蛋白質(zhì)分子特殊運動折疊

1、關(guān)于蛋白質(zhì)分子的特殊運動折疊第一張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月分子生物學(xué)中心法則 蛋白質(zhì)折疊問題又被稱為第二遺傳密碼第二張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月給定一序列，它將怎樣折疊成其特定結(jié)構(gòu)？9 蛋白質(zhì)的折疊第三張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質(zhì)折疊研究的理論意義幾乎所有的生命活動都是由蛋白質(zhì)完成的而蛋白質(zhì)鏈只有折疊成天然結(jié)構(gòu)才有活性 生命從蛋白質(zhì)折疊開始！第四張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質(zhì)折疊研究的應(yīng)用意義蛋白質(zhì)工程的醫(yī)藥保健產(chǎn)品市場每年數(shù)十億美元已知二十多種疾病與蛋白質(zhì)的錯誤折疊有關(guān) （老年癡呆癥、瘋牛病等）蛋白質(zhì)折疊還是蛋白質(zhì)組研究的瓶

2、頸之一第五張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月Prion疾病第六張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月Amyloidosis淀粉樣變性病Attributed to Frerichs, 1862Amyloid淀粉狀蛋白 1854 Rudolph Virchow第七張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月有關(guān)蛋白質(zhì)折疊的幾項重要研究1930s 吳憲指出蛋白質(zhì)變性是肽鏈的構(gòu)象變化而非共價鍵變化1960s C. Anfinsen 發(fā)現(xiàn)還原態(tài)RNase A，在除去還原劑和變性劑后能夠自動氧化恢復(fù)活性，提出蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)是其熱力學(xué)最穩(wěn)態(tài)1960s人工合成牛胰島素1940s L. Paulin

3、g在蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)解出之前，根據(jù)物理化學(xué)原理預(yù)測了蛋白質(zhì)螺旋和折迭結(jié)構(gòu)Nobel Prize, 1973第八張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月變性條件1.溫度2.pH3.鹽4.變性劑有機溶劑脲鹽酸胍去垢劑尿素：碳酸(全)酰胺O=C(NH2)28M胍：HN=C(NH2)26M第九張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月Native Protein Denatured第十張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月變性原理破壞次級鍵不破壞共價鍵溫度：較高時導(dǎo)致蛋白質(zhì)交聯(lián)聚沉，凝固，不可逆pH ：破壞鹽鍵，影響解離，改變相互作用的性質(zhì)鹽：活度，溶解度脲：競爭氫鍵第十一張，PPT共七十一頁，創(chuàng)

4、作于2022年6月蛋白質(zhì)的功能決定于它們的天然構(gòu)象，因而過去研究工作集中在蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象上，而對變性態(tài)沒有給予足夠重視。近來，人們已知道蛋白質(zhì)的非天然構(gòu)象至少在以下三方面有重要作用：1、蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定性2、蛋白質(zhì)的跨膜運輸3、蛋白質(zhì)的水解和更新第十二張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月小分子蛋白質(zhì)去折疊轉(zhuǎn)變是可逆的。在周圍環(huán)境的誘導(dǎo)下，小分子蛋白質(zhì)發(fā)生去折疊，當(dāng)將環(huán)境刺激因素去掉后，去折疊的蛋白質(zhì)又可以在折疊。第十三張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第十四張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第十五張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月一、問題的提出蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)是

5、由什么決定的？蛋白質(zhì)如何由一級結(jié)構(gòu)形成高級結(jié)構(gòu)？如何由一級結(jié)構(gòu)預(yù)測三級結(jié)構(gòu)？上述提法實際上要解決相同的問題分子內(nèi)、分子間的相互作用折疊過程中是否存在中間態(tài)第十六張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 絕大多數(shù)的小蛋白質(zhì)的去折疊與再折疊是可逆的 “一級結(jié)構(gòu)不僅為空間結(jié)構(gòu)編碼，而且以某種方式規(guī)定指導(dǎo)著達(dá)到這種空間結(jié)構(gòu)所經(jīng)歷的途徑”蛋白質(zhì)折疊的密碼立體化學(xué)密碼第二密碼。 折疊密碼的復(fù)雜性：序列相近的蛋白取相同的空間結(jié)構(gòu)；序列相同的肽段可以取不同的二級結(jié)構(gòu)。第十七張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月兩個主要的考慮方向熱力學(xué)條件動力學(xué)條件化學(xué)反應(yīng)觀點；相變觀點第十八張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于

