研究黃芪精中黃芪甲苷

1、研究黃芪精中黃芪甲苷含量測(cè)定的新方法發(fā)表人：盧晶晶揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司飛躍QC小組Yangtze River Pharmaceutical Group揚(yáng) 子 江 藥 業(yè) 集 團(tuán)1陽(yáng)山書(shū)屋一產(chǎn)品概況黃芪精是我公司開(kāi)發(fā)研制的虛癥類(lèi)OTC產(chǎn)品，為補(bǔ)血養(yǎng)氣，固本止汗之良藥。其療效佳，口感好，攜帶方便。 Yangtze River Pharmaceutical Group揚(yáng) 子 江 藥 業(yè) 集 團(tuán)2陽(yáng)山書(shū)屋二.小組概況(一)小組簡(jiǎn)介 小組名稱(chēng)飛躍QC小組課題注冊(cè)號(hào)TZ2005015課題類(lèi)型創(chuàng)新型小組成員8人成立時(shí)間2005.10活動(dòng)時(shí)間2005.102006.4課題名稱(chēng)研究黃芪精中黃芪甲苷含量測(cè)定的新

2、方法活動(dòng)次數(shù)19次出勤率100%制表人：張集盤(pán) 日期：2006.3 .20Yangtze River Pharmaceutical Group揚(yáng) 子 江 藥 業(yè) 集 團(tuán)3陽(yáng)山書(shū)屋(二)QC小組成員一覽表序號(hào)姓名性別受教育情況職務(wù)組內(nèi)分工1張集盤(pán)男大專(zhuān)標(biāo)準(zhǔn)研究員組長(zhǎng)，資料整理2黃新蘭女本科，工程師，質(zhì)量管理工程師QC主管副組長(zhǎng)，技術(shù)指導(dǎo)3馬 軍男大專(zhuān)標(biāo)準(zhǔn)研究員方案實(shí)施4盧晶晶女本科標(biāo)準(zhǔn)研究員方案實(shí)施，成果匯報(bào)5陸莉娟女大專(zhuān)標(biāo)準(zhǔn)研究員方案實(shí)施6祖若玉女大專(zhuān)標(biāo)準(zhǔn)研究員方案實(shí)施7牛 萍女碩士，高工，質(zhì)量管理工程師質(zhì)管經(jīng)理技術(shù)指導(dǎo)8季洪英女大專(zhuān)，工程師，質(zhì)量管理工程師質(zhì)管部長(zhǎng)技術(shù)指導(dǎo)制表人：張集盤(pán) 日期

3、：2006.3.204陽(yáng)山書(shū)屋三選擇課題1.薄層掃描法測(cè)定黃芪精中黃芪甲苷含量的缺陷分析5陽(yáng)山書(shū)屋1.1.掃描時(shí)基線不穩(wěn)定6陽(yáng)山書(shū)屋1.2.容易出現(xiàn)鬼峰7陽(yáng)山書(shū)屋1.3.檢測(cè)偏差大，方法的準(zhǔn)確性較差8陽(yáng)山書(shū)屋1.4.薄層板展開(kāi)耗時(shí)長(zhǎng)，且一塊薄層板只能點(diǎn)一個(gè)批號(hào)的供試品，檢測(cè)批次很有限，導(dǎo)致出成品檢測(cè)報(bào)告的周期較長(zhǎng)。1.5.按照部頒標(biāo)準(zhǔn)，以薄層掃描法 （TLCS）對(duì)黃芪精中黃芪甲苷進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果如下。9陽(yáng)山書(shū)屋黃芪精按部頒標(biāo)準(zhǔn)含量測(cè)定結(jié)果批 號(hào)含量（mgml-1）含量平均值（mgml-1）相對(duì)平均偏差（%）030301-10.114120.105260.109694.1030401-10.1

4、10680.106490.108582.0030501-10.126550.119450.123002.9030601-10.120410.113520.116963.0030702-10.129010.119300.124164.0030801-10.125070.133710.129393.4制表人：張集盤(pán) 日期：2005.11.3TLCS法測(cè)定本品含量時(shí)偏差大，不利于產(chǎn)品質(zhì)量的控制。10陽(yáng)山書(shū)屋2.課題確定 研究黃芪精中黃芪甲苷含量測(cè)定的新方法可供直接借鑒的方法少黃芪化學(xué)成分復(fù)雜黃芪為君藥黃芪甲苷為主要有效成分11陽(yáng)山書(shū)屋四.設(shè)定目標(biāo)擬制定黃芪精中黃芪甲苷含量測(cè)定的新方法的回收率不低于9

