第四組液相色譜法測定對位紅

1、液相色譜法測定對位紅第四組：李陽 吳凱 王雨婷 葛鈺蓉1 目前對于食品中的對位紅測定方法主要采用薄層色譜法“液相色譜分析法”列和液相色譜質(zhì)譜分析法等，其中法定檢測方法包括歐盟委員會規(guī)定的辣椒粉中蘇丹紅測定的高效液相色譜法測定和我國質(zhì)檢總局頒布的食品中蘇丹紅染料的檢測方法高效液相色譜法(GBT196812005)，但這兩類標(biāo)準(zhǔn)檢測方法中存在一定的技術(shù)缺陷，如樣品本底干擾定性結(jié)論、固體萃取柱的活性難于控制、均未涉及對“對位紅”的檢測方法建立、對檢測的干擾等。本方案針對標(biāo)準(zhǔn)實施過程中可能出現(xiàn)的復(fù)雜問題，探討了在提取、分析方面的條件優(yōu)化，使液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀能滿足日常的檢測工作的需要。2一、對位紅的簡

2、介對位紅亦稱對硝苯胺紅，常溫下呈固態(tài)，密度1.50g/cm3,熔點248-252。是一種常用的紅色顏料，屬于重氮系列化工合成染色劑，主要應(yīng)用于機油，蠟，油彩，汽油等工業(yè)產(chǎn)品。對位紅的熔點即已達到250 ，明顯不能采用氣相色譜法來進行檢驗，因為樣品很難汽化。所以我們采用液相色譜法來對其進行檢測。3 物化性質(zhì)1、物理性質(zhì)： 對位紅亦稱對硝苯胺紅，常溫下呈固態(tài)，密度1.50g/cm3,熔點248-252。是一種常用的紅色顏料，屬于重氮系列化工合成染色劑，主要應(yīng)用于機油，蠟，油彩，汽油等工業(yè)產(chǎn)品。2.化學(xué)性質(zhì) 它和引發(fā)英國有史以來最大一起食品召回行動的“蘇丹紅”染料相似，都是工業(yè)上使用的化學(xué)物質(zhì)，都被

3、禁止在食品染色劑中使用。據(jù)牛津大學(xué)物理與理論化學(xué)實驗室的化學(xué)品安全信息介紹，“對位紅”對眼睛、皮膚和呼吸系統(tǒng)有刺激性，但其毒性尚在研究中，沒有明確的結(jié)論。4二、對位紅檢測及標(biāo)準(zhǔn)檢測方法一、液相色譜法 1.高效液相色譜法 2.凝膠凈化液相色譜法 3.反相高效液相色潽法二、分光光度法-紫外可見分光光度計5二、檢測方法1、1 高效液相色譜法實驗室操作方案儀器：天美液相色譜儀、超聲清洗器、無油真空泵及溶劑過濾裝置、濾膜過濾器、平頭微量進樣器試劑：乙腈（色譜純）、冰醋酸。色譜條件： 色譜柱選用C18柱（柱長15cm）；柱溫： 30；進樣量： 20 L；樣品運行時間： 15 min； VWD 波長選用48

4、5 nm，作為對位紅的檢測波長；流動相為乙腈:水/ 90:10，不需要緩沖6 步驟：（1）取乙腈400ml，用0.45um的有機濾膜過濾后置于原瓶。取16ml冰醋酸溶于100ml蒸餾水中，用0.45um的水相濾膜過濾后置于乙腈瓶中，貼上標(biāo)簽。超聲波清洗器脫氣15min。將配置好的流動相置于色譜儀旁的籃筐內(nèi)，放入流動相吸液管。（2）準(zhǔn)確稱取1-（4-硝基苯基偶氮）-2-萘酚10mg，用經(jīng)過濾及脫氣后的乙腈定容至100ml，作為標(biāo)準(zhǔn)貯備液，濃度為100ug/ml。分別吸取該儲備液0.10、0.20、0.40、0.80、1.00ml置于100ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度，即配成對位紅濃度分別為0.

5、10、0.20、0.40、0.80、1.00ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液7（3）準(zhǔn)確稱取對位紅樣品10.0mg，用經(jīng)過濾及脫氣后的乙腈定容至100ml，從中取1ml再用乙腈稀釋至100ml。（4）打開液相色譜儀電源開關(guān)，開高壓輸液泵開關(guān)。設(shè)定流動相A通道流量為100%，設(shè)流動相流速為1ml/min。（5）啟動泵開關(guān)，打開紫外檢測器電源開關(guān)。設(shè)定檢測波長為480nm（6）打開液相色譜工作站，選擇通道。（7）觀察基線狀態(tài)，當(dāng)基線走直后，即可進樣。（8）開始進樣：平頭微量注射器用乙腈清洗5次，廢液排到濾紙上。將進樣閥柄置于“l(fā)oad”位置。8（9）在注射器中吸入標(biāo)樣或試樣60ul，注入進樣口，重復(fù)3次，此時

6、對定量管進行了清洗。（10）吸入標(biāo)樣60ul。將標(biāo)樣注入進樣口，順時針旋動進樣閥至“inject”位置。此時工作站開始自動計時。（11）數(shù)據(jù)采集：從計算機顯示屏上可以看到樣品的流出過程和分離狀況，待所有的色譜峰流出完畢后，按“stop“鍵停止分析。記錄保留時間及色譜峰面積。（12）結(jié)束工作：所有樣品分析完畢后，讓流動相繼續(xù)流動1020min。關(guān)閉色譜工作站、關(guān)閉檢測器電源、關(guān)閉液相色譜儀電源開關(guān)。9數(shù)據(jù)處理：（1）繪制工作曲線：以對位紅標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線（2）從曲線上直接查的未知試樣對應(yīng)的質(zhì)量分數(shù)。數(shù)據(jù)處理：保留時間：4.521峰高：210123峰面積：2

