新型納米仿生骨植入材料的生物相容性的初步研究

1、新型納米仿生骨植入材料的生物相容性的初步研究【摘要】研究新型納米仿生骨植入材料的生物相容性?！痉椒ā坎捎霉撬杌|(zhì)細胞體外培養(yǎng)技術，通過法檢測細胞相對增殖度，對材料的細胞毒性進展分級評價，并采用直接接觸培養(yǎng)法，觀察細胞在材料上的黏附與分布?！窘Y果】材料的細胞毒性分級在之間，骨髓基質(zhì)細胞可嚴密附著于材料外表，黏附生長，并有突起向材料的連通微孔內(nèi)伸展?！窘Y論】新型納米仿生骨植入材料對骨髓基質(zhì)細胞無毒性作用，符合醫(yī)用生物材料的平安要求?！娟P鍵詞】仿生復合材料骨髓基質(zhì)細胞浸提液生物相容性：【】【】，【】，-【】：；新型生物材料的生物相容性是影響其臨床應用的主要因素，材料的孔徑形狀、大小以及孔隙率對引導細

2、胞的附著、侵潤和生長有著重要的作用，由于本實驗材料需要植入體內(nèi)與骨組織嚴密接觸，因此材料的骨細胞相容性是本研究的主要內(nèi)容。本實驗采用骨髓基質(zhì)細胞的體外培養(yǎng)技術對新研制的新型納米仿生骨植入材料進展了初步評價，為今后進一步的研究提供實驗根據(jù)。材料和方法材料與儀器新型納米仿生骨植入材料：-羥基丁酸-羥基戊酸共聚物溶膠-凝膠生物活性玻璃-，華南理工大學材料學研究所提供。主要儀器和設備：醫(yī)用超凈工作臺、培養(yǎng)箱、臺式離心機、酶聯(lián)免疫檢測儀、倒置相差顯微鏡中山三院中心實驗室提供；-掃描電鏡能譜分析儀信息產(chǎn)業(yè)部電子五所國防科技重點實驗室提供。主要試劑和材料：培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶、等購自晶美生物制品公司。

3、實驗方法材料的掃描電鏡觀察常規(guī)枯燥、外表噴金，進展檢查，直接觀察材料的構造、多孔形態(tài)、孔徑和孔的貫穿性。材料的孔隙率測定采用常規(guī)稱量法，計算材料的孔隙率。骨髓基質(zhì)細胞的原代培養(yǎng)及傳代采用全骨髓培養(yǎng)法直接貼壁法進展原代培養(yǎng)，取傳代生長良好的代細胞制作細胞生長曲線。植入材料浸提液的制備植入材料用環(huán)氧乙烷消毒備用，確定材料浸提液的標準濃度為培養(yǎng)液與材料外表積之比：，將支架材料浸入完全培養(yǎng)液中，標準條件下，飽和濕度的培養(yǎng)箱中浸提，吸出浸提液，無菌封存，保存?zhèn)溆谩Ｍ瑯臃椒ㄖ苽浔?、倍、倍、倍、倍、倍標準濃度的浸提液。法評價材料的毒性分級根據(jù)已繪制的細胞生長曲線，確定本實驗的細胞接種濃度和接種的細胞數(shù)量，測

4、定不同浸提液濃度分組的細胞相對增殖率，按級毒性分級法評分：級；級；級；級；級。植入材料的細胞相容性將植入材料用高糖完全培養(yǎng)基浸泡，使用前用無菌濾紙吸干，置于孔板中。取生長狀態(tài)良好的第代培養(yǎng)細胞，調(diào)整細胞濃度為，滴加于材料外表接種于支架材料上，每塊材料上接種細胞液?滋，靜置后參加培養(yǎng)基至浸沒材料。常規(guī)換液一次，分別于、將細胞-材料復合物用或體積分數(shù)為戊二醛固定，乙醇逐級脫水，乙酸異內(nèi)酯置換，臨界點枯燥，外表噴金后掃描電鏡觀察。結果材料的構造材料呈白色，略有彈性，外表為泡沫多孔狀構造圖，掃描電鏡下見材料為疏松多孔構造，孔隙多并互相聯(lián)通，孔隙大小約?滋，其中可見納米級的顆粒鑲嵌或包裹在基體孔壁上圖。

5、材料的孔隙率材料孔隙率的檢測結果顯示：骨植入材料的細胞毒性實驗根據(jù)培養(yǎng)細胞的生長標準曲線，本研究骨植入材料浸提液進展細胞毒性分析的實驗分別在、分三次進展，在細胞培養(yǎng)的開場、進入快速增殖期、以及細胞數(shù)量到達極限值之前的三個時間段完成檢測。結果見表，可見各濃度組不同時期的毒性分級均在級之間。統(tǒng)計軟件分析研究結果顯示：隨著材料浸提液濃度的增高，值略有下降，但該變化并不具有顯著性差異；高濃度的材料浸提液對細胞生長的影響與低濃度相比并不存在顯著性差異；隨著培養(yǎng)時間的延長各實驗組細胞數(shù)量都明顯增加，、三個測試時間點上，各濃度組細胞增殖數(shù)值與對照組相比無明顯差異。不同濃度材料浸提液組，在、天時檢測的值變化曲