5、0%；含量測(cè)定結(jié)果的相對(duì)平均偏差小于2.0%。12陽(yáng)山書(shū)屋五提出并選擇最佳方案 1.提出方案（1）HPLC-UV（高效液相色譜-紫外檢測(cè)器）法（2）HPLC-RI（高效液相色譜-示差折光檢測(cè)器）法（3）HPLC-ELSD（高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器）法13陽(yáng)山書(shū)屋 2.方案的分析、評(píng)估與確定序號(hào)方 案 內(nèi) 容原 理 分 析評(píng)估人方 案 評(píng) 估綜合得分方案選定可操作性準(zhǔn)確性經(jīng)濟(jì)性1HPLC-UV（高效液相色譜-紫外檢測(cè)器）法利用黃芪甲苷在203nm處有末端吸收的原理,建立以乙腈-水（32：68）為流動(dòng)相的HPLC-UV法張集盤(pán)44因在203nm處干擾大不選黃新蘭馬 軍盧晶晶陸莉娟祖若玉牛 萍

6、季洪英14陽(yáng)山書(shū)屋序號(hào)方 案 內(nèi) 容原 理 分 析評(píng)估人方 案 評(píng) 估綜合得分方案選定可操作性準(zhǔn)確性經(jīng)濟(jì)性2HPLC- RI（高效液相色譜-示差折光檢測(cè)器）法樣品組分折射率與流動(dòng)相溶劑折射率有差異，當(dāng)組分洗脫出來(lái)時(shí)，會(huì)引起流動(dòng)相折射率的變化，該變化與樣品組分的濃度成正比 張集盤(pán) 32因靈敏度不高不選黃新蘭 馬 軍 盧晶晶 陸莉娟 祖若玉 牛 萍 季洪英 15陽(yáng)山書(shū)屋序號(hào)方 案 內(nèi) 容原 理 分 析評(píng)估人方 案 評(píng) 估綜合得分方案選定可操作性準(zhǔn)確性經(jīng)濟(jì)性3HPLC-ELSD （高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器）法 ELSD可以對(duì)所有揮發(fā)性低于流動(dòng)相的物質(zhì)作出準(zhǔn)確檢測(cè),而與被檢測(cè)物質(zhì)的化學(xué)基團(tuán)關(guān)系不

7、大,響應(yīng)值與樣品的質(zhì)量成正比張集盤(pán)76因檢測(cè)范圍廣、靈敏度高，故選定黃新蘭馬 軍盧晶晶陸莉娟祖若玉牛 萍 季洪英 備注：可操作性、準(zhǔn)確性、經(jīng)濟(jì)性三個(gè)指標(biāo)均以1分（一般）、3分（良好）、5分（顯著）為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，上述綜合得分為QC小組成員所評(píng)分?jǐn)?shù)的總和。16陽(yáng)山書(shū)屋3.確定方案的采用順序（3）HPLC-ELSD（高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器）法（1）HPLC-UV（高效液相色譜-紫外檢測(cè)器）法（2）HPLC-RI（高效液相色譜-示差折光檢測(cè)器）法PDCA17陽(yáng)山書(shū)屋六制定對(duì)策 根據(jù)以上選擇的最佳方案制訂對(duì)策表對(duì) 策目 標(biāo)措 施地 點(diǎn)時(shí) 間負(fù)責(zé)人色譜條件的確定峰形對(duì)稱(chēng)，目標(biāo)峰與相鄰峰分離度不小于1

8、.5，保留時(shí)間適中對(duì)不同的色譜柱、流動(dòng)相、流速等進(jìn)行摸索，盡量與藥典中黃芪藥材含量測(cè)定的色譜條件劃一儀器室05.11.2105.11.28張集盤(pán)馬 軍供試品前處理方法的選擇有效地提取目標(biāo)物且操作方便摸索科學(xué)、準(zhǔn)確的供試品前處理方法，盡量與藥典中黃芪藥材含量測(cè)定的前處理方法劃一儀器室05.12.0505.12.17張集盤(pán)馬 軍盧晶晶陸莉娟18陽(yáng)山書(shū)屋對(duì) 策目 標(biāo)措 施地 點(diǎn)時(shí) 間負(fù)責(zé)人線性關(guān)系的確定 相關(guān)系數(shù)大于0.9990配制至少5個(gè)系列濃度，選擇適當(dāng)?shù)那€擬和類(lèi)型進(jìn)行確定 儀器室 06.01.0506.01.20 張集盤(pán)馬 軍盧晶晶精密度試驗(yàn) 峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD2.0% 同一供試品至