6、2022年6月Milestone第十九張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 Anfinsen 對 Ribonuclease 的研究提出了蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu)的假說。Anfinsens work, 1957-63: formation of native disulfide bonds in ribonuclease A and other proteins. Key discovery: the information needed for folding is contained in the amino acid sequence.第二十張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6

7、月二、 蛋白質(zhì)折疊的熱力學(xué)考慮Anfinsen的經(jīng)典熱力學(xué)假說： Anfinsen認(rèn)為天然蛋白質(zhì)多肽鏈所采取的構(gòu)象是在一定環(huán)境條件下（如溶液組分、pH、溫度、離子強度等），整個系統(tǒng)的總Gibbs自由能取最低，所以處于變性狀態(tài)的多肽鏈能夠在這樣的環(huán)境下自發(fā)折疊成天然構(gòu)象。第二十一張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月Anfinsen實驗變性蛋白的復(fù)性實驗從二硫鍵入手, 提出假設(shè), 實驗驗證其正確性:材料: 牛胰核糖核酸酶含4對二硫鍵26-8440-9558-11065-72-S-S-交聯(lián)方式: 7x5x3x1=105種,天然只占其中一種第二十二張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月牛胰核

8、糖核酸酶第二十三張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月Anfinsen實驗?zāi)Ｐ?：空間障礙，只允許一種構(gòu)象（二硫鍵配對）模型2：生物合成的結(jié)果模型3：先形成了熱力學(xué)穩(wěn)定構(gòu)象，然后形成二硫鍵加固實驗否定了前兩種假設(shè)，肯定了第三種第二十四張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月Anfinsen實驗實驗一：1. 脲變性。RNAase + 8M脲 + 巰基乙醇脲使得肽鏈展開，酶失活2. 透析除脲和巰基乙醇，3. pH8弱堿性條件，溶液暴露于空氣中，重新氧化復(fù)性，酶活力重新獲得第二十五張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月巰基乙醇第二十六張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月脲變性過量巰基

9、乙醇導(dǎo)致還原第二十七張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月Anfinsen實驗實驗二1. 脲變性。RNAase + 8M脲 + 巰基乙醇脲使得肽鏈展開，酶失活2. 透析除巰基乙醇，然后通O2，再透析除脲結(jié)果：酶活性恢復(fù)到0.01第二十八張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月錯配的二硫鍵只需要加一點點巰基乙醇就可復(fù)性第二十九張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月Anfinsen實驗1. 由實驗一可知，模型（生物合成的結(jié)果）不成立，因為離體條件下復(fù)性的蛋白具有全部酶活性（后來又有實驗證明體外解折疊是完全的，全人工合成）2. 由實驗二可知，模型（空間障礙，只允許一種構(gòu)象（二硫鍵配對）不成

10、立，否則，復(fù)性的蛋白應(yīng)該具有幾乎全部酶活性3. 模型（先形成了熱力學(xué)穩(wěn)定構(gòu)象，然后形成二硫鍵加固）能夠解釋 both 結(jié)果。結(jié)論：蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)決定三級結(jié)構(gòu)形成三級結(jié)構(gòu)所需要的所有信息包含在一級結(jié)構(gòu)中。第三十張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月Anfinsen實驗Anfinsen實驗的啟示：1. 成功需要一點點運氣（簡單的單結(jié)構(gòu)域蛋白）2. 抓住主要矛盾，善于洞察問題的本質(zhì)3. 嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐评聿皇堑玫秸_結(jié)論的必要條件正確的前提正確的推導(dǎo)正確的結(jié)論正確的前提錯誤的推導(dǎo)正確或錯誤的結(jié)論錯誤的前提正確的推導(dǎo)錯誤的結(jié)論（大概率）錯誤的前提錯誤的推導(dǎo)正確或錯誤的結(jié)論Model 1 and 2 都有實

11、驗支持第三十一張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月同時代取得的其它一些結(jié)果折疊是以結(jié)構(gòu)域為單位進(jìn)行的。 ribonuclease A 去除 5 C-末端殘基后, 蛋白質(zhì)就喪失了正確形成二硫鍵的能力。 (H. Taniuchi, J. Biol. Chem. 245, 5459-5468; 1970) 含有兩個或多個結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，相鄰結(jié)構(gòu)域的解折疊是近似相互獨立的。第三十二張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月Levinthal Paradox對一個100個氨基酸殘基的小蛋白質(zhì)鏈 假設(shè)：只有主鏈二面角和可以轉(zhuǎn)動 每個二面角只有3個可能值 則：總構(gòu)象數(shù)為 3200如果：每轉(zhuǎn)動一次時間為

