proteins where it functions as a fluorescent protein tag.是一種活體標(biāo)記。能夠接受熒光輻射并發(fā)射熒光。GFP在原核或真核細(xì)胞中藍(lán)光激發(fā)能發(fā)出綠光即發(fā)射團(tuán)的形成無(wú)物種特異性，也不需要特異的輔助因子?；谶@一特點(diǎn)，gfp基因作為新型標(biāo)記或報(bào)

11、告基因可以廣泛應(yīng)用于各種生物。2122gfp基因具有以下優(yōu)點(diǎn)適用于各種生物的基因轉(zhuǎn)化檢測(cè)方法簡(jiǎn)便，只要有紫外光或藍(lán)光照射，其表達(dá)產(chǎn)物即可發(fā)出綠色熒光便于活體檢測(cè)，有利于活體內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控研究檢測(cè)時(shí)可獲得直觀信息，有利于轉(zhuǎn)基因植物安全性問(wèn)題的研究及防范23熒光素酶基因 Luciferase 螢光素酶可催化生物體自身發(fā)光，熒火蟲(chóng)熒光素酶及細(xì)菌熒光素酶。螢火蟲(chóng)螢光素酶催化6-羥基喹啉類，脫羧后生成激活態(tài)的氧化螢光素；細(xì)菌螢光素酶以脂肪醛為底物，氧化成脂肪酸。螢光素酶檢測(cè)的靈敏度高,而且沒(méi)有背景，螢光素酶基因的最大特點(diǎn)是不損害植物,即在整體植物或離體器官內(nèi),基因產(chǎn)物都可測(cè)定。244. 啟動(dòng)子和終止子P

12、romoter & Terminator作用:形成獨(dú)立的表達(dá)單元，啟動(dòng)目的基因的表達(dá)，同時(shí)減少或避免干擾鄰近基因表達(dá) TLTRaphIV35SGt1psy35SrbcScrtlHygromycinResistancePhytoeneSynthasePhytoeneDesaturaseT-DNABorderT-DNABorderSelectableMarkerGene ofInterestGene ofInterest25常用的Promoter組成型表達(dá)啟動(dòng)子（constitutive promotor），也叫非特異性表達(dá)啟動(dòng)子特異性表達(dá)的啟動(dòng)子誘導(dǎo)型啟動(dòng)子其它26組成型表達(dá)啟動(dòng)子constit

13、utive promoter也叫非特異性表達(dá)啟動(dòng)子特點(diǎn):表達(dá)沒(méi)有時(shí)間、空間、組織的特異性單子葉植物：來(lái)自玉米的Ubiquitin啟動(dòng)子和來(lái)源于水稻的Actin1 啟動(dòng)子雙子葉植物：來(lái)自花椰菜花葉病毒CaMV(Cauliflower mosaic virus)35S啟動(dòng)子27特異性或誘導(dǎo)性啟動(dòng)子特異性表達(dá)的啟動(dòng)子 組織（花藥）特異性表達(dá)啟動(dòng)子：TA29 種子特異性表達(dá)啟動(dòng)子：CG1誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 光誘導(dǎo)表達(dá): rbsS啟動(dòng)子 熱誘導(dǎo)表達(dá)：hsp70啟動(dòng)子 損傷誘導(dǎo)啟動(dòng)子: wun1 啟動(dòng)子其它氣孔特異、病害誘導(dǎo)特異28植物基因轉(zhuǎn)化的受體原生質(zhì)體懸浮細(xì)胞胚性愈傷組織胚狀體葉片切塊其它受體：如花、子房

14、、離體條件下的子葉、胚軸、莖段、根和體細(xì)胞胚、花粉等29第四節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化操作30一、受體材料的選擇受體是指用于接受外源DNA的轉(zhuǎn)化材料。良好的植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)應(yīng)滿足如下條件：高效穩(wěn)定的再生能力；受體材料要有較高的遺傳穩(wěn)定性；外植體來(lái)源方便，如胚和其它器官等；對(duì)篩選劑敏感；轉(zhuǎn)化率高31常用的受體材料有以下幾大類型:1.愈傷組織再生系統(tǒng)外植體材料經(jīng)過(guò)脫分化培養(yǎng)誘導(dǎo)形成愈傷組織，轉(zhuǎn)化（帶有目的基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染），分化培養(yǎng)獲得再生植株。優(yōu)點(diǎn)：外植體來(lái)源廣，繁殖快，易接受外源基因， 轉(zhuǎn)化效率高。缺點(diǎn)：遺傳穩(wěn)定性差、嵌合體 因此需要連續(xù)的再生系統(tǒng)322.直接分化再生系統(tǒng) 外植體材料細(xì)胞不經(jīng)過(guò)脫分化形

15、成愈傷組織階段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。優(yōu)點(diǎn)：周期短、操作簡(jiǎn)單，體細(xì)胞變異小，遺傳穩(wěn)定；缺點(diǎn)：材料局限，轉(zhuǎn)化率低。3.原生質(zhì)體再生系統(tǒng)原生質(zhì)體恢復(fù)細(xì)胞壁具有分化再生能力，是應(yīng)用最早的再生受體系統(tǒng)之一。優(yōu)點(diǎn)：高效、廣泛地?cái)z取外源DNA或遺傳物質(zhì)，獲得基因型一致的克隆細(xì)胞，所獲轉(zhuǎn)基因植株嵌合體少，適用于多種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；缺點(diǎn)：不易制備、再生困難和變異程度高。334.胚狀體再生系統(tǒng)是指具有胚胎性質(zhì)的個(gè)體。優(yōu)點(diǎn)：個(gè)體數(shù)目巨大、同質(zhì)性好，接受外源基因能力強(qiáng)， 嵌合體少，易于培養(yǎng)、再生。缺點(diǎn)：技術(shù)含量高，多數(shù)植物不易獲得胚狀體。5.生殖細(xì)胞受體系統(tǒng)以生殖細(xì)胞如花粉粒、卵細(xì)胞等受體細(xì)胞進(jìn)行外源基因轉(zhuǎn)化

16、的系統(tǒng)。一是利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行小孢子和卵細(xì)胞的單倍體培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)；二是直接利用花粉和卵細(xì)胞受精過(guò)程進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，如花粉管導(dǎo)入法，花粉粒浸泡法，子房微針注射法等。34二、載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)化流程圖 外源基因 中間載體（pUC18，T-vector etc.） 啟動(dòng)子 篩選標(biāo)記基因 中間表達(dá)載體(pBI121, pCAMBIA etc.) 轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)中間表達(dá)載體 農(nóng)桿菌（co-integrated vector/ binary vector ) 轉(zhuǎn)化植物組織 （愈傷，胚軸，子葉等） 再生植株35目的基因的克隆與鑒定轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建E.Coli轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒抽提與鑒定農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化與活化外植體制備浸 染選擇培養(yǎng)共培養(yǎng)移栽繼代繁殖分子檢測(cè)生理檢測(cè)純化361、克隆目的基因37Recombinant DNA Is Formed by Splicing DNA From a Vector Into Host DNA38392. 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化與活化40挑單克隆414243測(cè)OD60044收集細(xì)胞45用液體MS培養(yǎng)基重懸細(xì)