9、少連續(xù)進(jìn)樣5次，考查色譜峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） 儀器室 06.02.0506.02.11 張集盤(pán)馬 軍祖若玉19陽(yáng)山書(shū)屋對(duì) 策目 標(biāo)措 施地 點(diǎn)時(shí) 間負(fù)責(zé)人重復(fù)性試驗(yàn) 含量測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD2.0%同一批號(hào)的供試品同一人同一儀器平行操作6份，考查含量測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） 儀器室 06.02.1306.02.18 張集盤(pán)穩(wěn)定性試驗(yàn)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD2.0% 同一供試品分別在0、2、4小時(shí)進(jìn)樣分析，考查色譜峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）儀器室 06.02.2006.02.23 張集盤(pán)馬 軍盧晶晶祖若玉 20陽(yáng)山書(shū)屋對(duì) 策目 標(biāo)措 施地 點(diǎn)時(shí) 間負(fù)責(zé)人方法回收率

10、試驗(yàn) 方法回收率不低于90% 同一批號(hào)已知含量的供試品加入適量的對(duì)照品（或?qū)φ掌啡芤海┢叫胁僮?份，考查方法回收率 儀器室 06.02.2506.03.10張集盤(pán)馬 軍陸莉娟 制表人：張集盤(pán) 日期：2005.11.421陽(yáng)山書(shū)屋七對(duì)策實(shí)施實(shí)施一：色譜條件的確定1.儀器與試藥 Agilent1100高效液相色譜儀；Attech2000蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；梅特勒AG285電子天平。 黃芪精；天津農(nóng)藥總廠D101型大孔吸附樹(shù)脂；甲醇、乙腈為色譜純；95%乙醇為分析純；水為超純水。22陽(yáng)山書(shū)屋2.對(duì)照品溶液的制備取黃芪甲苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解，配制成0.1 mgml-1的對(duì)照品溶液。3.供試品溶液的制

11、備精密量取本品10ml，置分液漏斗中，加水10ml，搖勻，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次20ml，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状?0ml使溶解，0.45 m有機(jī)系微孔濾膜濾過(guò)，即得。23陽(yáng)山書(shū)屋4.色譜條件的確定24陽(yáng)山書(shū)屋色譜條件篩選圖1色譜柱：Agilent XDB-C18柱（4.6150 mm，5m）流動(dòng)相：乙腈-水 (40：60)柱溫：40流速：1.2mlmin-1min24681012mAu100200300400500600700 ADC1 A, ADC1 CHANNEL A (ZJPHQJ21528.D) 1.405 7.

12、91725陽(yáng)山書(shū)屋色譜條件篩選圖2色譜柱：Agilent XDB-C18柱（4.6150 mm，5m）流動(dòng)相：乙腈-水 (40：60)柱溫：40流速：1.0 mlmin-126陽(yáng)山書(shū)屋色譜條件篩選圖3色譜柱：Agilent XDB-C18柱（4.6150 mm，5m）流動(dòng)相：乙腈-水 (40：60)柱溫：40流速：0.9 mlmin-127陽(yáng)山書(shū)屋色譜條件篩選圖4色譜柱：Agilent XDB-C18柱（4.6150 mm，5 m）流動(dòng)相：乙腈-水 (40：60)柱溫：40流速：0.9 mlmin-128陽(yáng)山書(shū)屋色譜條件篩選圖5色譜柱：Agilent XDB-C18柱（4.6150 mm，5m

13、）流動(dòng)相：乙腈-水 (32：68)柱溫：40流速：1.0 mlmin-129陽(yáng)山書(shū)屋色譜條件篩選圖6色譜柱：Agilent XDB-C18柱（4.6150 mm，5 m）流動(dòng)相：乙腈-水 (32：68)柱溫：40流速：1.0 mlmin-130陽(yáng)山書(shū)屋色譜條件篩選圖7色譜柱：Dikma DiamonsilTM（鉆石）C18柱(4.6250 mm,5 m)流動(dòng)相：乙腈-水 (40：60)柱溫：40流速：1.0 mlmin-1前延峰31陽(yáng)山書(shū)屋色譜條件選擇情況匯總表制表人：馬軍 日期：2005.11.20色譜柱流動(dòng)相不同流速（mlmin-1）下的對(duì)照品溶液色譜峰分離情況不同流速（mlmin-1）下

