血紅蛋白的提取和分離-PPT課件

1、血紅蛋白的提取和分離 體驗從復(fù)雜體系中提取生物大分子的基本過程和方法，并了解凝膠色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理。1、主要概念：凝膠色譜法 電泳法 緩沖溶液 它們在血紅蛋白的提取中分別起到什么作用。2、主要原理：凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理 電泳法分離樣品的原理 緩沖溶液的組成和作用機(jī)理3、課題重點：凝膠色譜法的原理和方法 4、課題難點：樣品的預(yù)處理 色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填。學(xué)習(xí)目標(biāo)一、凝膠色譜法（分配色譜法） 根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，來進(jìn)行分離。 大多數(shù)凝膠是由多糖類化合物（如葡聚糖或瓊脂糖）構(gòu)成的多孔小球體，內(nèi)部有許多貫穿

2、的通道。.概念：.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理和具體過程.凝膠色譜法的原理分子篩效應(yīng)： 當(dāng)相對分子量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相對分子量較小的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程較長，移動速度較慢；而相對分子量較大的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動，路程較短，移動速度較快。相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以分離。依據(jù)的特性是：蛋白質(zhì)分子量的大小。凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)過程的動畫演示二、緩沖溶液1.概念:在一定的范圍內(nèi)，凡是能夠抵制外加少量強(qiáng)酸或強(qiáng)堿的影響使原來溶液pH值基本保持不變的混合溶液。2.緩沖溶液的組成舉例：H2CO3 NaHCO3、CH3COOH CH3COONaNaH2P

3、O4 Na2HPO4、KH2PO4 K2HPO43.緩沖溶液的配制在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。瓊脂糖凝膠電泳示意圖.概念：帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程。三、電泳：血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳.電泳原理： 電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。.常見電泳類型：瓊脂糖凝膠電泳聚丙稀酰胺凝膠電泳SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小、形狀。電泳遷移率完全取決于分子的大小。課外拓展：用SDS測定蛋白質(zhì)分子量的方法 使用SDS聚丙烯酰胺凝膠電

4、泳測定蛋白質(zhì)的分子量時，可選用一組已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白同時進(jìn)行電泳，根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳區(qū)帶位置，用電泳遷移率和分子量的對數(shù)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以測定未知蛋白質(zhì)的分子量。市場上有高分子量、次高分子量及低分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑出售。實踐訓(xùn)練1.在凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)中，所用凝膠的化學(xué)本質(zhì)是( ) A.糖類化合物 B.脂質(zhì) C.蛋白質(zhì) D.核酸2.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳中決定蛋白質(zhì)或多肽移動速度的主要因素是( ) A.蛋白質(zhì)分子所帶的電荷 B.蛋白質(zhì)分子的形狀 C.蛋白質(zhì)分子的相對質(zhì)量 D.緩沖溶液的pHCA3.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時，凝膠的種類較多，但其作用的共同點是( ) A.改變蛋白質(zhì)分

5、子通過凝膠時的路徑 B.吸附一部分蛋白質(zhì)，從而影響蛋白質(zhì)分子的移動速度 C.將酶或細(xì)胞固定在凝膠中 D.與蛋白質(zhì)分子進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，從而影響其移動速度4.在利用凝膠電泳法分離蛋白質(zhì)時，一定要加入緩沖液，其作用主要是( ) A.使酶的活性最高 B.使蛋白質(zhì)的活性最高 C.維持蛋白質(zhì)所帶的電荷 D.使蛋白質(zhì)帶上電荷AC1.分離生物大分子的基本思路： 選用一定的物理或化學(xué)的方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。2.蛋白質(zhì)分離和提取的原理： 根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對其他分子的親和力等等，可以用來分離不同種類的蛋白質(zhì)。四、實驗操作血紅蛋

6、白的提取和分離水 分固體物質(zhì)血液血漿血細(xì) 胞白細(xì)胞血小板紅細(xì)胞（最多）血紅蛋白兩個肽鏈兩個肽鏈四個亞鐵紅素基團(tuán)思考血液有哪些成分？血漿蛋白無機(jī)鹽磷脂葡萄糖等血紅蛋白的特點：血紅蛋白兩個肽鏈兩個肽鏈四個亞鐵紅素基團(tuán)樣品處理粗分離純化純度鑒定1.樣品處理：.蛋白質(zhì)提取和分離步驟.凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)操作步驟思考：人們用雞的紅細(xì)胞提取DNA，用豬、牛、羊的紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因是什么？答：雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核，含有DNA，便于進(jìn)行DNA的提取，哺乳動物成熟的紅細(xì)胞無細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡單，血紅蛋白含量豐富便于提取血紅蛋白。洗滌操作：(1)紅細(xì)胞的洗滌:洗滌目的:去除雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化，

7、洗滌次數(shù)不可過少。柜式離心機(jī)初次離心后的結(jié)果3次洗滌后的結(jié)果磁力攪拌器攪拌器轉(zhuǎn)子攪拌器正在工作(2)血紅蛋白的釋放（使用蒸餾水和甲苯）(3)分離血紅蛋白溶液：甲苯層（無色透明）；脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色薄層固體）；血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）；雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）。過濾：除去脂溶性物質(zhì)沉淀層和雜質(zhì)沉淀層。(4)透析(粗分離)：過程：取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol/l的磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12小時。透析目的：除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)。利用透析袋透析透析過程動畫演示2.凝膠色譜操作:.凝膠色譜柱的制作：注意事項：底塞中

8、插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實尼龍網(wǎng)，還會導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。.凝膠色譜柱的裝填凝膠的選擇：凝膠的前處理：凝膠色譜柱的裝填方法：注意：1.凝膠裝填時盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。 2.裝填凝膠柱時不得有氣泡存在：因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時。注意：1.液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。2.不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)

9、象。50cm高裝配好的凝膠柱.樣品加入與洗脫調(diào)節(jié)緩沖液面滴加透析樣品注意：正確的加樣操作是：1.不要觸及并破壞凝膠面。2.貼壁加樣。3.使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。樣品滲入凝膠床洗脫收集注意：在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功。開始進(jìn)行層析收集得到的純化后的蛋白思考下面的問題：1、在血紅蛋白的整個過程中不斷用磷酸緩沖液處理的目的是什么？答：讓血紅蛋白處在穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，維持結(jié)構(gòu)和功能。2、與其他真核細(xì)胞相比，紅細(xì)胞有什么特點？這一特點對你進(jìn)行蛋白質(zhì)得分離有什么意義？答：血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋白的

10、分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。 1、(多選)關(guān)于血紅蛋白分子的敘述正確的是( ) A.兩個肽鏈，兩個肽鏈，一個亞鐵血紅素基團(tuán) B.兩個肽鏈，兩個肽鏈，四個亞鐵血紅素基團(tuán) C.亞鐵血紅素能與CO2結(jié)合 D.血紅蛋白在人體主要運輸能源物質(zhì)2.下列各項中，一般不影響在凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)中的分離度的是( ) A.層析柱高 B.層析柱的直徑 C.緩沖溶液 D.樣品的分布3.蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步，即、和。后三步常用的方法依次是、。 B粗分離純化樣品處理純度鑒定透析法凝膠色譜法SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳BC觀察你處理的血液樣品離心后是否分層，如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋

11、白的原因。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。結(jié)果分析與評價.你是否完成了對血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？.你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍(lán)色葡聚糖2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。 如果凝