010實驗六細胞融合及血紅細胞通透性

1、細胞融合紅細胞膜滲透性觀察細胞融合（cell fusion）又稱細胞雜交（cell hybridization），是指兩個或兩個以上的細胞融合成一個細胞的現(xiàn)象。此雜交細胞具有很強的生命力，增殖旺盛。細胞融合術是細胞遺傳學、細胞免疫學、病毒學、腫瘤學等研究的一重要手段，也是制備單克隆細胞株的重要技術。 細胞融合在誘導物（如仙臺病毒，聚乙二醇）作用下，相互融合的細胞發(fā)生凝集，隨后在質膜接觸處發(fā)生質膜成份的一系列變化，主要是某些化學鍵的斷裂與重排，最后打通兩質膜，形成雙核或多核細胞（此時稱同核體或異核體）。一、實驗原理病毒是最早采用的融合劑。常用于誘導動物細胞融合的病毒有仙臺病毒、新城雞瘟病毒、皰疹

2、病毒等，其中仙臺病毒最常用。用作融合劑的病毒必須事先用紫外線或-丙內酯滅活，使病毒的感染活性喪失而保留病毒的融合活性。優(yōu)點：融合率較高，對各種動物細胞都適宜，且仙臺病毒能在雞胚中大量繁殖，容易培養(yǎng)；缺點：仙臺病毒不穩(wěn)定，在保存過程中融合活性會降低，并且制備過程比較煩瑣。此外，病毒引進細胞后，可能會對細胞的生命活動產生干擾。病毒誘導融合在不同種類的動物細胞混合液中加入聚乙二醇，就會發(fā)生細胞凝集作用；聚乙二醇誘導細胞融合的機理，目前還不太清楚。聚乙二醇是化學試劑，使用起來很方便，誘導細胞融合的頻率比較高，但是它有一定毒性，對有些細胞(如卵細胞)不適用。聚乙二醇PEG誘導融合20世紀80年代建立起來

3、的電融合技術，是將兩種細胞的混合液置于低壓交流電場中，使細胞聚集成串珠狀，然后施加高壓電脈沖，以促使細胞融合。緊密排列的細胞，當受到電擊時，這個區(qū)域就會被擊穿，產生脂雙層膜孔，導致細胞之間的細胞質連通，進而發(fā)生細胞融合。電融合技術有許多優(yōu)點，如誘導細胞融合的頻率高，對細胞無毒害作用，操作簡便，可重復性好。 電融合電融合儀1. 器具: 顯微鏡 離心機 天平 離心管 細滴管 載片、蓋片2. 試劑: 50%聚乙二醇(PEG)：稱取一定量的PEG(MW=4000)放入刻度試管，在酒精燈火或沸水中加熱溶化。待冷至50時，加入等體積并預熱至50的GKN液混勻。Alsver液：葡萄糖2.05g 檸檬酸鈉0.

4、8g NaCl 0.42g，加重蒸水至100ml。GKN 液：NaCl 8g，KCl 0.4g，Na2HPO4.2H2O 1.77g，NaH2PO4.2H2O 0.69g，葡萄糖2g，酚紅0.01g，溶于1000ml重蒸水中。0.85%NaCl液二、實驗用品三、實驗內容及方法1.用注射器取2ml Alsver液，再從翼下靜脈取鴨血2ml，注入管內，再加6ml Alsver液，混勻后置4冰箱中可備作3-4用。2. 實驗時取“1”液1ml于離心管中，加入4ml 0.85%的NaCl液，混勻平衡后以1200rpm(revolution per minute) /min離心5分鐘。3. 去上清液。再重

5、復“2”兩次，最后一次離心10分鐘。4. 在沉降血球中加入1mlGKN液，混勻使之成為細胞懸液。5. 在“4”液中加入68滴（約0.5ml）50%的PEG液，迅速混勻，常溫下23min滴片鏡檢。四、結果觀察 在高倍鏡下可以看到有兩個或兩個以上的鴨血細胞膜融合在一起，形成一個異核體細胞。要注意辨別融合細胞與重疊的鴨血細胞。五、融合率的計算 在高倍鏡下隨機計數(shù)200個細胞(包括融合的與未融合的細胞)，以融合細胞(含兩個或兩個以上的細胞核的細胞)的細胞核數(shù)除以總細胞核數(shù)(包括融合與未融合的細胞核)即得出融合率。作業(yè)：描述顯微鏡下細胞融合的變化，計算融合率。細胞膜是細胞與外界環(huán)境進行物質交換的結構，它

6、可選擇性地讓某些物質進出細胞。而對于不同性質的物質，細胞膜的通透性是大不一樣的。當細胞與所處的環(huán)境存在滲透壓差別時，水分子可從滲透壓低的一側向高的一側擴散，以至于在高滲環(huán)境中，細胞會失水而皺縮；而在低滲環(huán)境中，細胞會吸水膨脹直至破裂。紅細胞膜滲透性觀察一、實驗原理二、實驗內容兔紅細胞滲透壓的觀察1.取一小燒杯，用肝素液（1mg/ml生理鹽水）濕潤， 然后加入兔血，以10倍生理鹽水稀釋，制成兔血細 胞懸浮液.2.取5支試管，編碼后依次向各試管加入1.5%NaCl液 5,3,2,1,0 ml,然后分別加入蒸餾水，使每管總體積 達到5ml，配成一濃度梯度的NaCl液。3.向每一試管加入0.5ml兔紅細胞懸浮液，混勻。試管編號實驗項目1.5% NaCl（ml） 5 3 2 1