14、的供試品溶液色譜峰分離情況0.91.01.20.91.01.2Agilent XDB-C18柱（4.6150 mm，5 m）乙腈-水 (40：60)峰形對(duì)稱(chēng)；目標(biāo)峰與相鄰峰分離度大于1.5，保留時(shí)間適中峰形對(duì)稱(chēng)；目標(biāo)峰與相鄰峰分離度大于1.5，保留時(shí)間適中Dikma DiamonsilTM（鉆石）C18柱（4.6250 mm，5 m）乙腈-水 (40：60)峰形對(duì)稱(chēng)；目標(biāo)峰與相鄰峰分離度大于1.5，tR10min峰形對(duì)稱(chēng)；目標(biāo)峰與相鄰峰分離度大于1.5，tR10minAgilent XDB-C18柱（4.6150 mm，5 m）乙腈-水 (32：68)峰形對(duì)稱(chēng)；目標(biāo)峰與相鄰峰分離度大于1.5，

15、tR10min峰形對(duì)稱(chēng)；目標(biāo)峰與相鄰峰分離度大于1.5，tR10minDikma DiamonsilTM（鉆石）C18柱（4.6250 mm，5 m）乙腈-水 (32：68)峰形較對(duì)稱(chēng)；目標(biāo)峰與相鄰峰分離度大于1.5，tR10min峰形較對(duì)稱(chēng)；目標(biāo)峰與相鄰峰分離度大于1.5，tR10min32陽(yáng)山書(shū)屋 因此，可以選擇Agilent XDB-C18柱（4.6150 mm，5 m）、以乙腈-水 (32：68)為流動(dòng)相，流速為1.0 mlmin-1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。33陽(yáng)山書(shū)屋實(shí)施二：供試品前處理方法的選擇1.供試品溶液的制備精密量取本品10ml，置分液漏斗中，加水10ml，搖勻，用水飽和的正丁醇振搖提

16、取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次20ml，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)铀?ml使溶解，放冷，通過(guò)D101型大孔吸附樹(shù)脂柱，以水50ml洗脫，棄去水液，再用A乙醇30ml洗脫，棄去洗脫液，繼用B乙醇50ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得。34陽(yáng)山書(shū)屋2.提取分離條件的確定收集上述水液和各擬棄去的乙醇洗脫液，蒸干，加甲醇適量使溶解，得溶液C按照上述色譜條件分別進(jìn)樣20 l，記錄色譜峰面積。35陽(yáng)山書(shū)屋各擬棄去的乙醇洗脫液蒸干，加甲醇適量使溶解，得溶液C水液30%40%50%60%70%80%95%黃芪甲苷峰檢

17、出情況未檢出未檢出檢出量較小檢出量較大檢出量最大未檢出未檢出未檢出制表人:盧晶晶 日期:2005.12.1036陽(yáng)山書(shū)屋試驗(yàn)結(jié)果表明：（1）棄去的水液中目標(biāo)物無(wú)損失；（2）當(dāng)A=40，即采用40%乙醇洗脫時(shí)，目標(biāo)物有損失；（3）當(dāng)B=60，即繼續(xù)采用60%乙醇洗脫時(shí)，則目標(biāo)物洗脫不完全。因此確定A%、B%的最佳值分別為：30%、70%，并以此值確定的提取分離條件進(jìn)行后續(xù)方法學(xué)的驗(yàn)證。37陽(yáng)山書(shū)屋實(shí)施三：線性關(guān)系的確定取黃芪甲苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解并稀釋至8個(gè)系列濃度, 分別進(jìn)樣10 l，測(cè)定峰面積，以對(duì)照品濃度X(mgml-1)的lg值為橫坐標(biāo)，峰面積積分值Y的lg值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得

18、回歸方程： Y=0.1819X+1.9515 r=0.999238陽(yáng)山書(shū)屋工作曲線評(píng)價(jià)：結(jié)果表明黃芪甲苷在76.560255.20 gml-1 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。39陽(yáng)山書(shū)屋實(shí)施四：精密度試驗(yàn)取同一供試品溶液，在上述色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，每次10 l，測(cè)得黃芪甲苷色譜峰峰面積平均值為978.57883，RSD為0.5%。40陽(yáng)山書(shū)屋制表人：祖若玉 日期：2006.2.7進(jìn)樣次數(shù)峰面積峰面積平均值RSD（%）1977.09442978.578830.52980.079413975.409004986.095835976.362926976.4314041陽(yáng)山書(shū)屋繪圖人：祖若玉 日期：2006

19、.2.7評(píng)價(jià)：精密度良好，達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。42陽(yáng)山書(shū)屋實(shí)施五：重復(fù)性試驗(yàn)取同一批號(hào)樣品，制備6份供試品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液10l、20l，供試品溶液10l，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積值，以外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程計(jì)算，即得黃芪甲苷的含量。43陽(yáng)山書(shū)屋重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)次數(shù)含量（mgml-1）含量平均值（mgml-1）RSD（%）10.1234380.1223571.20.12196820.1233660.12376830.1238620.12227040.1211760.12373450.1211650.11947860.1209460.123113制表人：張集盤(pán) 日期：2006.2.1444