7、21456101.2凝膠凈化液相色譜法優(yōu)點：操作簡單，填充完凝膠柱后可重復(fù)使用，實際用量少于歐盟及國標(biāo)方法，并且用淋洗液替代劇毒而又昂貴的乙腈進行提取，自制凝膠柱凈化富集避免了歐盟方法用乙腈直接萃取進樣對色譜柱壽命的影響及雜質(zhì)峰的干擾，也避免了國標(biāo)方法中采用氧化鋁柱凈化活度難以控制的麻煩，一次進樣可同時檢測食品中對位紅、蘇丹紅的含量應(yīng)用范圍：食品及調(diào)味品中對位紅、蘇丹紅的檢測儀器及試劑：Agilent 1100 高效液相色譜儀(含二極管陣列檢測器、柱溫箱、自動進樣器)層析柱 1. 6 cm 50 cm ,填充Bio2Beads S2X3凝膠。蘇丹紅、及對位紅標(biāo)準(zhǔn)品,純度均大于95 % ,配制時

8、用少量三氯甲烷溶解,乙腈定容為0. 500 0 g L - 1 儲備液(按實際含量折算) ,使用時用乙腈稀釋至所需濃度。11色譜條件色譜柱Zorbax SB2C18 ( 4. 6 mm 250 mm ,5m) ;流動相:乙腈(A) + 酸性水溶液(用乙酸調(diào)至約p H 4. 0) ; 洗脫程序: 0 9 min A 90 %; 9 12 min ;A 線性變化到100 % ,保持5 min 后回到初始比例;流速1. 0 mL min - 1 ;柱溫35 ;進樣量20L ;二極管陳列檢測器,程序可變波長見表1 。121.3反相高效液相色潽法簡介：在推薦參考方法的基礎(chǔ)上,對分離和色譜條件加以改進、優(yōu)

9、化、選擇,用于幾種含對位紅食品采用擬定的方案進行分離檢測。結(jié)果:方法的檢出限為011g/ml,標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)( r) 019999,在014-116g/ml添加水平間,加標(biāo)的回收率95% 105% , RSD 019% 911%。改進的方法準(zhǔn)確可靠,檢測效率高,具有實際應(yīng)用意義。應(yīng)用：測定食品中對位紅的殘留量13儀器、試劑及色譜條件儀器設(shè)備Waters 2695 型高效液相色譜儀。Waters、996型二極管陣列紫外檢測器。MilliQ p lus型超純水器,美國Millipore公司產(chǎn)品。超聲波清洗器。試劑對位紅標(biāo)準(zhǔn)品(95% ,Acros Organics, USA) ;乙腈(分析

10、純和色譜純) 。色譜條件色譜柱,MERCK L ichrocart 250 - 4 L ichrospher100 RP -18, 4 250 mm, 5m; 流動相: 水+乙腈( 5 + 95 ) ; 流速:110 ml/min;檢測波長: 485 nm;進樣量: 10l。142.1 .分光光度法-紫外可見分光光度計應(yīng)用范圍：1.檢定物質(zhì) 根據(jù)吸收光譜圖上的一些特征吸收，特別是最大吸收波長雖ax和摩爾吸收系數(shù)是檢定物質(zhì)的常用物理參數(shù)。這在藥物分析上就有著很廣泛的應(yīng)用。在國內(nèi)外的藥典中，已將眾多的藥物紫外吸收光譜的最大吸收波長和吸收系數(shù)載入其中，為藥物分析提供了很好的手段。 2.與標(biāo)準(zhǔn)物及標(biāo)準(zhǔn)

11、圖譜對照 將分析樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品以相同濃度配制在同一溶劑中，在同一條件下分別測定紫外可見吸收光譜。若兩者是同一物質(zhì)，則兩者的光譜圖應(yīng)完全一致。如果沒有標(biāo)樣，也可以和現(xiàn)成的標(biāo) 準(zhǔn)譜圖對照進行比較。這種方法要求儀器準(zhǔn)確，精密度高，且測定條件要相同。 3.比較最大吸收波長吸收系數(shù)的一致性 4.純度檢驗 5.推測化合物的分子結(jié)構(gòu) 6.氫鍵強度的測定 實驗證明，不同的極性溶劑產(chǎn)生氫鍵的強度也不同，這可以利用紫外光譜來判斷化合物在不 同溶劑中氫鍵強度，以確定選擇哪一種溶劑 。 7.絡(luò)合物組成及穩(wěn)定常數(shù)的測定 8.反應(yīng)動力學(xué)研究9.在有機分析中的應(yīng)用 15簡介 在分光光度計中，將不同波長的光連續(xù)地照射到一定濃度的樣品溶液時，便可得到與眾不同波長相對應(yīng)的吸收強度。如以波長（）為橫坐標(biāo)，吸收強度（A）為縱坐標(biāo)，就可繪出該物質(zhì)的吸收光譜曲線。利用該曲線進行物質(zhì)定性、定量的分析方法，稱為分光光度法，也稱為吸收光譜法。用紫外光源測定無色物質(zhì)的方法，稱為紫外分光光度法。16三、對位紅檢測方案的確定結(jié)論：選用高效液相色譜法理由：對位紅的熔點為248-252度，很難汽化，明顯不能用氣相色譜法來進行檢測。 以高效液相色譜法的檢測為基礎(chǔ)的方法成本相對較低，且應(yīng)用廣泛。 根據(jù)學(xué)校實驗室器材選擇的要求可知，選用高效液相色譜法滿足要求。17測定所需儀器：UV7504型紫外可見分光光度計，比色皿，材料與試劑：對位