6、線圖顯示：各濃度組的值變化與對照組幾乎完全重疊。骨植入材料中細胞黏附和生長形態(tài)的觀察細胞培養(yǎng)第天，可見骨髓基質(zhì)細胞在材料外表嚴密貼壁生長，呈長梭形或有長突起的扁平多角形，突觸舒展明顯，相鄰細胞胞體相連，并向材料孔隙中伸延圖；細胞培養(yǎng)第天，可見大量骨髓基質(zhì)細胞在材料外表黏附、增殖，胞體呈梭形、多角形，細胞生長密集的地方可見細胞堆積復層生長圖；細胞培養(yǎng)第天，仍可見骨髓基質(zhì)細胞在材料外表黏附、生長，細胞呈不規(guī)那么形圖。討論充填材料的多孔構造與骨的生長骨再生具有三個根本機制，即骨誘導、骨傳導和骨生成。骨傳導是指宿主骨床周圍的毛細血管和骨祖細胞、成軟骨細胞和成骨細胞長入骨缺損區(qū)，而植入材料那么逐漸被宿主

7、新骨組織替代的過程。研究發(fā)現(xiàn)具有類似自然骨的連通微孔構造的材料，可以支持和引導新生骨組織通過互相連通的孔道向材料的叢深生長，為骨組織的再生提供理想的支架構造?？讖?、孔隙率以及孔的連通性是評價材料空間構造的幾個重要的指標。本研究采用的骨植入材料為疏松多孔構造，孔徑大小為，孔隙率?？紫抖嗲铱卓字g互相連通，有助于新骨組織從材料外表長入內(nèi)部和血液流通。同時大量的微孔以及較大的比外表積，不僅可使材料體積小，易降解，同時又能獲得足夠的機械強度，以滿足臨床治療的需要。骨植入材料的毒性分析材料的細胞毒性是評價生物材料與細胞之間互相作用的最重要的指標，而細胞相對增殖度，那么是材料細胞毒性評估中的一個重要參數(shù)。

8、本研究采用法來計算細胞，并將細胞相對增殖率換算成毒性分級級，來評估實驗材料的細胞毒性。研究結果顯示隨著材料浸提液濃度的增高，值有所下降，但該變化并不具有顯著性差異，說明該材料浸提液濃度的進步并不抑制細胞的生長、增殖；隨著培養(yǎng)時間的延長，各實驗組細胞數(shù)量都明顯增加，在、三個測試時間點上，各濃度組細胞增殖數(shù)值與對照組幾乎完全重疊，高濃度組的材料浸提液對細胞生長的影響與低濃度組相比并不存在顯著性差異，說明該材料浸提液的細胞毒性并未出現(xiàn)濃度依賴性，即使是高濃度的材料浸提液在細胞培養(yǎng)的開場、進入快速增殖期、以及細胞數(shù)量到達極限值之前的三個具代表性的時間段，都是平安、無毒的；倒置顯微鏡下可見各組各個時期的

9、細胞呈梭形，伸展充分，形態(tài)良好，細胞密度高，生長旺盛，可見大量分裂細胞，與對照組相比，無顯著性差異，說明各濃度組的細胞生長良好；各濃度組不同時期的毒性分級均在級之間，說明該材料對骨髓基質(zhì)細胞無細胞毒性作用，符合生物材料的醫(yī)用標準。本研究的骨植入材料共制備了終濃度為倍、倍、倍、倍、倍、倍、倍標準濃度的種浸提液，較全面地討論了該材料浸提液的細胞毒性。同時本研究根據(jù)材料植入體內(nèi)部位和使用目的的要求，選擇骨髓基質(zhì)細胞作為體外培養(yǎng)的實驗細胞，更好地模擬出了植入材料在體內(nèi)骨組織中的真實情況，準確地反映出實驗材料的細胞毒性及其與骨髓基質(zhì)細胞間的互相作用。骨植入材料的細胞相容性觀察植入材料與細胞之間的互相作用是研究植入材料細胞相容性的重要內(nèi)容，采用直接接觸的細胞培養(yǎng)法，可以直接觀察到細胞在材料外表貼附的情況，一旦材料中有毒性物質(zhì)釋放時，細胞的形態(tài)、數(shù)量和增殖狀態(tài)會立即發(fā)生變化，為材料的細胞相容性提供最直觀的證據(jù)，其評價結果客觀、敏感和有效。本研究結果顯示：骨髓基質(zhì)細胞能嚴密附著于植入材料外表，貼附生長，并有突起向材料的連通微孔內(nèi)伸展，增殖狀態(tài)良好，結果證實該材料具有優(yōu)良的細胞親和性，這可能與材料的構造有關。由于植入材料具有泡沫多孔狀構造，具有大小適宜的孔徑、較高