20、陽(yáng)山書(shū)屋 繪圖人：張集盤(pán) 日期：2006.2.14評(píng)價(jià)：重復(fù)性試驗(yàn)RSD為1.2%，達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。 45陽(yáng)山書(shū)屋實(shí)施六：穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液，于0、2、4、6、12、14 h分別精密吸取10 l注入液相色譜儀分析，測(cè)得峰面積值，計(jì)算RSD。 46陽(yáng)山書(shū)屋穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)樣時(shí)間（h）峰面積峰面積平均值RSD（%）01071.514771069.388771.821064.4517841077.6015661053.73657121098.48413141043.48083制表人：盧晶晶 日期：2006.2.2047陽(yáng)山書(shū)屋繪圖人：盧晶晶 日期：2006.2.20 評(píng)價(jià)：上述結(jié)果表明供試品溶

21、液在14 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。48陽(yáng)山書(shū)屋實(shí)施七：方法回收率試驗(yàn) 精密吸取已知含量同一批號(hào)樣品5 ml，6份，分別精密加入已知濃度的對(duì)照品溶液5 ml，制備溶液，分別進(jìn)樣10 l，測(cè)得峰面積值， 計(jì)算平均回收率和RSD。49陽(yáng)山書(shū)屋回收率測(cè)定結(jié)果（n = 6）取樣量（ml）樣品含量（mg）加入量（mg）測(cè)得量（mg）回收率（%）平均值（%）RSD（%）50.8219550.52701.3168893.9196.761.911.3248795.4350.8219550.52701.3455599.351.3418698.6550.8219550.52701.3305796.511.3396498.2

22、350.8219550.52701.3352697.401.3371497.7650.8219550.52701.3218994.861.3219794.8850.8219550.52701.3432198.911.3241195.29制表人：張集盤(pán) 日期：2006.2.2650陽(yáng)山書(shū)屋評(píng)價(jià)：平均回收率為96.76%，RSD為1.91%，表明方法準(zhǔn)確度良好，可以用于本品的定量分析。51陽(yáng)山書(shū)屋評(píng)價(jià)1.初步評(píng)價(jià)建立了黃芪精中黃芪甲苷含量測(cè)定的新方法，方法學(xué)研究符合中國(guó)藥典2005年版（一部）附錄“中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”。52陽(yáng)山書(shū)屋2.綜合評(píng)價(jià) 取本品3批，將兩法的含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行對(duì)

23、比。53陽(yáng)山書(shū)屋批號(hào)含 量（mgml-1）相對(duì)平均偏差（%）TLCS法平均值HPLC-ELSD法平均值TLCS法HPLC-ELSD法060313010.133960.1393240.1304560.1352832.60.70.1332480.127400.1381040.139324060314010.152920.1585610.1441870.1512221.91.20.1442410.147310.1578980.158561060315010.148710.1541390.1454340.1496721.80.70.1460540.143720.1530620.15413954陽(yáng)山書(shū)屋

24、繪圖人：陸莉娟 日期：2006.3.955陽(yáng)山書(shū)屋評(píng)價(jià)：采用HPLC- ELSD法測(cè)定黃芪精中黃芪甲苷含量比采用TLCS法測(cè)定時(shí)的相對(duì)平均偏差小，測(cè)定的結(jié)果較理想。56陽(yáng)山書(shū)屋八.效果檢查1.效果驗(yàn)證取不同批號(hào)的黃芪精，依法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣10 l，測(cè)得峰面積值，并計(jì)算黃芪甲苷含量。10批樣品含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)下表。57陽(yáng)山書(shū)屋10批樣品含量測(cè)定結(jié)果（n = 4） 批號(hào)含量（mgml-1）含量平均值（mgml-1）相對(duì)平均偏差（%）060102010.1573570.1586401.10.1565360.1602440.160424060120010.1554750.15556

25、60.60.1556130.1539920.157184060202010.1634490.1643911.40.1611400.1659520.16702358陽(yáng)山書(shū)屋批號(hào)含量（mgml-1）含量平均值（mgml-1）相對(duì)平均偏差（%）060203010.1523720.1525030.50.1513820.1527150.153544060204010.1433190.1428430.80.1435370.1405860.143930060204020.1326390.1327960.40.1321470.1335680.13282859陽(yáng)山書(shū)屋批號(hào)含量（mgml-1）含量平均值（mgml-1）相對(duì)平均偏差（%）060205010.1