HPLC純化蛋白

1、HPLC純化蛋白已經記不得課堂上關于HPLC的知識是哪位老師講的了，或許那時她給講睡著了，所以，錯過的知識點，實驗課堂上被屏蔽的信號，總是一片空白。然而，重新走進HPLC,連不上記憶，更談不上溫故而知新，只得重新查找各種資料,本文詳細的簡述了HPLC的定義、分離模式、種類，供沒有背景知識的讀者參考。我相信，離開課堂的你，總會和我一樣，慢慢地找到未來自己想要抓住的知識，并細細鉆研?？梢灾厥罢n堂上的知識，只是時光再也回不去如果時光可以-直美好那就靜悄悄的睡下去-可是-色譜法最早應用于植物色素的分離，1906年俄國植物學家茨維特用碳酸鈣作為固定相填充豎立的玻璃管，植物色素的提取液流經固定相，經過石油

2、醚進行洗脫之后，植物色素在碳酸鈣柱中由一條色帶分散為數條平行的色帶，色譜法(Chromatography)因之得名。經典的液相色譜法開始階段是在室溫和常壓下，在大直徑的玻璃管柱內利用液位差輸送流動相，此方法柱效低、時間長。高效液相色譜法(HighperformanceLiquidChromatography,HPLC)是在經典液相色譜法的基礎上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。它與經典液相色譜法的區(qū)別是固定相填料顆粒小而均勻,小顆粒具有高柱效,以高壓驅動輸送流動相,分離工作在幾個小時甚至幾十分鐘內完成，故又稱高壓液相色譜法(HighPressureLiquidChromato

3、graphy，HPLC)，又因分析速度快而稱為高速液相色譜法(HighSpeedLiquidChromatography，HSLP)。高效液相色譜法(HighperformanceLiquidChromatography,HPLC)利用不同蛋白質的分子量大小、形狀、帶電荷性質、疏水性、親和性不同來分離檢測蛋白質的技術。溶于流動相(mobilephase)中的各組分經過固定相時，由于與固定相(stationaryphase)發(fā)生作用(配基親和性吸附、不同物質在不同相態(tài)的選擇性分配、離子間吸引作用、分子量排阻)的大小、強弱不同，以不同的速度流經固定相，最終達到分離蛋白的作用，又稱為色層法、層析法。

4、在此基礎上發(fā)展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法。HPLC由液體輸送系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、色譜柱和檢測系統(tǒng)4部分所組成。輸液泵將流動相樣品以穩(wěn)定的流速(或壓力)輸送至分析體系，通過進樣品導入色譜柱，在色譜柱中各組分依照分配系數、吸附力大小、帶電性質、疏水性、親和性以及蛋白質的分子量大小的差異而被分離，并依次隨流動相流至檢測器，將檢測到的信號送至數據系統(tǒng)記錄、處理或保存，目前HPLC技術廣泛的應用于蛋白質的分離和檢測。根據蛋白質在物理、化學及功能上的差異選擇不同的HPLC分離模式來分離目標蛋白，常見的分離模式有：反相高效液相色譜(reversephasehigh-perfor-mancel

5、iquidchromatography，RPHPLC)在HPLC各種模式中，RP-HPLC應用最為廣泛。蛋白質分子混合物在RP-HPLC模式系統(tǒng)中因其極性的差異而分離，且蛋白質分子因其疏水性的不同在兩相中的分配也不同。一般其固定相是非極性的(如C18、C8)，而流動相是比固定相極性更強的溶劑系統(tǒng)，流動相一般為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調節(jié)保留時間。當使用RP-HPLC進行蛋白質分離時，一般需要低pH值流動相，室溫或較高的溫度及使用乙腈或異丙醇作為有機部分，另外，三氟乙酸(TFA)是反相色譜中最常用的離子對試劑。常用緩沖液控制流動相的pH值，但需要

6、注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.57.5(28)，太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。因為蛋白質通常具有強極性，所以蛋白質的保留性質和選擇性還與鍵合固定相的性質有關，蛋白質與C18的結合較困難，實驗表明，大孔硅膠(2030nm)短鏈烷基(C4和C8)鍵合固定相適合蛋白質的分離。高效親和色譜(highperformanceaffinitychro-matography，HPAFC)蛋白質與層析載體上固相化的配體之間通過共價鍵、范德華力、疏水力、靜電力等作用發(fā)生生物學專一性結合，鏈接在載體表面的功能團配體上，能與特異性蛋白質大分子發(fā)生親和作用的基團如酶的作用底物，

7、輔酶，激素受體，抗原與抗體的結合，這種高度專一性結合特性可用于親和色譜分離。HPAFC是蛋白質檢測中最專一的分離技術,可以從復雜的混合物中直接分離到目標蛋白質，特別適合疫苗、糖蛋白和抗體等的分離純化高效離子交換色譜(highperformanceionex-changechromatography，HPIEC)HPIEC是以離子交換劑為固定相，常見的離子交換劑是由一類不溶于水的惰性高分子聚合物基質共價結合某種電荷基團，形成帶基質，平衡離子可以通過靜電力作用結合在電荷基質上，樣品流動相中的離子可與平衡離子進行可逆交換而吸附在電荷基質上。離子交換色譜是根據蛋白質分子在一定的pH和離子強度條件下所帶

8、電荷和固定相上的離子間結合力的差別而進行分離的一種層析方法。近幾年來HPIEC也成為分離檢測蛋白質的重要方法。高效凝膠過濾色譜(highperformancesizeexclu-sionchromatography，HPSEC)凝膠過濾色譜也稱體積排阻色譜(Sizeexclusionchromatography,SEC),是根據蛋白相對分子大小進行分離的一種色譜技術。固定相具有分子篩的作用，流動相為樣品溶液，當不同分子大小的樣品同時流經凝膠層析柱時，比孔穴孔徑大的分子不能進入到凝膠孔內部，被排阻在孔外，隨流動相向下流動，最先流出柱子；而較小的分子滲透進入凝膠孔內部，流動速度慢，路程長，最后流出；而分子大小介于兩者之間的樣品在流動中部分滲透，滲透的程度取決于它們分子的大小，流出時間介于兩者之間，分子越大的組分越先