12、10-15秒 則：歷遍所有構(gòu)象約需1072年 而：宇宙年齡為1.51010第三十三張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月三、 折疊的動力學(xué)考慮有無中間體？最低自由能構(gòu)象能否達(dá)到？折疊過程是怎樣的？第三十四張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月單一結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，不存在平衡中間態(tài)。兩態(tài)折疊第三十五張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月折疊中間態(tài)的發(fā)現(xiàn)首先在折疊、去折疊的早期動力學(xué)時(快速反應(yīng))中發(fā)現(xiàn)。(Cytochrome c: A. Ikai and C. Tanford, Nature 230, 100-102; 1971; ribonuclease A: T. Y. Tsong

13、, R.L. Baldwin and E.L. Elson, PNAS 68, 2712-2715; 1971)第三十六張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月折疊中間態(tài)?無輔基肌紅蛋白(Apo-Mb)變性圖（圓二色譜CD結(jié)果）第三十七張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月快速檢測蛋白質(zhì)折疊的方法第三十八張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月通過二硫鍵捕捉中間體捕獲二硫鍵碘乙酸抑制二硫鍵的生成，在不同的時間加入碘乙酸，得到二硫鍵數(shù)目不同，構(gòu)象不同的蛋白質(zhì)，然后利用柱層析分離第三十九張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月牛胰蛋白酶抑制劑的二硫鍵折疊途徑中間體限速第四十張，PPT共七

14、十一頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質(zhì)折疊過程的時間尺度第四十一張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月多肽鏈能夠采取的構(gòu)象個數(shù)是個天文數(shù)字， 平均每個Aa可以有10種構(gòu)象，100Aa的多肽鏈有10100種可能的構(gòu)象。從一個構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪粋€構(gòu)象所需最短時間1013s，則該蛋白嘗試所有的構(gòu)象的時間是1085s=1077y，而人們觀察到蛋白質(zhì)體內(nèi)、體外折疊的時間是10-110-3s. 結(jié)論：蛋白質(zhì)的折疊不是隨機嘗試所有可能的構(gòu)象直到遇到某個自由能最低的構(gòu)象，而是沿著某些確定的途徑進(jìn)行的。蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象未必是最低自由能的構(gòu)象，而是動力學(xué)途徑中所能得到的穩(wěn)定的構(gòu)象。Levinthal Paradox第

15、四十二張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月能量偏移限制了折疊過程中對不合理構(gòu)象的嘗試第四十三張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月對蛋白折疊過程的共識兩種過程成核：小蛋白多步：大蛋白，以結(jié)構(gòu)域為單位第四十四張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質(zhì)折疊的啟動疏水塌縮經(jīng)熔球中間態(tài) （molten globule state）二級結(jié)構(gòu)生成框架結(jié)構(gòu)模型特殊作用的啟動Disulfide bonds去折疊態(tài)中的殘留有序結(jié)構(gòu)第四十五張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十六張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月1、局部肽段形成一些構(gòu)象單元（螺旋、折疊和轉(zhuǎn)角等）Motifs三級結(jié)

16、構(gòu)； 2、肽鏈內(nèi)部的疏水作用引起一個塌陷過程，然后經(jīng)調(diào)整，形成不同層次的結(jié)構(gòu)。3、 “熔球態(tài)”的中間狀態(tài)。在熔球態(tài)中，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)已基本形成，蛋白質(zhì)的整體空間結(jié)構(gòu)也初具規(guī)模。在熔球態(tài)時，分子立體的結(jié)構(gòu)再作一些局部調(diào)整，最后形成正確的立體結(jié)構(gòu)第四十七張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質(zhì)折疊的現(xiàn)代研究從頭算(ab initio )預(yù)測1D-3D目標(biāo)：疏水表面埋藏最大，loop熵減最小設(shè)計新的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)構(gòu)象病的研究蛋白質(zhì)錯誤折疊產(chǎn)生淀粉樣纖維，導(dǎo)致構(gòu)象病， eg:Alzheimers and Parkinsons diseases (J.W. Kelly, Nature Struct

17、. Biol.9, 323-325; 2002).第四十八張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十九張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月折疊過程的動力學(xué)模擬動力學(xué)模擬能夠成功的再現(xiàn)折疊過程的細(xì)節(jié)，例如過渡態(tài)的結(jié)構(gòu)(D. Baker, Nature 405, 39-42; 2000)和折疊中間體 (C. Clementi, P.A. Jennings and J.N. Onuchic, PNAS 97, 5871-5876; 2000)第五十張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月Baker D.等認(rèn)為， 如果多肽鏈所采取的構(gòu)象中只有一個低自由能狀態(tài)，即天然構(gòu)象，則所有非天然構(gòu)象

18、多肽鏈將遵循經(jīng)典熱力學(xué)假說，由高能態(tài)向低能態(tài)轉(zhuǎn)變，最終形成天然構(gòu)象。 但有些蛋白，天然構(gòu)象也許并非是多肽鏈自由能最低的構(gòu)象或唯一的低能構(gòu)象，多肽鏈采取非天然的構(gòu)象也很穩(wěn)定，而這兩種構(gòu)象之間轉(zhuǎn)變需要克服很高勢壘而難以實現(xiàn)，那么蛋白質(zhì)在折疊過程中就會有兩種途徑的競爭，一種是正確折疊形成天然構(gòu)象，一種是錯誤折疊形成非天然構(gòu)象。蛋白質(zhì)之所以能夠形成正確的構(gòu)象，是由于一些因素在蛋白質(zhì)折疊的動力學(xué)過程中起驅(qū)動作用。第五十一張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月“輔助性組裝學(xué)說”相對于“自組裝”學(xué)說，認(rèn)為蛋白質(zhì)多肽鏈的正確折疊和組裝需要其他蛋白質(zhì)分子的幫助，分子伴侶與折疊酶一起，構(gòu)成了兩種重要的輔助折疊

19、分子。第五十二張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月折疊酶折疊酶催化蛋白質(zhì)折疊過程中共價鍵的異構(gòu)化，主要有有PDI和PPI。PPI，脯胺酰順反異構(gòu)酶PDI，二硫鍵異構(gòu)酶第五十三張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月四、分子伴侶（chaperone） 許多蛋白質(zhì)的多肽單體在離體條件下能折疊、組裝成具有生物學(xué)功能的聚合體，但在體內(nèi)絕大多數(shù)新生肽三維結(jié)構(gòu)的形成，需要一類稱為分子伴侶的輔助蛋白的存在。分子伴侶是能夠結(jié)合和穩(wěn)定另外一種蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定構(gòu)象，并能通過有控制的結(jié)合和釋放，促進(jìn)新生多肽的折疊、多聚體的裝配或降解及細(xì)胞器蛋白的跨膜運輸?shù)鹊囊活惖鞍住Ｔ趧游?、植物、?xì)菌內(nèi)廣泛分布和存在，其功能

20、是介導(dǎo)其它蛋白質(zhì)的折疊和裝配，而本身卻不是最終功能蛋白質(zhì)分子的組成部分。第五十四張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月定義一類在序列上沒有相關(guān)性但有共同功能的蛋白質(zhì)，它們在細(xì)胞內(nèi)幫助其他含多肽的結(jié)構(gòu)完成正確的組裝，而且在組裝完畢后與之分離，不構(gòu)成這些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)執(zhí)行功能時的組份.第五十五張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月分子伴侶的特征 從參與促進(jìn)一個反應(yīng)而本身不在最終產(chǎn)物中出現(xiàn)這一點來看，分子伴侶具有酶的特征。但從以下三方面來看，分子伴侶和酶很不同。1、分子伴侶對靶蛋白沒有高度專一性，同一分子伴侶可以促進(jìn)多種氨基酸序列完全不同的多肽鏈折疊成為空間結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能都不相關(guān)的蛋白質(zhì)。2、

21、它的催化效率很低。行使功能需要水解ATP，以改變其構(gòu)象，釋放底物，進(jìn)行再循環(huán)。3、它和肽鏈折疊的關(guān)系，是阻止錯誤折疊，而不是促進(jìn)正確折疊。4.多能性（脅迫保護(hù)防止交聯(lián)聚沉，轉(zhuǎn)運，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，組裝細(xì)胞骨架）5. 進(jìn)化保守性第五十六張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月分子伴侶的分類伴侶素家族 (Charperonin,Cpn)GroE(Hsp6 0 )家族和 Tric家族熱休克蛋白 70家族(Hsp70)熱休克蛋白 90家族(Hsp90)其它種類的分子伴侶應(yīng)激蛋白第五十七張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第五十八張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第五十九張，PPT共七十一頁，創(chuàng)作于2022年6月五、蛋白質(zhì)折疊/去折疊的實驗研究方法Fast/Ultra fast mixingStopped-flow, quench flow, continuous flow,.T-jumpelectrical-discharge-induce